生物工程下游技術(shù)

生物工程下游技術(shù)河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程系李冬目錄第一章：〔緒論〕…………3~25第二章：下游技術(shù)的理論根底…………26~42第三章：發(fā)酵液預(yù)處理……43~87第四章：微生物細(xì)胞的破碎………………88~122第五章：溶劑萃取和浸取………………123~167第六章：超臨界流體萃取………………168~213第七章：雙水相萃取技術(shù)………………214~250第八章：反膠團(tuán)萃取……251~287第九章：膜別離過(guò)程……288~353

第一章

〔緒論〕本章要求熟悉下游加工過(guò)程的重要性和特點(diǎn)了解下游加工技術(shù)的開(kāi)展過(guò)程掌握下游加工過(guò)程的主要步驟和主要單元操作一、下游加工過(guò)程在生物技術(shù)中的地位下游技術(shù)〔工程〕〔downstreamprocessing〕：對(duì)于由生物界自然產(chǎn)生的或由微生物菌體發(fā)酵的、動(dòng)植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的、酶反響等各種生物工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程獲得的生物原料，經(jīng)提取別離、加工并精制目的成分，最終使其成為產(chǎn)品的技術(shù)。下游加工過(guò)程的重要性?！步M成、費(fèi)用和關(guān)注程度〕①組成：下游加工過(guò)程是生物技術(shù)的重要組成局部，發(fā)酵液或反響液需要經(jīng)過(guò)下游加工過(guò)程才能成為成品；②費(fèi)用：傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中下游局部的費(fèi)用占整個(gè)工廠投資費(fèi)用的６０％，而對(duì)重組ＤＮＡ生產(chǎn)蛋白質(zhì)等基因工程產(chǎn)品，下游加工的費(fèi)用可占整個(gè)生產(chǎn)費(fèi)用的８０％－９０％；③關(guān)注程度：英國(guó)政府工業(yè)部于１９８３年發(fā)起生物別離方案〔ＢＩＯＳＥＰ〕，專門(mén)研究下游加工過(guò)程；１９８７年英國(guó)化學(xué)工業(yè)會(huì)召開(kāi)了專門(mén)討論下游加工過(guò)程的國(guó)際會(huì)議；我國(guó)也于１９８９年在濟(jì)南召開(kāi)了一次專門(mén)會(huì)議；近十年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)生物別離或蛋白質(zhì)純化的專著陸續(xù)出版。二、生物技術(shù)下游加工過(guò)程的特點(diǎn)含水多，產(chǎn)物含量低；含菌體蛋白；溶有原來(lái)培養(yǎng)基成分；相當(dāng)多的副產(chǎn)物和色素；易被雜菌污染或使產(chǎn)物進(jìn)一步分解；易起泡，粘性物質(zhì)多。1.發(fā)酵液的特點(diǎn)2.整個(gè)下游加工過(guò)程應(yīng)遵循以下四個(gè)原那么時(shí)間短；溫度低；pH適中〔選擇在生物物質(zhì)的溫度范圍內(nèi)〕；嚴(yán)格清洗消毒〔包括廠房、設(shè)備及管路，注意死角〕，這和傳統(tǒng)產(chǎn)品抗生素的生產(chǎn)是一致的。對(duì)基因工程產(chǎn)品還應(yīng)注意生物平安〔biosafety〕問(wèn)題，要防止菌體擴(kuò)散，一般要求在密封的環(huán)境下操作。三、生物工業(yè)下游技術(shù)的開(kāi)展歷程古代釀造業(yè)2.第一代生物技術(shù)古代釀造業(yè)包括釀酒、制醬〔油〕、醋、酸奶和干酪等。技術(shù)原始、家庭式作坊、產(chǎn)物根本不經(jīng)過(guò)后處理而直接使用，無(wú)下游技術(shù)。主要指19世紀(jì)60年代---20世紀(jì)40年代青霉素等抗生素出現(xiàn)之前的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵的本質(zhì)是微生物的作用，掌握了純種培養(yǎng)技術(shù)，生物技術(shù)進(jìn)入近代釀造產(chǎn)業(yè)的開(kāi)展階段。到20世紀(jì)上半葉，逐漸開(kāi)發(fā)形成了發(fā)酵法生產(chǎn)酒精、丙酮、丁醇等微生物發(fā)酵工業(yè)〔厭氧發(fā)酵〕，其產(chǎn)品相對(duì)簡(jiǎn)單，根本上是無(wú)活性的小分子。此時(shí)開(kāi)始引入過(guò)濾、蒸餾、精餾等近代別離技術(shù)。以20世紀(jì)40年代出現(xiàn)的青霉素產(chǎn)品為代表。無(wú)菌空氣制備技術(shù)、大型好氧發(fā)酵裝置開(kāi)發(fā)，一大批通風(fēng)發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)品相繼投入了工業(yè)生產(chǎn)，如抗生素〔鏈霉素〕、氨基酸〔谷氨酸〕、有機(jī)酸〔核酸、檸檬酸〕、酶制劑〔淀粉酶〕、微生物多糖和單細(xì)胞蛋白等。產(chǎn)品多樣性決定了別離方法的多樣性。借鑒和引進(jìn)吸收了大量的近代化學(xué)工業(yè)的別離技術(shù)，如沉淀、離子交換、萃取、結(jié)晶等。3.第二代生物技術(shù)以20世紀(jì)70年代末崛起的DNA重組技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)為代表。生物技術(shù)在其主要領(lǐng)域：基因工程、酶工程、細(xì)胞工程和微生物發(fā)酵工程取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，一批高附加值的產(chǎn)品開(kāi)始面世，如乙肝疫苗、干擾素等。80年代，發(fā)現(xiàn)了一大批生理功能性物質(zhì)，如活性糖質(zhì)、活性肽、高度不飽和脂肪酸等，生物技術(shù)在深度和廣度上都取得了很大的進(jìn)展。1988年，日本由40多家公司組建高度別離系統(tǒng)技術(shù)研究聯(lián)合體，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等組建了Biolink公司，加強(qiáng)在生物工業(yè)下游技術(shù)領(lǐng)域的研究開(kāi)發(fā)力量，不斷推出新技術(shù)、新產(chǎn)品、新裝備，以搶占更多的市場(chǎng)。新技術(shù)有超臨界CO2萃取技術(shù)、膜過(guò)濾、滲透蒸發(fā)技術(shù)、各種色譜〔層析〕技術(shù)等。4.第三代生物技術(shù)20世紀(jì)80年代以來(lái)，生物工業(yè)下游技術(shù)進(jìn)步很快，出現(xiàn)了很多新概念、新技術(shù)、新產(chǎn)品和新裝備。大致可分為以下幾大類：〔1〕固液別離技術(shù)〔2〕細(xì)胞破碎技術(shù)〔3〕初步別離純化技術(shù)〔4〕高度別離純化技術(shù)〔5〕其他新型別離技術(shù)近20年來(lái)，將在污水處理、化學(xué)工程和選礦工程上廣泛使用的絮凝技術(shù)引入到發(fā)酵液的預(yù)處理上，研究開(kāi)發(fā)了菌體及懸浮物絮凝技術(shù)，改善了發(fā)酵液的別離性能，加之纖維素助濾劑的開(kāi)發(fā)，大大提高了發(fā)酵液的固液別離效率。在固液別離機(jī)械方面，也出現(xiàn)了一些性能優(yōu)良的新型機(jī)械，如帶式過(guò)濾機(jī)、連續(xù)半連續(xù)板框過(guò)濾機(jī)、螺旋沉降式離心機(jī)等。微濾膜可高效別離細(xì)微的懸浮粒子。〔1〕固液別離技術(shù)〔2〕細(xì)胞破碎技術(shù)〔3〕初步別離純化技術(shù)〔4〕高度別離純化技術(shù)〔5〕其他新型別離技術(shù)已開(kāi)發(fā)出球磨破碎、壓力釋放破碎、冷凍加壓釋放破碎和化學(xué)破碎等技術(shù)。該技術(shù)的成熟使得胞內(nèi)生物物質(zhì)的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能?！?〕固液別離技術(shù)〔2〕細(xì)胞破碎技術(shù)〔3〕初步別離純化技術(shù)〔4〕高度別離純化技術(shù)〔5〕其他新型別離技術(shù)主要開(kāi)發(fā)了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術(shù)。較早出現(xiàn)的是酶及蛋白質(zhì)的鹽析法；有機(jī)溶劑沉淀法；雙水相萃取技術(shù)比較適合于胞內(nèi)活性物質(zhì)和細(xì)胞碎片的別離，為進(jìn)一步純化精制創(chuàng)造了前提；超濾技術(shù)解決了生物大分子對(duì)pH、熱、有機(jī)溶劑、金屬離子敏感等難題，在生物大分子的分級(jí)、濃縮、脫鹽等操作中得到了廣泛的使用?！?〕固液別離技術(shù)〔2〕細(xì)胞破碎技術(shù)〔3〕初步別離純化技術(shù)〔4〕高度別離純化技術(shù)〔5〕其他新型別離技術(shù)小分子物質(zhì)一般可通過(guò)離子交換、脫色和結(jié)晶、重結(jié)晶等方法獲得純度很高的產(chǎn)品。生物大分子的純化一直是個(gè)難題。20世紀(jì)70年代以來(lái)，逐漸開(kāi)發(fā)出各種色譜〔層析〕技術(shù)，如親和色譜、疏水色譜、離子交換色譜和凝膠色譜等，后兩種技術(shù)已開(kāi)始用于批量生產(chǎn)?！?〕固液別離技術(shù)〔2〕細(xì)胞破碎技術(shù)〔3〕初步別離純化技術(shù)〔4〕高度別離純化技術(shù)〔5〕其他新型別離技術(shù)超臨界CO2萃取技術(shù)在獲得天然生物物質(zhì)方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。20世紀(jì)80年代以來(lái)，已經(jīng)在許多領(lǐng)域中迅速實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取別離。介于反滲透和超濾之間的納米濾〔Nanofiltration〕技術(shù)，由于其能使水和大局部無(wú)機(jī)鹽通過(guò)而截留分子量300-1000u的小分子有機(jī)物，且操作壓力低，在生物工業(yè)和水處理中具有廣闊的應(yīng)用前景。滲透蒸發(fā)技術(shù)、液膜技術(shù)及反膠團(tuán)技術(shù)的研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)等也相繼取得了很大的進(jìn)展。四、生物技術(shù)下游加工過(guò)程的一般流程和單元操作培養(yǎng)液〔發(fā)酵液〕的預(yù)處理和固液別離；初步純化〔提取〕；高度純化〔精制〕；成品加工。1.一般下游加工過(guò)程可分為4個(gè)階段2.下游加工過(guò)程的一般流程（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過(guò)濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無(wú)菌過(guò)濾、干燥、成型）胞外產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。下游工藝過(guò)程決定于產(chǎn)品的性質(zhì)和要求到達(dá)的純度如產(chǎn)品為菌體本身，那么工藝比較簡(jiǎn)單，只需經(jīng)過(guò)濾、得到菌體，再經(jīng)枯燥就可，如單細(xì)胞蛋白的生產(chǎn)。如可以從發(fā)酵液直接提取，那么可省去固液別離步驟。如為胞外產(chǎn)物那么可省去細(xì)胞破碎步驟。3.單元操作過(guò)濾、離心——固液別離；蒸發(fā)、蒸餾、結(jié)晶——進(jìn)一步純化；萃取——濃縮或提取液相中的成分；離子交換、層析、膜技術(shù)、超濾；枯燥適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的傳統(tǒng)技術(shù)經(jīng)過(guò)改造提高后，適應(yīng)面更寬，效率會(huì)更高，仍然顯示出強(qiáng)勁的生命力。各種新型高效的過(guò)濾機(jī)械和離心機(jī)械的問(wèn)世，結(jié)晶理論和離子交換技術(shù)的新進(jìn)展，提高了產(chǎn)品的收率、質(zhì)量和生產(chǎn)效率。五、生物工業(yè)下游技術(shù)的開(kāi)展動(dòng)態(tài)——本錢(qián)、質(zhì)量、環(huán)保將是該技術(shù)開(kāi)展方向和動(dòng)力1.傳統(tǒng)別離技術(shù)的提高和完善1〕新型別離介質(zhì)的研究開(kāi)發(fā)2〕子代別離技術(shù)3〕其他新興下游技術(shù)2.新技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)膜〔膜材料和膜制造工藝〕、樹(shù)脂〔離子交換樹(shù)脂和大網(wǎng)格樹(shù)脂〕和凝膠〔瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，與各種配基結(jié)合后制成各種色譜別離介質(zhì)〕是目前主要的新型別離介質(zhì)。各種別離純化技術(shù)相互結(jié)合、交叉、滲透，形成子代別離技術(shù)。如膜技術(shù)和萃取、蒸餾、蒸發(fā)技術(shù)相結(jié)合形成了膜萃取技術(shù)、膜蒸餾及滲透蒸發(fā)技術(shù)；色譜技術(shù)與離子交換技術(shù)等結(jié)合形成了離子交換色譜、等電聚焦色譜等。由溶劑萃取技術(shù)衍生出一大批生物工業(yè)別離技術(shù)，如雙水相萃取、超臨界CO2萃取、反膠團(tuán)萃取〔細(xì)胞碎片去除、細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)、酶及蛋白質(zhì)、天然生物物質(zhì)的提取別離〕；菌體絮凝技術(shù)和菌體細(xì)胞破碎技術(shù)的進(jìn)展為工業(yè)化經(jīng)濟(jì)地別離菌體細(xì)胞和大規(guī)模生產(chǎn)胞內(nèi)物質(zhì)創(chuàng)造了技術(shù)前提。3.清潔生產(chǎn)清潔生產(chǎn)是指將綜合預(yù)防的環(huán)境保護(hù)策略持續(xù)應(yīng)用于生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品中，以期減少對(duì)人類和環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)。包括三方面內(nèi)容：〔1〕清潔生產(chǎn)工藝〔節(jié)約原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，無(wú)廢和少?gòu)U技術(shù)〕〔2〕清潔產(chǎn)品〔使用中和使用后對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害〕〔3〕清潔能源〔常規(guī)能源清潔利用、可再生能源和新能源的開(kāi)發(fā)利用〕

