促紅細胞生成素通過抑制內質網(wǎng)應激保護神經(jīng)元和血腦屏障的缺血后損傷

促紅細胞生成素通過抑制內質網(wǎng)應激保護神經(jīng)元和血腦屏障的缺血后損傷目的近年來研究發(fā)現(xiàn)，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）可以對腦缺血組織具有神經(jīng)保護作用，然而EPO很難通過血腦屏障，需要大劑量全身注射，由此產(chǎn)生嚴重的副作用限制了缺血性卒中患者的臨床應用。因此，本實驗建立了一種新的用藥策略，探討EPO聯(lián)合tPA（tissueplasminogenactivator，tPA）治療對大鼠腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷的保護作用以及作用途徑和機制，為缺血性卒中防治提供新思路。方法選用成年雄性SD（Sprague–Dawley）大鼠54只，隨機分為假手術組、模型組、EPO組、tPA組、EPO+tPA組、salubrinal組，制備大鼠腦I/R模型，采用大腦中動脈局部注射（middlecerebralarteryinfusion，MCAI）EPO（800IU/kg）的方法，tPA（10mg/kg）經(jīng)尾靜脈注射，salubrinal提前30min腹腔注射，模型組經(jīng)MCAI注射相同體積的鹽水替代EPO。缺血2h后進行再灌注，再灌注24h對大鼠進行神經(jīng)行為學評分后處死，TTC（tetrazoliumchloride，TTC）染色計算梗死體積、腦水腫比例，Westernblot、免疫熒光方法檢測腦組織和腦微血管AQP4、caspase-3、緊密連接蛋白（tightjunctionprotein，TJP）claudin-5和occludin以及內質網(wǎng)應激（endoplasmicreticulumstress，ERS）相關蛋白GRP78、ATF6α和CHOP的表達。結果1、EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO減輕大腦I/R損傷：檢測腦梗死體積，腦水腫和神經(jīng)功能缺損評分，與模型組相比，單獨應用tPA對I/R損傷沒有任何作用；單獨應用EPO一定程度上減少了腦梗死體積，減輕了腦水腫和神經(jīng)功能缺損（P0.05）；EPO聯(lián)合tPA較單獨應用tPA明顯減輕I/R后腦梗死體積，腦水腫和神經(jīng)功能缺損（P0.05）。2、EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO減少I/R后AQP-4、caspase-3及ERS相關蛋白表達：Western-blot檢測AQP4和caspase-3表達結果顯示，模型組和單獨應用tPA的AQP4和caspase-3表達水平在I/R損傷后24h明顯升高（P0.05），而EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO明顯降低了AQP4和caspase-3的表達（P0.05）。Western-blot檢測GRP78和CHOP的表達結果顯示，I/R后模型組和單獨應用tPA的GRP78和CHOP表達明顯增高（P0.05），而EPO聯(lián)合tPA治療或單獨應用EPO明顯降低了GRP78和CHOP表達（P0.05）。3、EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO減少I/R后大腦微血管內緊密蛋白降解：Western-blot結果顯示I/R后模型組和單獨應用tPA的大腦微血管中Claudin-5和Occludin表達明顯減少（P0.05），而EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO明顯抑制了Claudin-5和Occludin表達降低（P0.05），免疫熒光染色結果顯示模型組和單獨應用tPA的Claudin-5和Occludin在內皮細胞上的表達明顯減少，而EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO明顯減少了Claudin-5和Occludin的降解。4、EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO抑制I/R后大腦微血管的ERS：Western-blot檢測大腦微血管內GRP78和CHOP的表達結果顯示，I/R后模型組和單獨應用tPA中的GRP78和CHOP的表達明顯增高（P<0.05），而EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO較tPA組明顯降低了GRP78和CHOP的表達（P<0.05）。5、EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO抑制腦組織和大腦微血管的ERS信號通路：Western-blot檢測腦組織和大腦微血管的ERS通路中CHOP上游蛋白ATF6α的表達，結果顯示在兩種組織中I/R后模型組和單獨應用tPA中的ATF6α的表達明顯增高（P<0.05），而EPO聯(lián)合tPA或單獨應用EPO明顯降低了ATF6α表達（P0.05）。結論1、EPO聯(lián)合tPA治療對大腦I