柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程 編制說(shuō)明

1《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》起草單位：全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)柑桔研究所負(fù)責(zé)人：馮曉東聯(lián)系電話：010—59194524郵箱：njzxjyc@一、工作簡(jiǎn)況，包括任務(wù)來(lái)源、起草人員及其所在單位、起草過(guò)程等（一）任務(wù)來(lái)源根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2022年第三批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計(jì)劃的通知》（國(guó)標(biāo)39號(hào)）20221115-T-469項(xiàng)，由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)主持承擔(dān)《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程（GB/T28062-2011）》的修訂工作。（二）主要起草單位該標(biāo)準(zhǔn)修訂由全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心牽頭，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)柑桔研究所參與。（三）編寫(xiě)人員與分工標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心牽頭修訂。馮曉東作為首2席專(zhuān)家。標(biāo)準(zhǔn)制定過(guò)程主要由全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心牽頭，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)柑桔研究所3個(gè)單位人員參與。具體承擔(dān)的主要起草人員及任務(wù)分工見(jiàn)表1。表1主要起草人員信息及任務(wù)分工（四）主要工作過(guò)程任務(wù)下達(dá)后，首先成立編制工作小組，制定工作計(jì)劃、工作步驟等，專(zhuān)題研究和落實(shí)相關(guān)任務(wù)，并進(jìn)行具體工作分工。標(biāo)準(zhǔn)主持單位全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心長(zhǎng)期致力于檢疫標(biāo)準(zhǔn)化工作，已先后承擔(dān)制定了60余項(xiàng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員多年從事柑橘黃龍病的相關(guān)研究工作，積累了大量有關(guān)柑橘黃龍病檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步收集整理有關(guān)技術(shù)資料，并按標(biāo)準(zhǔn)的要求對(duì)搜集的有關(guān)資料進(jìn)行分類(lèi)編排與綜3合研究分析；同時(shí)，組織認(rèn)真學(xué)習(xí)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》等一系列有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)編制的文件，按照標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)的要求，綜合行業(yè)普遍做法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)制定工作，2023年8月完成《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》征求意見(jiàn)稿。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要內(nèi)容及其確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)格式，依據(jù)GB/T1.1—2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則要求進(jìn)行。柑橘黃龍病是柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性病害，柑橘黃龍病的檢疫檢驗(yàn)是黃龍病防控的重要組成部分，是阻斷黃龍病傳播的有效途徑和重要手段。為規(guī)范柑橘黃龍病檢疫檢驗(yàn)程序，農(nóng)業(yè)部于2011年制定了《柑桔黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》（GB28062-2011）。距該標(biāo)準(zhǔn)制定已過(guò)去11年，隨著柑橘黃龍病菌基因組的測(cè)序與公布，在黃龍病菌的PCR檢測(cè)上發(fā)現(xiàn)了更為特異且靈敏的檢測(cè)引物，可進(jìn)一步優(yōu)化黃龍病PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性與靈敏性。因此，有必要對(duì)《柑桔黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》進(jìn)行修訂重新發(fā)布。本標(biāo)準(zhǔn)的修訂重點(diǎn)考慮了各級(jí)植物檢疫機(jī)構(gòu)目前的基礎(chǔ)設(shè)施條件和人員技術(shù)水平，從柑橘黃龍病菌定量PCR檢測(cè)技術(shù)的準(zhǔn)確性、可操作性、實(shí)用性、針對(duì)性入手，使規(guī)程內(nèi)容更準(zhǔn)確、條理更清晰，更易于掌握和操作，適宜基層檢疫人員應(yīng)用，切實(shí)解決柑橘黃龍病檢疫檢驗(yàn)的實(shí)際問(wèn)題。