不結(jié)球白菜自交不親和相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄組分析

不結(jié)球白菜自交不親和相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄組分析不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino),原產(chǎn)中國,是一種重要的十字花科蔬菜。自交不親和性是顯花植物在長期的進(jìn)化過程中形成的一種避免自交,促進(jìn)異交的遺傳機制。利用自交不親和系進(jìn)行雜種生產(chǎn)是不結(jié)球白菜等十字花科蔬菜作物雜種優(yōu)勢利用的主要方式。同時,自交不親和系統(tǒng)還是研究植物細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理想模型。但自交不親和機理在很大程度上仍然是未知的。課題組前期鑒定了一個可能在不結(jié)球白菜自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的蛋白:衰老相關(guān)半胱氨酸蛋白酶(senescence-associatedcysteineprotease,SCP),命名為BcSCP,本研究通過構(gòu)建BcSCP的柱頭特異表達(dá)載體,研究了該基因?qū)ǚ勖劝l(fā)的影響;對不結(jié)球白菜授粉前及授粉后的柱頭進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析;對不結(jié)球白菜自交不親和性研究相關(guān)內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選;利用大白菜基因組信息,對BrPUB基因家族進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下:1.不結(jié)球白菜SCP基因的功能分析利用柱頭特異表達(dá)的SLR1(S-locusrelated-1)啟動子構(gòu)建了SCP基因的柱頭特異表達(dá)載體,酶切鑒定結(jié)果表明SCP載體構(gòu)建成功,采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株,通過花序侵染法將載體進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化,通過基因組PCR鑒定說明構(gòu)建的表達(dá)載體已成功插入擬南芥基因組中。激光共聚焦顯微鏡觀察柱頭發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在柱頭有強烈的表達(dá),T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥熒光顯微分析顯示在柱頭過量表達(dá)BcSCP對花粉管萌發(fā)和延伸無明顯影響。2.不結(jié)球白菜親和/不親和授粉早期轉(zhuǎn)錄組分析為了鑒定不結(jié)球白菜花粉-柱頭相互作用的關(guān)鍵基因,本研究以不結(jié)球白菜’矮腳黃,自交親和系及自交不親和系為材料,對親和授粉和不親和授粉10min后的柱頭進(jìn)行了測序,并將測序結(jié)果比對到大白菜基因組上。平均每個樣品獲得65.42百萬個原始標(biāo)簽序列,平均72.5%的序列能夠比對到白菜基因組。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩選得到511個差異表達(dá)基因,其中,493個基因上調(diào),18個基因下調(diào)。差異表達(dá)基因的功能注釋和代謝途徑分析表明親和反應(yīng)與不親和反應(yīng)涉及不同的通路。通過對不結(jié)球白菜自花及異花授粉早期轉(zhuǎn)錄組分析,為親和及自交不親和反應(yīng)的深入研究提供了豐富的資源。3.實時熒光定量PCR分析中不結(jié)球白菜花內(nèi)參基因的篩選和驗證本研究以不結(jié)球白菜自交親和系和自交不親和系為材料,系統(tǒng)性地分析了13個候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況。用兩個RT-qPCR分析軟件geNorm和NormFinder評估了候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性。研究顯示,內(nèi)參基因的選擇取決于樣品的特異性。在本研究中,當(dāng)分析所有樣品時DNAJ、UKN1和是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。CYP和ACP這兩個被廣泛應(yīng)用的內(nèi)參基因在本研究的大多數(shù)花組織樣品集中均被鑒定為最不穩(wěn)定。為了進(jìn)一步證明本研究得出的結(jié)論,我們分析了兩個在花粉-柱頭相互作用中扮演著重要角色的基因SRK和Exo70A1的表達(dá)情況。本研究系統(tǒng)地分析并篩選適用于自交不親和性研究的內(nèi)參基因,為我們進(jìn)一步在不結(jié)球白菜中研究自交不親和性機理奠定了基礎(chǔ)。4.基于全基因組的大白菜PUB基因家族鑒定與分析PUB(PlantU-box)基因一直都是挖掘自交不親和反應(yīng)關(guān)鍵基因的候選目標(biāo)。本研究對大白菜中的PUB基因進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究,從大白菜中鑒定到了101個BrPUB基因,并將它們錨定到大白菜的10條染色體和三個亞基因組上。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)合BrPUB基因的結(jié)構(gòu)域特點,將它們分為10組。我們選取了15個代表性物種,和大白菜一起對PUB基因的進(jìn)化做了初步分析。大白菜和擬南芥有22個直系同源基因?qū)?并且BrPUB基因的擴(kuò)增主要源于基因組三倍化事件。此外,利用大白菜的RNA-seq