作業(yè)：1.什么是生物工業(yè)下游技術(shù)？2.試述生物工業(yè)下游技術(shù)的一般工藝過(guò)程。3.什么是清潔生產(chǎn)？主要包括哪些內(nèi)容？第二章

下游技術(shù)的理論根底生物工業(yè)下游技術(shù)：尚無(wú)一個(gè)嚴(yán)格意義上的定義，本課程中所涉及的內(nèi)容有許多在本質(zhì)上屬于物質(zhì)別離的范疇。因此，本章及后續(xù)內(nèi)容將會(huì)經(jīng)常使用“別離〞一詞。別離機(jī)理與別離操作利用目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)之間在物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)上的差異進(jìn)行別離。往往需利用多種別離機(jī)理，實(shí)施多步別離步驟。第一節(jié)下游技術(shù)中的物理學(xué)過(guò)程一、根底物性“別離〞可利用各種物質(zhì)固有性質(zhì)的差異。物性差異越大，利用價(jià)值越大。二、分類以物理學(xué)過(guò)程為根底的別離操作，大致可分為以下三類：1．平衡別離過(guò)程建立在相平衡關(guān)系上的。利用相的組成差異進(jìn)行混合物體系的別離。表2—1為平衡別離的代表性單元操作。2．?dāng)M平衡別離操作在混合物體系本身所占有的空間之外加一個(gè)能引起物質(zhì)別離的勢(shì)能場(chǎng)，在它的作用下，形成別離場(chǎng)。如表2—2所示。3．非平衡別離操作1、2以外均劃歸其中，利用物質(zhì)移動(dòng)速度差和廣義的、基于“屏蔽效應(yīng)〞的別離操作。如表2—3所示。第二節(jié)下游技術(shù)中的化學(xué)過(guò)程一、化學(xué)性分子識(shí)別液液萃?。豪梦镔|(zhì)在溶劑中溶解度不同的別離。如果在萃取溶劑中參加對(duì)原料中目標(biāo)物質(zhì)有特異性作用的成分(萃取劑、抽提劑)，能到達(dá)高選擇性。1．分子間相互作用分子間的相互作用力除了眾所周知的范德華力、氫鍵力等，近年來(lái)備受注目的分子間作用力是疏水性相互作用力。2．分子識(shí)別酶和底物的專一性結(jié)合。鑰匙和鎖的關(guān)系。只有底物分子才能進(jìn)入這個(gè)口袋。酶分子正是通過(guò)對(duì)底物的多點(diǎn)識(shí)別才顯示出它高效、專一的底物識(shí)別功能。

環(huán)狀糊精也有一定的分子識(shí)別功能。

它是由6—8個(gè)葡萄糖環(huán)狀結(jié)合而成的低聚糖．筒狀，內(nèi)部具空洞結(jié)構(gòu)?！盎使诿穴?/p>

皇冠醚有多種，均為大環(huán)狀化合物。中心開(kāi)孔，一些金屬離子和氨基酸分子等正好能進(jìn)入其中。泡沸石〔無(wú)機(jī)吸附劑〕具有細(xì)孔結(jié)構(gòu)的氧化鋁、硅石類陶瓷，孔徑接近分子水平時(shí)，那么可用做分子篩,對(duì)氣體分子選擇性吸附別離。泡沸石二、下游技術(shù)中的化學(xué)反響選擇性別離純化：如檸檬酸工業(yè)中常用鈣鹽沉淀，以便于與發(fā)酵液中殘?zhí)羌捌渌扇苄噪s質(zhì)的別離。利用草酸與Ca2+反響，生成不溶性鈣鹽可除去雜質(zhì)Ca2+。產(chǎn)品制造：氨基酸或短肽能絡(luò)合或螯合某些金屬離子生產(chǎn)保健產(chǎn)品。補(bǔ)充人體缺乏又不易被人體吸收的鈣、鐵、鋅等微量元素。山梨醇和木糖醇可以通過(guò)葡萄糖和木糖經(jīng)金屬鎳催化加氫工藝(高壓)獲得。第三節(jié)下游技術(shù)中的生物學(xué)過(guò)程一、特異性相互作用(鎖鑰關(guān)系〕〔一〕可逆性結(jié)合作用〔除共價(jià)結(jié)合外〕1．離子間的相互作用〔靜電作用〕2．氫鍵結(jié)合3．疏水性相互作用4．對(duì)金屬原子配位5．弱共價(jià)鍵結(jié)合影響蛋白質(zhì)立體構(gòu)象的環(huán)境因素(1)熱：熱是影響蛋白質(zhì)構(gòu)象的最普通的因素。(2)溫度：溫度的上升，使原子、分子的熱運(yùn)動(dòng)更活潑，離子間的相互作用、氫鍵、金屬原子配位作用等變?nèi)?。但疏水性的相互作用因溫度上升而加?qiáng)。(3)pH：pH對(duì)離子間的作用影響很大，pH也對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基的離解度影響很大。(4)靜電性的環(huán)境變化：如在溶液中參加在水中能離解為陽(yáng)離子和陰離子的強(qiáng)電解質(zhì)(如食鹽等無(wú)機(jī)鹽)。溶液離子強(qiáng)度增加，離子間相互作用變?nèi)?，氫鍵也受到同樣影響。(5)試劑：在試劑中，尿素、鹽酸胍、十二烷基磺酸鈉等會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象造成影響。尿素或鹽酸胍有增加水的介電常數(shù)和離子強(qiáng)度的作用，從而影響氫鍵作用。