本標(biāo)準(zhǔn)的語(yǔ)言表述規(guī)范，用語(yǔ)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)明，結(jié)構(gòu)嚴(yán)謹(jǐn)，布局合理，具有較強(qiáng)的科學(xué)性、實(shí)4用性和先進(jìn)性。（二）本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)包括范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)和定義、柑橘黃龍病基本信息、方法原理、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、主要儀器設(shè)備和試劑、取業(yè)部分）》等法律法規(guī)的規(guī)定，以及柑橘黃龍病基本信息及其PCR檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)流程、成果與檢測(cè)數(shù)據(jù)，包括取樣及樣品貯運(yùn)與保存、樣品DNA制備、PCR擴(kuò)增、質(zhì)控與結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（三）修訂的主要內(nèi)容本次修訂在《柑桔黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》（GB28062-2011）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了調(diào)整，主要有以下8個(gè)方面。1.全文將“柑桔”修改為“柑橘”。2.在范圍部分，將“柑桔黃龍病亞洲韌皮部桿菌”修改為“柑橘黃龍病病原韌皮部桿菌亞洲種”。修改“黃龍病亞洲韌皮部桿菌”為“韌皮部桿菌亞洲種”。3.在柑橘黃龍病基本信息部分，修改“亞洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌亞洲種”，修改“非洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌非洲種”，修改“美洲韌皮桿菌”為“韌皮部桿菌美洲種”。4.在取樣方法部分。對(duì)葉片樣品的采集根據(jù)癥狀進(jìn)行區(qū)分采樣，修改為“疑似病樹(shù)優(yōu)先采集疑似斑駁黃化癥狀的葉片，如無(wú)典型癥狀，按樹(shù)冠東南西北四方采集，每點(diǎn)取上中下部葉片各51片，每棵樹(shù)共采集葉片12張。”果實(shí)樣品中增加“橘絡(luò)”組織樣本。便于植物檢疫人員能更準(zhǔn)確地采集疑似黃龍病相關(guān)的樣品，從而提高檢測(cè)的有效性。5.在結(jié)果判定與表述部分。在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值從“應(yīng)<28.0”修改為“應(yīng)≤30.0”。對(duì)特殊情況樣本的判斷中建議“用在基因組中有5個(gè)拷貝的核苷酸還原酶基因引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR復(fù)測(cè)”，以進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。6.在附錄D柑桔黃龍病的癥狀鑒定部分，替換了部分黃龍病的癥狀圖片，刪除柑橘木虱模型圖替換為實(shí)物圖，同時(shí)補(bǔ)充對(duì)柑橘木虱的詳細(xì)描述，以便于植物檢疫人員能更準(zhǔn)確地采集黃龍病及柑橘木虱相關(guān)樣品。7.在附錄F檢測(cè)試劑配制及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)部分，將CQULasR03替換成特異性更高的HLBas-G/CLas-4G（5'TCGAGCGCGTATGCGAATACG-3'/5'AGTCGAGCGCGTATGCGAAT-3'）并增加熒光標(biāo)記探針HLBp（序列為5'-AGACGGGTGAGTAACGCG-3'以進(jìn)一步提高韌皮部桿菌亞洲種檢測(cè)的特異性。8.增加附錄G部分，增加靶標(biāo)韌皮部桿菌亞洲種核苷酸還原酶β基因（nrdB基因）的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，以用于復(fù)測(cè)基于16SrRNA基因引物HLBas-G/CLas-4G檢測(cè)時(shí)Ct值大于35但小于40的樣品。三、試驗(yàn)驗(yàn)證的分析、技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證以及預(yù)期效益6經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)論證，與原標(biāo)準(zhǔn)相比，修訂后的《柑橘黃龍病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》適用范圍更加明晰，取樣更為準(zhǔn)確，檢測(cè)的準(zhǔn)確性與靈敏性更優(yōu)。四、國(guó)際、國(guó)外同類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的對(duì)比情況目前尚無(wú)相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。五、以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)起草的情況、是否合規(guī)引用或者采用國(guó)際國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)六、與有關(guān)法律、行政法規(guī)和其他強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系，配套推薦性標(biāo)準(zhǔn)的制定情況本標(biāo)準(zhǔn)屬基礎(chǔ)性標(biāo)準(zhǔn)，是根據(jù)《植物檢疫條例》《植物檢疫條例實(shí)施細(xì)則（農(nóng)業(yè)部分）》等法律法規(guī)對(duì)農(nóng)