布比卡因致神經(jīng)元DNA損傷及相關(guān)修復(fù)通路激活的研究

布比卡因致神經(jīng)元DNA損傷及相關(guān)修復(fù)通路激活的研究神經(jīng)阻滯是一種局部鎮(zhèn)痛完全、操作簡便、對(duì)患者生命體征干擾小的麻醉方式,其不良反應(yīng)和并發(fā)癥遠(yuǎn)低于全身麻醉,因而廣泛應(yīng)用于臨床麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛治療等多個(gè)領(lǐng)域。神經(jīng)阻滯主要應(yīng)用局部麻醉藥(LocalAnesthetics,LA)通過阻斷神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)以達(dá)到阻滯效果,但其可引起神經(jīng)毒性反應(yīng),尤其局麻藥高濃度或長時(shí)間作用于周圍神經(jīng)時(shí),可引起神經(jīng)毒性損傷導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙,因而引起臨床工作者與研究學(xué)者們的高度重視。流行病學(xué)調(diào)查資料表明：30%脊麻后的病人可發(fā)生短暫神經(jīng)病學(xué)綜合征,而嚴(yán)重的神經(jīng)損傷并發(fā)癥如馬尾綜合征發(fā)生率可達(dá)1/8238-1/2834。國內(nèi)外學(xué)者雖對(duì)局麻藥引發(fā)神經(jīng)毒性進(jìn)行了大量研究,但其確切機(jī)制至今仍未闡明。局麻藥的種類、劑量、時(shí)間等可影響局麻藥的神經(jīng)毒性,作用機(jī)制可能與局麻藥影響細(xì)胞膜鈣離子通道、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與炎性反應(yīng)等相關(guān)。我們前期的研究結(jié)果表明：局麻藥可使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞ATP生成減少,激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)信號(hào)通路,引起ROS爆發(fā)性增多,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡；局麻藥尚可通過激活細(xì)胞膜表面的T型鈣離子通道,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載促進(jìn)細(xì)胞凋亡,引起神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷。此外,我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)局麻藥可致神經(jīng)腫瘤SH-SY5Y細(xì)胞DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡及壞死。DNA作為生物體最重要的遺傳物質(zhì),其穩(wěn)定性決定生物的生存和發(fā)展。但生物體本身基因的完整性容易受外在環(huán)境因素影響,輻射線的傷害或化學(xué)試劑的破壞均可造成DNA的雙鍵結(jié)構(gòu)斷裂造成損傷。氧化應(yīng)激是由內(nèi)、外源因素引起的細(xì)胞氧化性物質(zhì)的產(chǎn)生超過細(xì)胞內(nèi)抗氧化體系的負(fù)荷,打破了的細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境氧化/還原動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。有證據(jù)表明,氧化應(yīng)激/ROS是導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷的重要因素之一。我們前期研究也已證實(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)是局麻藥引起神經(jīng)細(xì)胞毒性的重要機(jī)制。因此,局麻藥也可能通過細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)造成神經(jīng)細(xì)胞的DNA損傷,由此引起神經(jīng)功能并發(fā)癥!由于危險(xiǎn)因素的種類和作用機(jī)制不同,DNA損傷的類型也是多種多樣,損傷后的DNA會(huì)啟動(dòng)相關(guān)的損傷修復(fù)信號(hào)通路。氧化應(yīng)激/ROS導(dǎo)致的細(xì)胞DNA的損傷主要是以氧化型堿基損傷居多,應(yīng)對(duì)針該這類氧化損傷主要是通過切除修復(fù)機(jī)制完成修復(fù),如：DNA堿基切除修復(fù)(BER)和核酸切除修復(fù)(NER)。我們前期研究顯示：局麻藥可使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的DNA損傷(堿性條件下彗星實(shí)驗(yàn)分析DNA損傷情況),損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞核酸切除修復(fù)通路中的XPD(xerodermapigmentosumcomplementationgroupD,著色性干皮病基因D)修復(fù)酶表達(dá)水平增加。而局麻藥造成的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷的類型可能有多種,損傷后修復(fù)亦有多種不同的修復(fù)通路參與；目前可能參與的修復(fù)通路有堿基切除修復(fù)(BER)、核酸切除修復(fù)(NER)、錯(cuò)配修復(fù)(mismatch)、重組修復(fù)(recombination)。局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后與上述修復(fù)通路關(guān)系如何及其修復(fù)能力的強(qiáng)弱?國內(nèi)外未見報(bào)道。藉此,我們行cDNA微孔板基因篩查和iTRAQ蛋白組學(xué)篩查,結(jié)果顯示：局麻布比卡因藥處理神經(jīng)細(xì)胞后,核酸切除修復(fù)酶XPD、堿基切除修復(fù)酶PARP1表達(dá)顯著性增高。由此推測,以上2條通路可能是局麻藥致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后的重要修復(fù)途徑。