二、親和色譜利用某些生物物質(zhì)之間特異的親和力進(jìn)行選擇性別離的色譜技術(shù)。

第三章

發(fā)酵液預(yù)處理目的不僅在于別離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆?！布?xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物〕，還希望除去局部可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。采用絮凝或凝聚的方法，設(shè)法增大懸浮液中固體粒子的大小，提高其沉降速度；或采用稀釋、加熱等方法降低黏度，以利于過(guò)濾。第一節(jié)發(fā)酵液的預(yù)處理一、發(fā)酵液過(guò)濾特性的改變微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大局部是水；懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。微生物發(fā)酵液的成分極為復(fù)雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)，以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。改善發(fā)酵液過(guò)濾特性的物理化學(xué)方法：調(diào)酸〔等電點(diǎn)〕、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加外表活性物質(zhì)、添加反響劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度

2.調(diào)整pH3.凝聚與絮凝

根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過(guò)濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度〔加水稀釋法和加熱法等〕可有效提高過(guò)濾速率。注意加熱溫度與時(shí)間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過(guò)濾特性。氨基酸、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的調(diào)節(jié)；在膜過(guò)濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過(guò)調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染；細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH值下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過(guò)濾的進(jìn)行。采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過(guò)濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。凝聚——指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象；絮凝——指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過(guò)程。陽(yáng)離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋篈l3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+常用的凝聚劑電解質(zhì)有：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O〔明礬〕；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3〔1〕凝聚發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易別離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬(wàn)至一千萬(wàn)以上，長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子〔如---COOH〕或陽(yáng)離子〔如---NH2〕基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過(guò)靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的外表。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒外表上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用?！?〕絮凝高分子絮凝劑的吸附和絮凝作用示意圖1〕有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2〕無(wú)機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3〕天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。目前最常見(jiàn)的高分子聚合物絮凝劑有機(jī)合成的聚丙烯酰胺〔polyacrylamide〕類衍生物根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：非離子型、陰離子型〔含有羧基〕陽(yáng)離子型〔含有胺基〕工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：聚丙烯酰胺絮凝劑聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點(diǎn)用量少，一般以mg/L計(jì)量；絮凝體粗大，別離效果好；絮凝速度快；種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點(diǎn)存在一定的毒性，特別是陽(yáng)離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。聚丙烯酰胺類絮凝劑的應(yīng)用醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑〔無(wú)毒〕，聚苯乙烯類衍生物，無(wú)機(jī)高分子聚合物絮凝劑〔聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等〕，天然有機(jī)高分子絮凝劑〔多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等〕。影響絮凝的因素絮凝劑的加量(圖3-1〕絮凝劑的分子量溶液的pH攪拌速度攪拌時(shí)間對(duì)于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，采用陽(yáng)離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理；對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過(guò)濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過(guò)程，稱為混凝?！?〕混凝4.參加助濾劑5.參加反響劑一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到助濾劑的外表上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過(guò)濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。使用硅藻土?xí)r，通常細(xì)粒用量為500g/m3；中等粒度用量為700g/m3；粗粒用量為700-1000g/m3。參加反響劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反響生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過(guò)濾性能；如發(fā)酵液中含有不溶性多糖物質(zhì)，用酶將其轉(zhuǎn)化為單糖，以提高過(guò)濾速率。如萬(wàn)古霉素用淀粉作培養(yǎng)基，發(fā)酵液過(guò)濾前參加0.025%的淀粉酶，攪拌30min后，再加2.5%硅藻土助濾劑，可提高過(guò)濾效率5倍。發(fā)酵液中的雜質(zhì)高價(jià)無(wú)機(jī)離子〔Ca2+、Mg2+、Fe2+〕雜蛋白在采用離子交換提煉時(shí)，會(huì)影響樹(shù)脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。在采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低其交換容量和吸附能力，在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相別離不清。在常規(guī)過(guò)濾或膜過(guò)濾時(shí)，易使過(guò)濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過(guò)濾效率。因此，在預(yù)處理時(shí)，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。二、發(fā)酵液的相對(duì)純化〔一〕、高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀〔注意回收草酸〕；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士藍(lán)沉淀〔二〕雜蛋白的去除方法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負(fù)電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。1.沉淀法在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過(guò)氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽(yáng)離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。2.變性法

加熱大幅度調(diào)節(jié)pH值加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或外表活性劑等。缺乏之處加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。參加某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，參加氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。3.吸附法第二節(jié)固液別離工程及設(shè)備重力沉降浮選旋液別離過(guò)濾離心通氣，產(chǎn)生氣泡，使固體附著在氣泡外表除去。用于固液比重差小、直徑5～30μm顆粒的別離，污水處理懸浮液以較高速度沿切線方向進(jìn)入旋液別離器，輕相由別離器中央排出，重相由別離器下部排出，但不適合直徑<5μm顆粒去除〔可用絲網(wǎng)別離器〕。工業(yè)上常用霉菌和放線菌為絲狀菌，體形較大，發(fā)酵液采用過(guò)濾方法；細(xì)菌和酵母菌為單細(xì)胞，體形較小，其發(fā)酵液采用高速離心別離，如對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，也可用過(guò)濾進(jìn)行固液別離。一、固液別離的方法優(yōu)點(diǎn)：別離速度快，別離效率高、液相澄清度好；缺點(diǎn)：設(shè)備投資高、能耗大。離心機(jī)種類：碟片式離心機(jī)、管式離心機(jī)、傾析式離心機(jī)。1.離心別離在液相非均一系統(tǒng)中，利用離心力到達(dá)液－液、液－固、液－液－固別離的方法，統(tǒng)稱為離心別離。碟片式離心機(jī)是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。別離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量到達(dá)300m3/h，常用于大規(guī)模的別離過(guò)程。適用范圍細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片管式離心機(jī)管式離心機(jī)是一種別離效率很高的離心別離設(shè)備，其轉(zhuǎn)鼓細(xì)長(zhǎng)，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，別離因數(shù)可達(dá)104-6×105。它設(shè)備簡(jiǎn)單、操作穩(wěn)定。適用范圍細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等。特別適合一般別離機(jī)難以別離的固形物含量<1%發(fā)酵液的別離。管式離心機(jī)工作原理圖GF型，用于別離各種乳濁液,特別適用于二相相對(duì)密度差甚微的液一液別離以及含有少量雜質(zhì)的液一液一固別離。別離原理：密度大的液相形成外環(huán)，密度輕的液相形成內(nèi)環(huán)，流體到轉(zhuǎn)鼓上部各自的排液口排出，微量固體沉積在轉(zhuǎn)鼓壁上，待停機(jī)后人工卸出。GQ型，用于別離各種難于別離的懸浮液。特別適合于濃度小、粘度大，固相顆粒細(xì)，固液重度差較小的固液別離。別離原理：密度較大的固體微粒逐漸沉積在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)壁形成沉渣層，待停機(jī)后人工卸出，澄清后的液相流動(dòng)轉(zhuǎn)鼓上部的排液口排出。傾析式別離機(jī)是一種靠離心力和螺旋的推動(dòng)力作用自動(dòng)連續(xù)排渣的離心機(jī)。具操作連續(xù)、適應(yīng)性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)緊湊和維修方便的優(yōu)點(diǎn)。別離因數(shù)為1500-3000。適用范圍特別適合固形物含量較多的懸浮液的別離。因別離因數(shù)較低，不適合細(xì)菌、酵母等微小微生物懸浮液的別離?！睵53圖〕2過(guò)濾

