shRNA詳細原理及引物設(shè)計工程科技

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shRNA原理

shRNA克隆原理及引物設(shè)計

一．DNAoligo設(shè)計

1.來源：1）文獻報道（優(yōu)先考慮）

2）網(wǎng)站

利用網(wǎng)站供應(yīng)的軟件設(shè)計DNAoligo：

主要使用網(wǎng)站有3個,老師認為不同算法得到重合的序列比較牢靠,故三者應(yīng)綜合使用網(wǎng)站:

舉例：HEXIM1shRNA設(shè)計

A:siDirect

輸入accessionnumber,點”retrievesequence”,得到完整序列.或直接輸入序列

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設(shè)置只要將contiguoussequencestoavoid-A'sorT's選上,如圖下

點designsiRNA

結(jié)果:頁面一次只顯示100個堿基(如1-100),需要點擊所需段來查看

優(yōu)先選擇“Effective,Bothstrand”,但“Effective,Plusstrand”也可用顯示的序列23個堿基,應(yīng)去頭尾各2個,取中間19位堿基

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B:Dharmacon

輸入accessionnumber,step4中選blast,database選human點”designsiRNAs”

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結(jié)果:優(yōu)先選擇score高,mismatch為3或大于3,且不要化學(xué)修飾的序列

C:Ambion

序列可由SiDirect或其他位置粘貼過來,

設(shè)置中選中”4.Sequenceconstraintstoavoid:4ormoreA'sorT'sinarow”,點submit

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結(jié)果:本網(wǎng)站生成的序列全部以AA開頭,后19位為所要序列

最終結(jié)果

完全重合很難實現(xiàn),所以也接受小部分不重合.舉例:得到以下結(jié)果,

1.TTCAACAGCTGGGCAAGTTTAAG

1619

AACAGCTGGGCAAGTTTAAGG1622

MatchedbySiDirect,Dharmacon(1619)andAmbion(1622)

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然后任憑選擇一段,CAACAGCTGGGCAAGTTTA(起點1621)或CAGCTGGGCAAGTTTAAGG(1624)均可標注為”sh+基因+起點”如:shPRKD1-2616

注：由于所設(shè)計的每個oligo并不都具有knockdown效果，針對每個protein

設(shè)計oligo時，一般設(shè)計4-5個不同的oligo序列以便篩選。

2．shRNA設(shè)計model

shRNAdesignModel

A.NewpSUPER-BXandpSR-H1shRNAdesignmodel:BamHI-XhoIsite

shF:5’

3’

shR:5’

3’

Example:

shCdk2-85F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAAR:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

B.OldpSUPERshRNAdesignmodel:BglII-HindIIIsite

sh

sh

Example:

shCdk2-85F:GGTGGTGGCGCTTAAGAAAR:TTTCTTAAGCGCCACCACC

shCdk2-85

shCdk2-85

二．合成后DNAoligo的溶解

1）DNAoligo溶解前，13000rpm離心3min。（由于合成的DNAoligo為粉末狀態(tài)，且管內(nèi)處于真空狀態(tài)）

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2）用經(jīng)高壓滅菌后的ddH2O將DNAoligo定量至3μg/μl。ddH2O的體積(V/μl)=DNAoligo的質(zhì)量（mg）1000／3注：所取ddH2O的體積盡量精確?????。

3）常溫放置30min，使DNAoligo充分溶解。

三．DNAoligo的退火1）退火體系（50μl）正向DNAoligo（F）:1μl

反向DNAoligo（R）:1μl10退火B(yǎng)uffer：5μlddH2O：43μl

2）用石蠟?zāi)P管口封好。

3）將EP管放入事先煮沸的電磁鍋中，煮沸4min。

4）關(guān)閉電源，將電磁鍋放入泡沫箱中保溫。（為使溫度緩慢下降，以便正反向oligo充分退火）

5）待鍋中的水溫降至常溫，將EP管取出進行連接試驗或置于-20℃冰箱中保存。

四．pSR-H1載體的XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切1）酶切體系（50μl）

pSR-H1質(zhì)粒：5μgXhoⅠ（NEB）：2μlBamHⅠ（NEB）：2μlBamHⅠBuffer:5μlBSA(100):0.5μlddH2O:35.5μl

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2)混勻，用離心機將液體甩入管底。

3）37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)過夜（至少12h，否則可能酶切不完全）。

五．酶切產(chǎn)物的膠回收（GE膠回收試劑盒）1）電泳：配制1%的瓊脂糖凝膠，150V電泳45min.

2)切膠：用吸水紙將凝膠上的電泳液吸干，潔凈的刀片在紫外燈下切出目的條帶（膠塊盡可能?。?。

3）稱量：將切好的膠塊放入1.5ml的EP管中，稱其重量并做好標記。

4）溶膠：用槍頭將膠塊攪碎，按100mg加100μl的capturebuffertype2的比例向EP管中加入capturebuffertype2，于60℃水浴中放置10min，期間顛倒離心管3次使膠塊充分溶解。

5）離心：將溶膠液轉(zhuǎn)至事先預(yù)備好的柱子中，放置3min，6000rpm離心1min。

6)洗滌：向柱子中加入