明確上述假設(shè),闡明該損傷后修復(fù)機(jī)制可為更精準(zhǔn)、有效防治局麻藥致神經(jīng)毒性損傷提供新的思路和靶點(diǎn)。為論證以上假說,該研究擬采用離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及在體動(dòng)物研究兩部分,采用多種分子生物學(xué)技術(shù),分別從以下四章進(jìn)行論述：第一章研究布比卡因致神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)和DNA損傷情況目的建立細(xì)胞和大鼠的布比卡因?qū)е律窠?jīng)毒性損傷和DNA損傷模型,探討布比卡因致神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)和DNA損傷情況方法1.細(xì)胞模型首先采用不同濃度的布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞,CCK-8檢測細(xì)胞活力計(jì)算布比卡因的IC50值,LDH檢測各組的細(xì)胞毒性情況,選取該IC50值作為后續(xù)細(xì)胞模型的濃度；應(yīng)用布比卡因的IC50值濃度處理SH-SY5Y細(xì)胞3小時(shí)后,換成正常培養(yǎng)基再孵育24小時(shí)作為損傷模型組,分別用Hochest-33258、TUNEL劑盒檢測細(xì)胞凋亡,JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化,DHE檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平,彗星實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的DNA損傷情況。Westernbolt測定凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值、cleave-caspase3表達(dá),DNA損傷標(biāo)志蛋白p-γH2ax表達(dá)。2.動(dòng)物模型我們選用SD大鼠鞘內(nèi)置管后,注射3%布比卡因作為動(dòng)物損傷模型;脊髓組織HE染色觀察神經(jīng)元病理改變；ELISA檢測氧化損傷產(chǎn)物丙二醛(MDA)與氧化DNA損傷指標(biāo)8羥基脫氧鳥苷(8-oxodG);TUNEL法和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-1/Bax比值檢測脊髓組織神經(jīng)元凋亡情況；Westernblot檢測各組大鼠脊髓組織DNA損傷指標(biāo)-yH2ax蛋白的磷酸化水平；通過大鼠足底光熱刺激潛伏期(PWTL)、機(jī)械痛縮足閾值(PWMT)檢測來說明動(dòng)物對(duì)熱痛、機(jī)械痛刺激的敏感程度；從行為學(xué)上判斷大鼠的脊髓神經(jīng)功能受損傷情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料以x±s來表示,我們采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,多重比較或兩兩比較采用LSD法(方差齊情況選用)或Dunnett’sT3法(方差不齊情況選用),組間比較則采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.細(xì)胞模型CCK-8法檢測布比卡因不同濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM)各組細(xì)胞活力結(jié)果顯示：不同濃度布比卡因處理細(xì)胞后,布比卡因的IC50值(半抑制濃度)=1.5mM;LDH試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,從Bup1.5mM濃度組開始細(xì)胞毒性明顯增高(*p<0.05),布比卡因的細(xì)胞毒性呈濃度依賴性；Hochest-33258、TUNEL檢測各組細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示：1.5mM布比卡因處理細(xì)胞后可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡比例增加(*p<0.05),凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值降低,凋亡蛋白cleave-caspase3表達(dá)增多(*p<0.05)；。JC-1檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位的變化,結(jié)果顯示：布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后可明顯降低細(xì)胞線粒體膜電位(*p<0.05),導(dǎo)致線粒體的損傷；布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后DHE陽性顯著性增高(*p<0.05),表示細(xì)胞內(nèi)ROS增加；彗星實(shí)驗(yàn)(cometassay)相關(guān)指標(biāo)(彗星尾距)增高(*p<0.05),yH2ax蛋白的磷酸化水平增多(*p<0.05)表示布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞后細(xì)胞DNA損傷明顯加重。2.動(dòng)物模型脊髓組織HE結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。6h組、12h組與24h組有部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、碎裂、溶解、變性、壞死或消失。