定義：

在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液別離的方法稱為過(guò)濾。

通常發(fā)酵液的黏度大，其中的微生物體積小，造成過(guò)濾的困難。在過(guò)濾前，一般需對(duì)料液進(jìn)行絮凝或凝聚等預(yù)處理，此外可添加助濾劑提高過(guò)濾速度。A.根據(jù)過(guò)濾機(jī)理，過(guò)濾操作可分為澄清過(guò)濾和濾餅過(guò)濾。澄清過(guò)濾：濾餅過(guò)濾：過(guò)濾介質(zhì)為硅藻土、砂、顆?；钚蕴?、玻璃珠、塑料顆粒等，當(dāng)懸浮液通過(guò)濾層時(shí)，固體顆粒被阻攔或吸附在濾層的顆粒上，使濾液得以澄清，適合于固體含量少于0.1g/100ml、顆粒直徑在5-100μm的懸浮液的過(guò)濾別離，如河水、麥芽汁、酒類和飲料等的澄清。過(guò)濾介質(zhì)為濾布，包括天然或合成纖維織布、金屬織布、玻璃纖維紙、合成纖維等無(wú)紡布。當(dāng)懸浮液通過(guò)濾布時(shí)，固體顆粒被濾布阻攔而逐漸形成濾餅〔濾渣〕。當(dāng)濾餅至一定厚度時(shí)即起過(guò)濾作用，此時(shí)即可獲得澄清的濾液，這種方法叫做濾餅過(guò)濾，在濾餅過(guò)濾中，懸浮液本身形成的濾餅起著主要的過(guò)濾作用，適合于固體含量大于0.1g/100ml的懸浮液的過(guò)濾別離。B.常用過(guò)濾設(shè)備廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過(guò)濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌等多種發(fā)酵液的固液別離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的別離?！?〕板框過(guò)濾機(jī)板框過(guò)濾機(jī)板框過(guò)濾機(jī)1.結(jié)構(gòu)：假設(shè)干板，框交替排列，板，框都用支耳架在一對(duì)橫梁上，用壓緊裝置壓緊或拉開(kāi)。2.濾板結(jié)構(gòu)：凹凸紋路作用支撐濾布，提供濾液或洗滌液的流道。分為洗滌板和非洗滌板兩種。3.濾框結(jié)構(gòu)：有供料漿通過(guò)的暗孔，料漿在壓差的推動(dòng)下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進(jìn)行過(guò)濾別離。4.過(guò)濾操作液體流動(dòng)路徑：料漿沿1通道輸入，通過(guò)濾框的暗孔進(jìn)入濾框，框中的料漿在壓差的推動(dòng)下籍框兩側(cè)覆蓋的濾布進(jìn)行過(guò)濾別離。濾餅在框內(nèi)兩側(cè)生成并增長(zhǎng)，濾液通過(guò)濾布流到濾板板面的凹槽后因板面凹槽有暗孔與2、4通道相連或與3通道相連，故濾液可由三條通道流到過(guò)濾機(jī)外。優(yōu)點(diǎn)：真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)具有自動(dòng)化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大〔>10％〕的懸浮液的別離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過(guò)濾別離。缺點(diǎn)：由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過(guò)濾，且過(guò)濾所得固相的干度不如加壓過(guò)濾?！?〕真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)硅藻土的使用方法：作為過(guò)濾介質(zhì)預(yù)涂在支持介質(zhì)上參加到懸浮液中按支撐單元分：板框過(guò)濾機(jī)，葉片式過(guò)濾機(jī)等〔3〕硅藻土過(guò)濾機(jī)1〕切向流過(guò)濾〔Cross-FlowFiltration〕又稱錯(cuò)流過(guò)濾交叉過(guò)濾和十字流過(guò)濾，是一種維持恒壓下高速過(guò)濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸浮液在過(guò)濾介質(zhì)外表作切向流動(dòng)，利用流動(dòng)的剪切作用將過(guò)濾介質(zhì)外表的固體〔濾餅〕移走。2〕雙水相萃取向水相中參加溶于水的某些高分子化合物〔如葡聚糖、聚乙二醇等〕后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另一種高分子化合物，從而到達(dá)別離和提純某種高分子化合物的目的。3〕吸附法向細(xì)胞碎片懸浮液中參加某種固體吸附劑，或者用細(xì)胞碎片懸浮液通過(guò)裝有吸附劑的固定床，即可到達(dá)除去細(xì)胞碎片的目的。主要的問(wèn)題是很難選擇適宜的吸附劑，以保證目的產(chǎn)物不被吸附而損失。3.其他固液別離方法作業(yè)：1.名詞解釋：絮凝；凝聚；混凝2.發(fā)酵液中的高價(jià)無(wú)機(jī)離子和雜蛋白可以采用哪些方法去除？3.試述生物工業(yè)中常用固液別離設(shè)備的原理、特點(diǎn)、及適用范圍。第四章

微生物細(xì)胞的破碎知識(shí)點(diǎn)：細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)，破碎率的測(cè)定。重點(diǎn)：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細(xì)胞破碎方法的原理，操作過(guò)程及常用設(shè)備，并能就實(shí)際生產(chǎn)情況予以合理的選擇。難點(diǎn)：常用破碎方法的合理選用。為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)〔表1〕：一、細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的鞏固；酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。不同種類的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序?yàn)椋褐参锛?xì)胞＞真菌〔如酵母菌〕＞革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌＞革蘭氏陰性細(xì)菌＞動(dòng)物細(xì)胞。二、常用破碎方法細(xì)胞破碎機(jī)理圖進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑〔直徑小于1mm〕一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液別離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法〔Beadmill〕原理：高速珠磨機(jī)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)〔瑞士WAB公司和德國(guó)西門(mén)子機(jī)械公司制造〕。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易別離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)采用高壓勻漿器〔由高壓泵和勻漿閥組成，英國(guó)APV公司和美國(guó)Microfluidics公司均有產(chǎn)品出售〕。2.高壓勻漿法〔High-pressurehomogenization〕——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：高壓勻漿器大、中、小型高壓勻漿器在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及高濃度的細(xì)胞，常采用屢次循環(huán)的操作方法。一般說(shuō)來(lái)，酵母菌較細(xì)菌難破碎，處于靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞較處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞難破碎，在復(fù)合培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞比在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細(xì)胞較難破碎。易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌含有包含體的基因工程菌〔因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥〕不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型：破碎的動(dòng)力學(xué)方程為：ln[1／〔l－R〕]＝KNPα其中R——破碎率；K——與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；P一操作壓力；N一懸浮液通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)。α——與微生物種類有關(guān)的常數(shù)；破碎酵母菌,α值可取2.2?？梢?jiàn)，影響破碎的主要因素是壓力、溫度和通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)。利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法〔Ultrasonication〕一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差，該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。4.酶溶法〔EnzymaticLysis〕〔1〕外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物如：對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先參加蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再參加葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)假設(shè)緩沖液的滲透壓變化，那么細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差〔不同菌種需選擇不同的酶〕，產(chǎn)物抑制的存在。如在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以到達(dá)細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點(diǎn)是：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。〔2〕自溶法〔Autolysis〕某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、外表活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性〔滲透性〕，從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。4.化學(xué)滲透法〔Chemicalpermeation〕該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。如TritonX-100是一種非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。其他的外表活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細(xì)胞破碎。〔1〕外表活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通常靠二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)?！?〕EDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等?！?〕有機(jī)溶劑〔4〕變性劑鹽酸胍〔Guanidinehydrochloride〕和脲〔Urea〕是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。*表示適用通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液別離和進(jìn)一步提取。將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保存率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。5.其他方法1.X-press法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中〔如一定濃度的甘油或蔗糖溶液〕，達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中參加某些抑制劑〔如抗生素等〕，使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。2.滲透壓法〔Osmoticpressure〕將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)屢次而到達(dá)破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)屢次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。3.反復(fù)凍結(jié)-融化法使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)枯燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流枯燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空枯燥多用于細(xì)菌。4.枯燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥三、破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向

細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心別離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物〔如蛋白質(zhì)或酶〕的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計(jì)算其破碎率。細(xì)胞破碎與固液別離緊密相關(guān)。2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過(guò)程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基、生長(zhǎng)期、操作參數(shù)〔如pH、溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、稀釋率等〕等因素都對(duì)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成有一定的影響。細(xì)胞的破碎與上游培養(yǎng)過(guò)程有關(guān)。用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造，以提高胞內(nèi)物質(zhì)的提取率也是非常重要的。在生長(zhǎng)后期，參加某些能抑制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑〔如青霉素、環(huán)絲氨酸等〕，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁有缺陷，利于破碎；選擇較易破碎的菌種作為寄主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌；在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件〔如溫度等〕，激活噬菌體基因，使細(xì)胞自內(nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。作業(yè):1.常用細(xì)胞破碎方法(珠磨法、高壓勻漿法、超聲破碎法、酶溶法、化學(xué)滲透法)的原理、特點(diǎn)及適用性。2.舉例說(shuō)明采用多種破碎方法相結(jié)合提高破碎率的機(jī)理。

