蟲草益腎顆粒對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞megsin及p38MAPK信號(hào)通路影響的研究

蟲草益腎顆粒對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞megsin及p38MAPK信號(hào)通路影響的研究目的：基于三焦氣化理論益腎泄?jié)岱〝M蟲草益腎方制成蟲草益腎顆粒并觀察其對(duì)高糖培養(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞(humanglomerularmesangialcell,HMC)絲氨酸蛋白酶抑制劑serpinB7(megsin)及絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinasessignalpathway,p38MAPK)信號(hào)通路的影響,探討蟲草益腎顆粒對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法：將50只雄性wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組及福辛普利組5組,每組10只,每組大鼠灌胃給藥：蟲草益腎顆粒高、中、低劑量組中藥溶液0.972g/(kg·d).0.486g/(kg·d).0.243g/(kg·d)(含顆粒量),福辛普利0.9mg/(kg·d)水溶液,正常組等體積生理鹽水,連續(xù)給藥7天后根據(jù)血清藥理學(xué)方法制備動(dòng)物含藥血清。將常規(guī)培養(yǎng)的HMC分為6組并給與相應(yīng)處理：正常組(10%正常大鼠血清+RPMI-1640培養(yǎng)液)、高糖組(10%正常大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒高劑量組(10%蟲草益腎顆粒高劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒中劑量組(10%蟲草益腎顆粒中劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、蟲草益腎顆粒低劑量組(10%蟲草益腎顆粒低劑量組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液)、福辛普利組(10%福辛普利組大鼠血清+30mmol/LD-葡萄糖+RPMI-1640培養(yǎng)液),MTT法檢測(cè)24h、48h及72h細(xì)胞增殖情況,根據(jù)細(xì)胞增殖的差異性選取48h、72h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。于相應(yīng)因素干預(yù)作用后的48h、72h,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK(磷酸化絲裂原活化蛋白激酶)蛋白表達(dá)與分布,real-timePCR法檢測(cè)serpinB7mRNA.p38MAPKmRNA基因轉(zhuǎn)錄,采用westernblot法檢測(cè)megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)。結(jié)果：(1)MTT結(jié)果顯示：與正常培養(yǎng)環(huán)境相比,高糖(30mmol/LD-葡萄糖)環(huán)境可刺激HMC增殖(P<0.05,P<0.01)；24h、48h、72h時(shí),與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組大鼠含藥血清對(duì)HMC增殖均有抑制作用(P<0.05,P<0.01)；蟲草益腎顆粒高劑量組抑制效果優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)；(2)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：megsin與p38MAPK蛋白主要在HMC胞漿中表達(dá),p-p38MAPK蛋白在HMC胞核與胞漿中均有表達(dá)48h、72h時(shí),與正常組相比,高糖組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)均增加(P<0.01),與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組與福辛普利組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)均降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果明顯；(3)Real-timePCR結(jié)果顯示：在正常環(huán)境培養(yǎng)下,HMC中即有serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉(zhuǎn)錄48h、72h時(shí),與正常組較比,高糖組HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉(zhuǎn)錄明顯增加(P<0.01),與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉(zhuǎn)錄降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果明顯；72h時(shí),蟲草益腎顆粒高、中劑量組下調(diào)HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉(zhuǎn)錄作用優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)；(4)Westernblot結(jié)果顯示：在正常環(huán)境培養(yǎng)下,HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白均有表達(dá)48h、72h時(shí),與正常組相比,高糖組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與高糖組相比,蟲草益腎顆粒組及福辛普利組HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)均降低(P<0.05,P<0.01),且以蟲草益腎顆粒高劑量組降低效果最明顯(P<0.01)；觀察含藥血清對(duì)降低HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)作用方面,48h時(shí),蟲草益腎顆粒高劑量組優(yōu)于福辛普利組(P<0.05),72h時(shí),蟲草益腎顆粒高、中劑量組優(yōu)于福辛普利組(P<0.05)。結(jié)論：(1)蟲草益腎顆粒對(duì)高糖培養(yǎng)下HMC增殖具有抑制作用,且蟲草益腎顆粒抑制效果優(yōu)于福辛普利。(2)蟲草益腎顆?？梢种聘咛桥囵B(yǎng)下HMC增殖,其作用與下調(diào)HMC中serpinB7mRNA、p38MAPKmRNA基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。(3)蟲草益腎顆?？梢种聘咛桥囵B(yǎng)下HMC增殖,其作用與降低megsin、p38MAPK蛋白的表達(dá)、抑制p38MAPK磷酸化,從而抑制p38MAPK信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路有關(guān)。(4)