24h組神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死數(shù)量顯著多于其他各組；各組脊髓組織的氧化損傷產(chǎn)物MDA結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,模型組MDA含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TUNEL檢測結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,模型組大鼠脊髓神經(jīng)元凋亡比例明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；脊髓組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/bax的表達(dá)量比值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);ELISA試劑盒檢測各組大鼠脊髓組織均漿上清中8-oxo-dG的含量結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,模型組8-oxo-dG含量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較,模型組脊髓組織yH2ax蛋白的磷酸化水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；行為學(xué)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較,模型組大鼠機(jī)械痛縮足閾值(PWMT)和大鼠足底光熱刺激潛伏期(PWTL)值均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論本章實(shí)驗(yàn)證實(shí)：布比卡因可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡比例增高,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增高,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高,線粒體膜電位改變,DNA損傷加重。第二章基因和蛋白組學(xué)篩查探討局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)元DNA損傷后其相關(guān)修復(fù)通路中關(guān)鍵修復(fù)酶的變化目的通過基因和蛋白組學(xué)篩查探討局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)元DNA損傷后其相關(guān)修復(fù)通路中關(guān)鍵修復(fù)酶的變化方法首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞SH-SY5Y毒性損傷模型,應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)做關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查；應(yīng)用iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)篩查局麻藥神經(jīng)損傷模型組(B組)與對(duì)照組(C組)之間差異蛋白,‘尤其是DNA損傷修復(fù)相關(guān)通路的蛋白表達(dá)差異情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料以x±s來表示,我們采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,多重比較或兩兩比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’sT3法(方差不齊),組間比較則采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果cDNA微孔板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因處理后差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)如下：DNA-PKcs、PTE、NTH1、RAD9、CSB、GADD45、XPD、XPC-HR23B、P53;分析得出,這些修復(fù)基因主要集中在以下3修復(fù)機(jī)制：1.堿基切除修復(fù)(Baseexcisionrepair);2.核酸切除修復(fù)(Nucleotideexcisionrepair);3.非同源重組修復(fù)(Non-homologousend-joining)。iTRAQ蛋白組學(xué)篩查結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷后被激活的損傷修復(fù)酶大多集中在堿基切除修復(fù)通路(po1δ、ploβ、PARP)和核酸切除修復(fù)通路(]HR23B、RFC、polδ、XPD)上。結(jié)論通過cDNA微孔板和iTRAQ蛋白組學(xué)篩查,我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后差異表達(dá)的修復(fù)蛋白主要集中在以下2條修復(fù)機(jī)制：1.堿基切除修復(fù)(Baseexcisionrepair);2.核酸切除修復(fù)(Nucleotideexcisionrepair)。第三章局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的表達(dá)驗(yàn)證目的基于上一章基因和蛋白組學(xué)篩查的結(jié)果,驗(yàn)證篩查得到的局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶)KPD、PARP-1的表達(dá)。方法1.細(xì)胞模型應(yīng)用1.5mM布比卡因處理SH—SY5Y細(xì)胞后觀察3h,6h,12h,24h不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)鍵DNA損傷修復(fù)基因(XPD、PARP-1)的mRNA和蛋白表達(dá)情況；Q-PCR驗(yàn)證布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y細(xì)胞DNA損傷模型中關(guān)鍵修復(fù)基因XPD、PARP-1的mRNA的表達(dá)情況;Westernblotting檢測布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y細(xì)胞DNA損傷模型中關(guān)鍵修復(fù)酶XPD、PARP-1的蛋白表達(dá)情況；2.