第五章

溶劑萃取和浸取萃?。豪梦镔|(zhì)在互不相溶的兩相之間溶解度的不同而使物質(zhì)得到純化或濃縮的方法。反萃?。赫{(diào)節(jié)水相條件，將目標(biāo)產(chǎn)物從萃取相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。物理萃?。焊鶕?jù)相似相溶的原理，溶質(zhì)在兩相間到達(dá)分配平衡，萃取劑與溶質(zhì)之間不發(fā)生化學(xué)反響的萃取過(guò)程。化學(xué)萃取:利用萃取劑與溶質(zhì)之間的化學(xué)反響生成脂溶性復(fù)合分子實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)向有機(jī)相的分配。有機(jī)溶劑萃取法廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素、激素等發(fā)酵產(chǎn)物工業(yè)規(guī)模的提取上。利用一種溶質(zhì)組分〔如產(chǎn)物〕在兩個(gè)互不混溶的液相〔如水相和有機(jī)溶劑相〕中競(jìng)爭(zhēng)性溶解和分配性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行別離操作的。有機(jī)溶劑萃取比化學(xué)沉淀法別離程度高；比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快；比蒸餾法能耗低；生產(chǎn)能力大、周期短、便于連續(xù)操作、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。優(yōu)點(diǎn)溶劑萃取法和其他新型別離技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了一系列新型別離技術(shù)：超臨界流體萃取〔Supercriticalfluidextraction〕反膠團(tuán)萃取〔Reversedmicelleextraction〕雙水相萃取技術(shù)〔Partitionoftwoaqueousphasesystem〕等。用于高品質(zhì)的天然物質(zhì)、胞內(nèi)物質(zhì)〔胞內(nèi)酶、蛋白質(zhì)、多肽、核酸等〕的別離提取上。用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過(guò)程稱為浸取或浸出。用溫水從甜菜中提取糖，用有機(jī)溶劑從大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有機(jī)溶劑從植物中提取藥物、香料或色素等。幾種萃取方法的比較第一節(jié)溶劑萃取

一、溶劑萃取過(guò)程的理論根底1．物質(zhì)的溶解和相似相溶原理從熱力學(xué)角度考慮，一個(gè)過(guò)程要能自動(dòng)進(jìn)行，體系的自由能應(yīng)下降，自由能的變化包括焓變化和熵變化兩局部：

為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，忽略熵的變化，并忽略壓力和體積變化(一般溶解過(guò)程壓力和體積的變化很小)，這樣只要考慮體系能量的變化即可。

溶解過(guò)程的三個(gè)能量變化過(guò)程(1)溶質(zhì)B各質(zhì)點(diǎn)的別離；原先是固態(tài)或液態(tài)的溶質(zhì)B，先別離成分子或離子等單個(gè)質(zhì)點(diǎn)。此過(guò)程需要吸收能量，這種能量的大小通常與分子之間的作用力有關(guān)，一般順序?yàn)椋悍菢O性物質(zhì)＜極性物質(zhì)＜?xì)滏I物質(zhì)＜離子型物質(zhì)(2)溶劑A在溶質(zhì)B的作用下形成可容納B質(zhì)點(diǎn)的空位；此過(guò)程也需要吸收能量，其大小與溶劑分子A之間的相互作用力有關(guān)，一般順序與上述相同：非極性物質(zhì)＜極性物質(zhì)＜?xì)滏I物質(zhì)該能量還與溶質(zhì)分子B的大小有關(guān)。(3)溶質(zhì)質(zhì)點(diǎn)B進(jìn)入溶劑A形成的空位；此過(guò)程放出能量，放出能量的大小有以下規(guī)律：A、B均為非極性分子＜一非極性分子、另一極性分子＜均為極性分子＜B被A溶劑化〔1〕兩種惰性溶劑互溶〔2〕水向油中溶解〔3〕油向水中溶解〔4〕水和乙醇的溶解從能量角度分析幾種溶解過(guò)程：“相似相溶〞原理分子之間可以有兩方面的相似：一是分子結(jié)構(gòu)相似，如分子的組成、官能團(tuán)、形態(tài)結(jié)構(gòu)的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有極性的和非極性的之分，兩種物質(zhì)如相互作用力相近，那么能互相溶解。與水“相似〞的物質(zhì)易溶于水，與油“相似〞的物質(zhì)易溶于油就是相似相溶原理的表現(xiàn)。

2．溶劑的互溶性規(guī)律物質(zhì)分子之間的作用力與物質(zhì)種類有關(guān)，包括較強(qiáng)的氫鍵力和較弱的范德華力。氫鍵力與化合鍵能相比較弱，但比范德華力要強(qiáng)得多。按照生成氫鍵的能力，可將溶劑分成四種類型。(1)N型溶劑不能形成氫鍵，如烷烴、四氯化碳、苯等,稱惰性溶劑。(2)A型溶劑只有電子受體的溶劑，如氯仿、二氯甲烷等，能與電子供體形成氫鍵。(3)B型溶劑只有電子供體的溶劑，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶劑中的TBP(磷酸三丁酯)、叔胺等。(4)AB型溶劑同時(shí)具備電子受體A—H和供體B的溶劑,可締合成多聚分子，因氫鍵的結(jié)合形式不同又可分成三類：

AB(1)型：交鏈氫鍵締合溶劑，如水、多元醇、多元羧酸、多酚等。

AB(2)型：直鏈氫鍵締合溶劑，如醇、胺、羧酸等。

AB(3)型：生成內(nèi)氫鍵分子，例如鄰硝基苯酚等，這類溶劑中的電子受體A—H因已形成內(nèi)氫鍵而不再起作用。故AB(3)型溶劑的氫鍵性質(zhì)與N型或B型相似。

3．溶劑的極性溶劑萃取的關(guān)鍵是萃取溶劑的選擇，而選擇的依據(jù)是“相似相溶〞的原那么?！跋嗨屁曈袃蓚€(gè)方面：一是分子結(jié)構(gòu)相似，這相對(duì)容易考察；另一個(gè)是分子間作用能相似，即分子問(wèn)相互作用力相似。在生物工業(yè)上，對(duì)后一點(diǎn)考察較多的是分子極性。介電常數(shù)是一個(gè)化合物摩爾極化程度的量度，如果介電常數(shù)，就能預(yù)測(cè)該化合物是極性的還是非極性的。物質(zhì)的介電常數(shù)可通過(guò)測(cè)定該物質(zhì)在電容器二極板間的靜電容量C來(lái)決定。根據(jù)萃取目標(biāo)物質(zhì)的介電常數(shù)，尋找極性相接近的溶劑作為萃取溶劑，也是溶劑選擇的重要方法之一。一個(gè)良好溶劑要滿足的要求：(1)有很大的萃取容量，即單位體積的萃取溶劑能萃取大量的產(chǎn)物；(2)有良好的選擇性，理想情況是只萃取產(chǎn)物而不萃取雜質(zhì)；(3)與被萃取的液相互溶度要小，且粘度界面張力小或適中，這樣有利于相的分散和兩相別離；(4)溶劑的回收和再生容易；(5)化學(xué)穩(wěn)定性好，不易分解，對(duì)設(shè)備腐蝕性小；(6)經(jīng)濟(jì)性好，價(jià)廉易得；(7)平安性好，閃點(diǎn)高，對(duì)人體無(wú)毒性或毒性低。生物工業(yè)上常用的溶劑有酯類、醇類和酮類等。

小知識(shí)：閃點(diǎn)又叫閃燃點(diǎn)，是指可燃性液體外表上的蒸汽和空氣的混合物與火接觸而初次發(fā)生閃光時(shí)的溫度。閃點(diǎn)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)儀器測(cè)定。閃點(diǎn)溫度比著火點(diǎn)溫度低些。

燃點(diǎn)又叫著火點(diǎn)，是指可燃性液體外表上的蒸汽和空氣的混合物與火接觸而發(fā)生火焰能繼續(xù)燃燒不少于5s時(shí)的溫度?？稍跍y(cè)定閃點(diǎn)后繼續(xù)在同一標(biāo)準(zhǔn)儀器中測(cè)定。可燃性液體的閃點(diǎn)和燃點(diǎn)說(shuō)明其發(fā)生爆炸或火災(zāi)的可能性的大小，對(duì)運(yùn)輸、儲(chǔ)存和使用的平安有極大關(guān)系。4．分配定律和別離因數(shù)分配定律：在一定溫度一定壓力的條件下，溶質(zhì)分配在兩個(gè)互不相溶的溶劑中，到達(dá)平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的活度之比為一常數(shù)。如果是稀溶液，活度可用濃度代替，那么到達(dá)平衡時(shí)溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)。稱之為分配系數(shù)K，即有別離因數(shù)(β)萃取劑對(duì)溶質(zhì)A和B別離能力的大小可用別離因數(shù)(β)來(lái)表征：假設(shè)原來(lái)料液中除溶質(zhì)A以外，還含有溶質(zhì)B，那么由于A、B的分配系數(shù)不同，萃取相中A和B的相對(duì)含量就不同于萃余相中A和B的相對(duì)含量。如A的分配系數(shù)較B大，那么萃取相中A的含量(濃度)較B多，這樣A和B就得到了一定程度的別離。β越大，A、B的別離效果越好，即產(chǎn)物與雜質(zhì)越容易別離。