動(dòng)物模型采用第一章節(jié)建立的大鼠鞘內(nèi)注射3%布比卡因24小時(shí)后取材為動(dòng)物損傷模型,Westernblotting檢測大鼠脊髓組織XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá)Westernblotting和免疫組化(IHC)檢測大鼠脊髓神經(jīng)DNA損傷模型中“關(guān)鍵修復(fù)酶”KPD、PARP-1的表達(dá)情況；統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料以x±s來表示,我們采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,多重比較或兩兩比較采用LSD法(方差齊)或Dunnett’sT3法(方差不齊),組間比較則采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.細(xì)胞模型qPCR檢測細(xì)胞XPD修復(fù)酶mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因處理后不同時(shí)間點(diǎn)XPD酶的mRNA表達(dá)均上升,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；qPCR檢測細(xì)胞PARP-1修復(fù)酶mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因處理后不同時(shí)間點(diǎn)PARP-1酶的mRNA表達(dá)均上升,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Westernblotting檢測細(xì)胞XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因處理后不同時(shí)間點(diǎn)XPD酶的蛋白表達(dá)均上升,但是3h時(shí)升高沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),其他時(shí)間點(diǎn)XPD蛋白表達(dá)升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P<0.05)；Westernblotting檢測細(xì)胞PARP-1修復(fù)酶的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較,布比卡因處理后3hPARP-1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),其他時(shí)間點(diǎn)PARP-1的蛋白表達(dá)均上升,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*P<0.05)。2.動(dòng)物模型Westernblotting檢測大鼠脊髓組織XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,損傷模型組大鼠脊髓組織中XPD蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)；檢測大鼠脊髓組織PARP-1修復(fù)酶的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,損傷模型組大鼠脊髓組織中PARP-1蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05);IHC檢測大鼠脊髓組織切片XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,損傷模型組大鼠脊髓組織中XPD蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)；檢測大鼠脊髓組織切片PARP-1修復(fù)酶的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,損傷模型組大鼠脊髓組織中PARP-1蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)結(jié)論布比卡因?qū)е律窠?jīng)元DNA損傷后會(huì)激活核酸切除修復(fù)通路(關(guān)鍵酶XPD)和堿基切除修復(fù)通路(關(guān)鍵酶PARP-1),該部分結(jié)果與cDNA微孔板和iTRAQ蛋白組學(xué)關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路的篩查結(jié)果一致。第四章局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的功能作用驗(yàn)證目的驗(yàn)證局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷模型中篩查出的修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的功能作用方法通過XPD低表達(dá)慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞并建立低表達(dá)XPD的SH-SY5Y細(xì)胞株;在GV211-RNAi慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞低表達(dá)XPD酶后,采用彗星實(shí)驗(yàn)和Westernblotting檢測的DNA損傷標(biāo)志性蛋白γ-H2ax磷酸化水平來評(píng)價(jià)該模型中細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況,LDH檢測該模型中細(xì)胞毒性情況,AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡比例,Westernblotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；在建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞毒性損傷的模型前,我們使用PARP-1抑制劑20nM-PJ34預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞,采用彗星實(shí)驗(yàn)和Westernblotting檢測的DNA損傷標(biāo)志性蛋白y-H2ax磷酸化水平來評(píng)價(jià)該模型中細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況；LDH檢測該模型中細(xì)胞毒性情況,AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡比例,Western