5．水相條件的影響

發(fā)酵液中存在與產(chǎn)物性質(zhì)相近的雜質(zhì)、未完全利用的底物、無(wú)機(jī)鹽、供微生物生長(zhǎng)代謝的其他營(yíng)養(yǎng)成分等。必須考慮這些物質(zhì)對(duì)萃取過(guò)程的影響。(1)pH值直接影響表觀分配系數(shù)。另外對(duì)選擇性有影響。pH值還應(yīng)盡量選擇在使產(chǎn)物穩(wěn)定的范圍內(nèi)。(2)溫度溫度會(huì)影響生化物質(zhì)的穩(wěn)定性，所以一般在室溫或低溫下進(jìn)行。同時(shí)影響分配系數(shù)K。(3)鹽析硫酸銨、氯化鈉等可降低產(chǎn)物在水中的溶解度，還能減小有機(jī)溶劑在水相中的溶解度。但過(guò)多可能促使雜質(zhì)一起轉(zhuǎn)入溶劑相，必要時(shí)要考慮回收。(4)帶溶劑能和產(chǎn)物形成復(fù)合物，使產(chǎn)物更易溶于有機(jī)溶劑相中，提高分配系數(shù)。復(fù)合物又要容易分解。1〕青霉素萃取 青霉素是有機(jī)酸,pH值對(duì)其分配系數(shù)有很大影響。很明顯,在較低pH下有利于青霉素在有機(jī)相中的分配,當(dāng)pH大于6.0時(shí),青霉素幾乎完全分配于水相中。從圖中可知,選擇適當(dāng)?shù)膒H,不僅有利于提高青霉素的收率,還可根據(jù)共存雜質(zhì)的性質(zhì)和分配系數(shù),提高青霉素的萃取選擇性。溶劑萃取應(yīng)用2〕紅霉素萃取 紅霉素是堿性電解質(zhì)，在乙酸戊酯和pH9.8的水相之間分配系數(shù)為44.7，而水相pH降至5.5時(shí),分配系數(shù)降至14.4。3〕紅霉素反萃取 反萃取操作同樣可通過(guò)調(diào)節(jié)pH值實(shí)現(xiàn)。如，紅霉素在pH9.4的水相中用醋酸戊酯萃取，而反萃取那么用pH5.0的水溶液。二、工業(yè)萃取方式和理論收得率工業(yè)萃取的流程混合分離溶劑回收混合器（如攪拌混合器）分離器（如碟片式離心機(jī)）溶劑回收裝置（如蒸餾塔）料液F與萃取溶劑S一起參加混合器內(nèi)攪拌混合萃取，到達(dá)平衡后的溶液送到別離器內(nèi)別離得到萃取相L和萃余相R，萃取相送到回收器，萃余相R為廢液。在回收器內(nèi)產(chǎn)物與溶劑別離〔如蒸餾、反萃取等〕，溶劑那么可循環(huán)使用。1.單級(jí)萃取萃取器分離器回收器FSRP（產(chǎn)物）使用一個(gè)混合器和一個(gè)別離器的萃取操作：L理論收得率：E=KVS/VFE:萃取平衡后，溶質(zhì)在萃取相與萃余相中數(shù)量的比值K:分配系數(shù)VF：料液體積VS：萃取劑體積例1：利用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液中的放線菌素D,pH3.5時(shí)分配系數(shù)K=57。令料液體積為450l/h,單級(jí)萃取劑流量為39l/h。計(jì)算單級(jí)萃取的萃取率。解:單級(jí)萃取的萃取因子：E=57*39/450 =4.94

單級(jí)萃取率==4.94/〔1+4.94〕=0.832為提高收率常采用多級(jí)萃取，多級(jí)萃取又有多級(jí)逆流萃取和多級(jí)錯(cuò)流萃取的區(qū)別。

2.多級(jí)萃取多級(jí)錯(cuò)流萃取流程的特點(diǎn)：每級(jí)均加新鮮溶劑，故溶劑消耗量大，得到的萃取液產(chǎn)物平均濃度較稀，但萃取較完全。

混合分離器1混合分離器2混合分離器n料液溶劑萃取液萃余液萃余液萃取液萃取液萃余液溶劑溶劑1〕假設(shè)每一級(jí)萃取劑流量相等(=L),那么：萃取率=2〕假設(shè)每一級(jí)萃取劑流量不等,那么各級(jí)的萃取因子Ei也不相同,可采用逐級(jí)計(jì)算法，為：萃余率:萃取率：=1-

’n

例2：利用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液中的放線菌素D,pH3.5時(shí)分配系數(shù)K=57。采用三級(jí)錯(cuò)流萃取,令料液體積為450l/h,三級(jí)萃取劑流量之和為39l/h。分別計(jì)算L1=L2=L3=13l/h和L1=20,L2=10,L3=9l/h時(shí)的萃取率。解:萃取劑流量相等時(shí)，E=1.65 用右側(cè)方程得：1-3=0.946。 假設(shè)各級(jí)萃取劑流量不等,那么E1=2.53，E2=1.27，E3=1.14，由右式得 1-’3=0.942.所以，1-3>1-’3

單級(jí)萃取的萃取率=0.8321-

’n

E=KL/VF多級(jí)逆流萃取流程的特點(diǎn)：料液走向和萃取劑走向相反，只在最后一級(jí)中參加萃取劑，萃取劑消耗少，萃取液產(chǎn)物平均濃度高，產(chǎn)物收率較高。工業(yè)上多采用多級(jí)逆流萃取流程。混合分離器1混合分離器2混合分離器n料液產(chǎn)物＋溶劑萃余液萃余液廢液溶劑萃取率為:例3：設(shè)例2中操作條件不變(L=39l/h),計(jì)算采用多級(jí)逆流接觸萃取時(shí)使收率到達(dá)99%所需的級(jí)數(shù)。解：E=KL/VF=4.94;因?yàn)槭章蕿?9%,即1-n=0.99,那么上式得n=2.74,故需要三級(jí)萃取操作。 由計(jì)算可知，采用三級(jí)逆流接解萃取的收率為99.3%,高于例2的錯(cuò)流萃取,說(shuō)明多級(jí)逆流接觸萃取效率優(yōu)于多級(jí)錯(cuò)流萃取.三、乳化和去乳化1．乳化乳化是一種液體(分散相)分散在另一種不相混溶的液體(連續(xù)相)中的現(xiàn)象。害處：乳化產(chǎn)生后會(huì)使有機(jī)溶劑相和水相分層困難，產(chǎn)生乳化后使有機(jī)相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶：①發(fā)酵液中夾帶有機(jī)溶劑微滴，使目標(biāo)產(chǎn)物受到損失；②有機(jī)溶劑中夾帶發(fā)酵液給后處理操作帶來(lái)困難。原因：是發(fā)酵液中存在的蛋白質(zhì)和固體顆粒等物質(zhì)，這些物質(zhì)具有外表活劑性的作用，使有機(jī)溶劑和水的外表張力降低，水易于以微小液滴的形式分散于油相稱為油包水型W/O乳濁液；相反，為O/W型乳濁液。

2．破乳化由蛋白質(zhì)引起的乳化多為O/W型，其粒徑在2.5—30微米之間。外表活性劑的親水基團(tuán)強(qiáng)度大于親油基團(tuán)。破乳方法：1.過(guò)濾或離心別離破乳法；2.化學(xué)法：加電解質(zhì)中和離子型乳油液的電荷；3.物理法：加熱、稀釋、吸附等；4.頂替法：參加外表活性更大，但因其碳鏈較短難以形成鞏固的保護(hù)膜的物質(zhì)，取代界面上的乳化劑；5.轉(zhuǎn)型法：如在O/W中參加親油性乳化刑，使乳化液有生成W/O的傾向，但又不穩(wěn)定，從而到達(dá)破乳目的。最好的方法是防止乳化，如蛋白質(zhì)是乳化起因，就應(yīng)設(shè)法去除蛋白質(zhì)。四、萃取設(shè)備簡(jiǎn)介1．單級(jí)萃取設(shè)備在單級(jí)萃取根本完全的情況下，用一套混合器和別離機(jī)即可。2．多級(jí)萃取設(shè)備(1)脈動(dòng)篩板塔(2)轉(zhuǎn)盤(pán)塔第二節(jié)浸取浸?。阂卜Q之為浸出，用某種溶劑把有用物質(zhì)從固體原料中提取到溶液中的過(guò)程。一、浸取過(guò)程的應(yīng)用前加工：枯燥：有助于細(xì)細(xì)胞膜的破裂，溶劑也容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部直接溶解溶質(zhì)。滾壓：將原料滾壓成片，使其減小到0.1一0.5mm，那么大豆及許多植物種子的細(xì)胞壁極大地破裂，植物油容易進(jìn)入溶劑。切片：減小水溶劑從水相主體擴(kuò)散到每個(gè)細(xì)胞的距離，細(xì)胞根本上保持完好，水溶性物質(zhì)可以通過(guò)半透性細(xì)胞膜擴(kuò)散進(jìn)入水溶劑中，蛋白質(zhì)和膠體組分因透不過(guò)細(xì)胞膜而不能溶入水相。二、浸取速率浸取過(guò)程：(1)溶劑從溶劑主體傳遞到固體顆粒的外表；(2)溶劑擴(kuò)散滲入固體內(nèi)部和內(nèi)部微孔隙內(nèi)；(3)溶質(zhì)溶解進(jìn)入溶劑；(4)通過(guò)固體微孔隙通道中的溶液擴(kuò)散至固體外表并進(jìn)一步進(jìn)入溶劑主體。一般而言．第一、二兩步都很迅速，不是浸取過(guò)程總速率的控制性步驟。溶質(zhì)通過(guò)多孔固體的擴(kuò)散可用有效擴(kuò)散系數(shù)來(lái)描述，而有效擴(kuò)散系數(shù)與Fick定律有關(guān)。三、浸出的其他問(wèn)題1．相平衡浸取過(guò)程中的相平衡用分配系數(shù)KD表示KD＝y(tǒng)/xy——到達(dá)平衡時(shí)溶質(zhì)在液相中的濃度x——平衡時(shí)溶質(zhì)在固相中的濃度2．溶劑的選擇KD大且對(duì)目的物質(zhì)的選擇性高，溶劑的價(jià)格應(yīng)低廉，無(wú)腐蝕性，無(wú)毒，閃點(diǎn)高，無(wú)爆炸性，產(chǎn)品中易去除,容易回收。3．增溶作用原先不溶或難溶性的生物大分子物質(zhì)向可溶性的、分子量較小的生物物質(zhì)轉(zhuǎn)變，但不能過(guò)度。也有向不溶性轉(zhuǎn)變的。4．固體原料的預(yù)處理：如粉碎、枯燥等。萃取操作示意圖萃取、洗滌和反萃取操作過(guò)程示意圖第六章

超臨界流體萃取一.序言超臨界流體萃?。菏菍⒊R界流體作為萃取溶劑的一種萃取技術(shù)，它兼有傳統(tǒng)的蒸餾和液液萃取的特征，是適用面很廣的一門(mén)新型別離技術(shù)。超臨界流體：是狀態(tài)超過(guò)氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)——臨界點(diǎn)后的流體。通常有二氧化碳〔CO2〕、氮?dú)狻睳2〕、氧化二氮〔N2O〕、乙烯〔C2H4〕、三氟甲烷〔CHF3〕等。

超臨界流體〔SCF〕的特性由以上特性可以看出，超臨界流體兼有液體和氣體的雙重特性，擴(kuò)散系數(shù)大，粘度小，滲透性好，與液體溶劑相比，可以更快地完成傳質(zhì)，到達(dá)平衡，促進(jìn)高效別離過(guò)程的實(shí)現(xiàn)。超臨界流體的密度接近液體，因此具有與液體相近的溶解能力。超臨界流體的粘度和擴(kuò)散系數(shù)又與氣體相近似，而溶劑的低黏度和高擴(kuò)散系數(shù)的性質(zhì)是有利于傳質(zhì)的。由于以上特點(diǎn)，超臨界流體可以迅速滲透到物體的內(nèi)部溶解目標(biāo)物質(zhì)，快速到達(dá)萃取平衡。二、超臨界流體的萃取原理真空“溶解〞物質(zhì)的能力極低。參加超臨界氣體萃取溶劑〔接近于液體密度〕，溶質(zhì)的溶解度與真空中的溶解度相比，大幅度增加〔一億多倍〕。物質(zhì)之間的溶解能力主要取決于物質(zhì)分子之間的相似性，一是分子結(jié)構(gòu)相似，二是分子間的作用力相似。而分子結(jié)構(gòu)之間的相似相溶在很大程度上也可以歸結(jié)到作用能相似上。真空或萃取劑分子密度極低時(shí)，溶劑對(duì)溶質(zhì)的作用能極小，溶質(zhì)的溶解度也就極小了。

在超臨界流體萃取中，主要是溶劑流體密度的大幅度增加導(dǎo)致溶劑對(duì)溶質(zhì)的作用力大幅度增加，從而形成了溶解物質(zhì)的能力，這個(gè)特性給溶劑流體回收、溶劑與溶質(zhì)別離帶來(lái)方便。在超臨界萃取后的別離操作中，可在與萃取溫度相同的條件下，降低壓力使溶劑的密度下降，引起其溶解物質(zhì)的能力下降，就可以方便地進(jìn)行萃取物與溶劑的別離。提高萃取劑選擇性的根本原那么是：①按相似相溶原那么，選用的超臨界流體與被萃取物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)越相似，溶解能力就越大?！睵111〕②從操作角度看，使用超臨界流體為萃取劑時(shí)的操作溫度越接近臨界溫度，溶解能力也越大。三、超臨界CO2的溶劑特征１、超臨界CO2的相圖：在臨界點(diǎn)附近，密度線聚集于臨界點(diǎn)周圍，壓力或溫度小范圍的變化，就會(huì)引起CO2密度的大幅度變化。由于CO2溶解、萃取物質(zhì)的能力與CO2本身的密度成正比，這就意味著只要通過(guò)改變壓力或溫度來(lái)改變?nèi)軇〤O2的密度，就可以改變其對(duì)物質(zhì)的溶解能力。特性：通過(guò)壓力或溫度的改變可有效地萃取和別離溶質(zhì)。特點(diǎn):在臨界點(diǎn)附近,密度有很寬的變化范圍;溫度,壓力微調(diào)可使密度顯著變化２、萃取溶劑CO2的性質(zhì)無(wú)毒，無(wú)腐蝕性，不可燃燒，純度高且價(jià)格低。有優(yōu)良的傳質(zhì)性能，擴(kuò)散系數(shù)大；粘度低，與其他超臨界流體溶劑相比，CO2具有相對(duì)較低的臨界壓力和臨界溫度，適于處理熱敏性生物制品和天然物產(chǎn)品。

P114:圖6-4；圖6-5常用超臨界流體的臨界性質(zhì)表

四、SC—C02萃取以及拖帶劑的作用１、SC—C02萃取：天然產(chǎn)品中通常含有許多不同的化學(xué)成分；對(duì)同一天然產(chǎn)品用不同方法或不同萃取劑提取得到的制品，其組分是不同的。逐步增加溶劑C02的溶解能力，可以獲得各種質(zhì)量不同的萃取產(chǎn)物。２、拖帶劑的作用：

添加拖帶劑即輔助溶劑，可增加物質(zhì)的溶解度和萃取選擇性。如在C02中添加約14％的丙酮后，甘油酯的溶解度增加22倍。純C02幾乎不能從咖啡豆中萃取咖啡因，但在加濕(水)的SC—C02中，因?yàn)樯闪司哂袠O性的H2CO3，在一定的條件下，能選擇性地溶解萃取極性的咖啡因。五、SC—C02萃取流程

SC—C02萃取流程：萃取流程根本上是由萃取工段和別離工段(溶質(zhì)和C02的別離)組合而成。代表性的三種流程模式圖壓縮機(jī)

萃取釜

制冷MVC-760L

二氧化碳循環(huán)泵

六、工業(yè)化超臨界CO2萃取設(shè)備1.國(guó)產(chǎn)設(shè)備的生產(chǎn)情況南通市華安超臨界萃取

海安縣石油科技儀器〔南通市華安超臨界萃取〕，系中國(guó)石油天然氣集團(tuán)〔股分〕公司、中國(guó)石油化工集團(tuán)〔股份〕公司、中國(guó)海洋石油總公司定點(diǎn)生產(chǎn)企業(yè)，公司具有近四十年研發(fā)和生產(chǎn)石油儀器設(shè)備的豐富經(jīng)驗(yàn)。本公司自1989年起，在清華大學(xué)、中科院、大專院校等專家學(xué)者的關(guān)心指導(dǎo)下，主攻超臨界CO2萃取設(shè)備國(guó)產(chǎn)化研制生產(chǎn)，十多年來(lái)，已形成中、小試驗(yàn)〔生產(chǎn)〕裝置系列化生產(chǎn)能力，產(chǎn)品遍布全國(guó)各地，并出口美國(guó)、韓國(guó)等國(guó)家。局部藥廠通過(guò)該裝置生產(chǎn)的新藥已報(bào)批國(guó)家級(jí)新藥并出口。該裝置通過(guò)省級(jí)鑒定，處于國(guó)內(nèi)領(lǐng)先，主要技術(shù)指標(biāo)和關(guān)鍵設(shè)備到達(dá)世界同類裝置先進(jìn)水平。該工程已列入國(guó)家火炬方案和國(guó)家級(jí)新產(chǎn)品，企業(yè)被評(píng)定為江蘇省高新技術(shù)企業(yè)，南通市首批誠(chéng)信納稅企業(yè)。公司技術(shù)力量雄厚，設(shè)備精良，工藝先進(jìn)，檢測(cè)手段齊全。公司實(shí)驗(yàn)室備有樣機(jī)，供用戶和科研單位來(lái)公司共同開(kāi)發(fā)研究。

該裝置采用CO2作添加劑，主要應(yīng)用：醫(yī)藥、食品、香精、香料等有效成份的提取，精細(xì)別離。裝置由萃取釜、別離釜、精餾柱、CO2泵等組成。

美晨集團(tuán)股份美晨集團(tuán)前身始建于1896年，是中國(guó)最早的牙膏專業(yè)生產(chǎn)廠家之一，自1993年由廣州牙膏廠轉(zhuǎn)為股份制企業(yè)——廣州美晨股份以來(lái)，幾經(jīng)改革創(chuàng)新，股本構(gòu)成發(fā)生了深刻的變化，現(xiàn)已成為“職工控股96%、國(guó)家持股4%〞的股份制企業(yè)。美晨集團(tuán)也由單一產(chǎn)業(yè)的日化企業(yè)開(kāi)展成為生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)口腔護(hù)理品、食品添加劑、化裝護(hù)膚品、現(xiàn)代中藥、保健品、高新別離技術(shù)設(shè)備，同時(shí)經(jīng)營(yíng)房產(chǎn)物業(yè)以及進(jìn)出口業(yè)務(wù)的多元化、綜合性高新科技企業(yè)，是經(jīng)國(guó)家工商總局正式審批成立的跨區(qū)域、跨行業(yè)，集科、工、貿(mào)、投資于一體的大型企業(yè)集團(tuán)。

北京超流萃取技術(shù)研究所：超臨界流體萃取工業(yè)化設(shè)備完整解決方案

設(shè)計(jì)、提供工業(yè)化超臨界連續(xù)萃取生產(chǎn)線裝置。對(duì)外進(jìn)行專利技術(shù)轉(zhuǎn)讓。云南亞太致興生物工程研究所用超臨界多元流體萃取取代超臨界二氧化碳萃取的技術(shù)，一直堅(jiān)持研究開(kāi)發(fā)至今，公開(kāi)發(fā)表過(guò)有關(guān)超臨界多元流體的文章十余篇，申報(bào)創(chuàng)造專利四項(xiàng)，法人代表王振錕擔(dān)任過(guò)火炬方案產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的工程負(fù)責(zé)人。超臨界流體技術(shù)領(lǐng)域?qū)⒂瓉?lái)廿一世紀(jì)的綠色產(chǎn)業(yè)革命，其涉及的產(chǎn)業(yè)較廣，諸如醫(yī)藥、食品、能源、航天、海洋工程、生物技術(shù)、化工、輕紡、環(huán)保工程等。2.國(guó)外設(shè)備的生產(chǎn)情況德國(guó)伍德公司德國(guó)伍德是行業(yè)頂級(jí)企業(yè)。公司創(chuàng)立于1921年，是目前世界十大化工工程公司之一。該公司原是工程師Uhde開(kāi)辦的設(shè)計(jì)所，后來(lái)為大化工公司赫斯特〔HOECHST〕收買(mǎi)。赫斯特集團(tuán)內(nèi)各子公司實(shí)行專業(yè)分工，有各類化工產(chǎn)品生產(chǎn)廠，化工設(shè)備制造廠，以及多達(dá)4000名科研人員的研究中心和職工教育訓(xùn)練中心等，而伍德公司那么是赫斯特的專業(yè)設(shè)計(jì)公司。伍德公司的工程設(shè)計(jì)部門(mén)有職工2100人，承包煉油、合成氨、化肥、有機(jī)化工原料、合成樹(shù)脂、合成纖維、氯堿、釀造食品、環(huán)境保護(hù)和核技術(shù)等方面的工程建設(shè)，是一個(gè)比較全面的化工工程公司。它的氯堿、硝酸、黃磷、乙醛等技術(shù)，在世界上享有很高的聲譽(yù)。它曾為50余個(gè)國(guó)家和地區(qū)承包過(guò)各處化工裝置的建設(shè)。每年在三十幾個(gè)工程地點(diǎn)開(kāi)展工作，年?duì)I業(yè)額3-5億美元。美國(guó)SupercriticalProcessingInc.七、超臨界流體萃取技術(shù)的應(yīng)用1〕生物活性物質(zhì)和生物制品的提取2〕超臨界狀態(tài)下的酶促反響3〕SC—C02的細(xì)胞破壁技術(shù)4〕超臨界流體枯燥技術(shù)2〕SC—C02作為酶促反響介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)①與水相比較，脂溶性底物和產(chǎn)物可溶于SC—C02中，酶蛋白不溶解，有利于三者的別離。②產(chǎn)品回收時(shí)，不需要處理大量的稀水溶液，因而不產(chǎn)生廢水污染問(wèn)題。③與其他非水相有機(jī)溶劑中的酶催化反響相比，SC—C02更適合與生物、食品相關(guān)的產(chǎn)品體系，產(chǎn)物別離簡(jiǎn)單。④與萃取一樣，SC—C02中的質(zhì)量傳遞速度快，在臨界點(diǎn)附近，溶解能力和介電常數(shù)對(duì)溫度和壓力敏感，可控制反響速度和反響平衡。3〕SC—CO2的細(xì)胞破壁技術(shù)SC—CO2的以下一些性質(zhì)有利于細(xì)胞破碎：①在近臨界點(diǎn)，SC—CO2的微小壓力變化導(dǎo)致其體積變化很大，其能量變化很大，所以SC—CO2可破壞較厚的細(xì)胞壁，如常見(jiàn)的酵母等。②SC—CO2對(duì)細(xì)胞壁中的少量脂類有萃取作用，會(huì)破壞細(xì)胞壁的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞壁在某些位置上的損壞。這種方式破壞的細(xì)胞壁碎片較大，使下游別離過(guò)程易于進(jìn)行。③SC—CO2節(jié)流膨脹是吸熱降溫過(guò)程，這個(gè)性質(zhì)可防止通常破碎過(guò)程升溫而引起的熱敏性物質(zhì)的破壞。4〕超臨界流體枯燥技術(shù)在超臨界狀態(tài)下，溶液不存在外表張力，因此采用超臨界CO2萃取枯燥時(shí)，即脫除水或其他溶劑的過(guò)程中，不存在因毛細(xì)管外表張力作用而導(dǎo)致的微觀結(jié)構(gòu)的改變〔如孔道的塌陷等〕，可以得到粒徑很小、分布均勻的藥物顆粒。實(shí)例1：從咖啡豆中除去咖啡因大量飲食咖啡因?qū)θ梭w有害。以往工業(yè)上除咖啡豆中咖啡因采用二氯乙烷萃取。缺點(diǎn)有二：其一，殘留二氯乙烷影響咖啡品質(zhì)；其二，二氯乙烷同時(shí)將局部有用香味物質(zhì)〔芳香化合物〕帶走。超臨界流體萃取除咖啡因：先用機(jī)械法清洗咖啡豆，去除灰塵和雜質(zhì);接著加蒸汽和水預(yù)泡，提高其水分含量達(dá)30%~50%;然后將預(yù)泡過(guò)的咖啡豆裝入萃取罐，不斷往罐中送入CO2(操作濕度70~90℃，壓力16-20MPa，密度0.4~0.65g/cm2)，咖啡因就逐漸被萃取出來(lái)。帶有咖啡因的CO2被送往清洗罐，使咖啡因轉(zhuǎn)入水相。然后水相中咖啡因用蒸餾法加以回收，CO2那么循環(huán)使用。10小時(shí)，經(jīng)SFE處理后的咖啡豆中咖啡因含量從0.7-3%降低到0.02%。實(shí)例2：啤酒花萃取啤酒花中的有用成份是揮發(fā)性油和軟樹(shù)脂中的葎草酮及α-酸采用超臨界流體萃取法制造啤酒浸膏時(shí)，首先把啤酒花磨成粉狀，使之更易與溶劑接觸。然后裝入萃取罐，密封后通入超臨界CO2，操作溫度35~38℃，壓力8~30MPa。到達(dá)萃取要求后，浸出物隨CO2一起被送至別離罐，經(jīng)過(guò)降壓別離得到含浸膏99%的黃綠色產(chǎn)物。據(jù)報(bào)道，雖然用超臨界法萃取啤酒花的本錢(qián)較常規(guī)溶劑處理法的本錢(qián)高，但用前者得到的是高質(zhì)量、富含風(fēng)味物的浸膏，同時(shí)防止了使用可能致癌的化學(xué)物質(zhì)。實(shí)例3：萃取制備天登煙凈油天登煙是云南大理州地區(qū)所種植生產(chǎn)的一種獨(dú)特的煙草品種，其色、香、味、狀都獨(dú)具特色，屬于云南地區(qū)的地方品種晾曬煙。天登煙是一種特色化的天然香料原料，所以選擇其作為原料，試驗(yàn)開(kāi)發(fā)特色化的煙草香料產(chǎn)品。天登煙凈油含有大量的煙草特征致香成份如：茄酮、BETA-大馬酮、BETA-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮、ALPHA-紫羅蘭醇、茄那士酮、新植二烯、六氫金合歡酮等，這些成份是煙草煙氣香味重要的特征成份。使用超臨界CO2流體萃取制備天登煙凈油500g天登煙葉原料樣品與80g夾帶溶劑混合后填裝入萃取裝置。萃取溫度45℃，壓力25 Mpa，夾帶溶劑添加量0.5ml/min，流體流速5L/h，萃取時(shí)間3h。萃取物進(jìn)行枯燥脫水，減壓蒸餾除去溶劑后，濃縮物即為天登煙凈油。實(shí)驗(yàn)局部

超臨界CO2流體萃取天登煙葉得到提取物為黃褐色溶液。進(jìn)行減壓蒸餾濃縮物為紅褐色澄清透亮的半膏體。凈油得率為3.6-4.3%。作業(yè)：第五章

1.概念：溶劑萃取，反萃取，物理萃取，化學(xué)萃取，浸取，乳化

2.工業(yè)上溶劑萃取的操作方式分別有哪幾種？試簡(jiǎn)述其區(qū)別。3.常用的去乳化方法有哪些？4.利用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液中的放線菌素D,pH3.5時(shí)分配系數(shù)K=57。采用三級(jí)錯(cuò)流萃取,令料液體積為450l/h,三級(jí)萃取劑流量之和為39l/h。分別計(jì)算L1=L2=L3=13l/h和L1=20,L2=10,L3