發(fā)酵工程下游加工過(guò)程概論

第十二章發(fā)酵工程下游加工過(guò)程簡(jiǎn)介一、發(fā)酵工程下游加工過(guò)程概論1、發(fā)酵工程下游加工過(guò)程的特點(diǎn)1〕所需產(chǎn)物在培育液中濃度較低，且穩(wěn)定性差2〕普遍存在下游工程代價(jià)高，回收率較低等問(wèn)題發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)2、發(fā)酵工程下游加工過(guò)程的普通程序廢品加工發(fā)酵液的預(yù)處置和過(guò)濾提取精制采用凝聚和絮凝技術(shù)加速固、液分別；如產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還要進(jìn)展細(xì)胞破碎提取〔初步純化〕目的是除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差別大的雜質(zhì)精制〔高度純化〕是采用對(duì)產(chǎn)品有高度選擇性的分別技術(shù)，除去與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)相近的雜質(zhì)最終獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品3、主要操作單元：絮凝離心過(guò)濾細(xì)胞破碎萃取沉淀層析結(jié)晶枯燥二、發(fā)酵液預(yù)處置和過(guò)濾為什么要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)展預(yù)處置？預(yù)處置的目的是什么？發(fā)酵液的根本特性產(chǎn)物濃度低具有極性黏度大外表張力大性質(zhì)不穩(wěn)定一〕發(fā)酵液的預(yù)處置1、目的：發(fā)酵液中雜質(zhì)多且成分復(fù)雜，其中對(duì)純化影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等改動(dòng)發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡能夠使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處置的相中；〔普通為液相〕可以除去部分雜質(zhì)。2、高價(jià)無(wú)機(jī)離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過(guò)濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時(shí)，可用草酸鈉取代；草酸價(jià)錢(qián)較高，消費(fèi)上普通需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子構(gòu)成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子構(gòu)成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+3、可溶性雜蛋白的去除雜蛋白的存在會(huì)降低離子交換樹(shù)脂和大網(wǎng)格樹(shù)脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會(huì)發(fā)生乳化，影響兩相分別。此外，在常規(guī)過(guò)濾和膜過(guò)濾時(shí)，還會(huì)使濾速下降，使膜遭到污染。1〕沉淀法調(diào)等電點(diǎn)因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍(pH4.0-5.5)但僅靠調(diào)等電點(diǎn)還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過(guò)氯酸鹽等構(gòu)成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽(yáng)離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等構(gòu)成沉淀2〕變性法變性蛋白溶解度較小最常用加熱法加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過(guò)濾速率；其他方法：大幅度調(diào)理pH，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或外表活性劑變性法存在一定的局限如加熱法只適用于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需耗費(fèi)大量酸堿，而有機(jī)溶劑法通常只適用于所處置的液體數(shù)量較少的場(chǎng)所。3〕吸附法參與某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去如四環(huán)素消費(fèi)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來(lái)吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，參與氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去凝聚和絮凝都是發(fā)酵液預(yù)處置的重要方法，其處置過(guò)程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改動(dòng)細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等粒子的分散形狀，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分別的絮凝體，再進(jìn)展分別。

發(fā)酵液預(yù)處置的方法—凝聚和絮凝凝聚指在投加的化學(xué)物質(zhì)〔如水解的凝聚劑：鋁、鐵的鹽類或石灰等〕作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過(guò)程。電解質(zhì)的凝聚才干可用凝聚值表示，即使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度〔mmol/L〕。普通反離子的價(jià)數(shù)越高，凝聚值越小，即凝聚才干越強(qiáng)。如Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

絮凝指運(yùn)用絮凝劑〔通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)〕將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，構(gòu)成10mm大小絮凝團(tuán)的過(guò)程。其中絮凝劑主要起架橋作用，工業(yè)上運(yùn)用到的有聚丙烯酰胺類衍生物、聚合鋁鹽、海藻酸鈉、殼聚糖等，目前最常用的是聚丙烯酰胺類衍生物。1〕板框(plateandframe)壓濾機(jī)板框過(guò)濾機(jī)構(gòu)造圖1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓安裝二〕發(fā)酵液過(guò)濾常用設(shè)備板框過(guò)濾機(jī)

Plateshifter1500x1500FilterPressClothwashing1〕板框(plateandframe)壓濾機(jī)2〕帶式壓濾機(jī)二〕發(fā)酵液過(guò)濾常用設(shè)備發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進(jìn)展補(bǔ)料，防止消泡劑和未用完的培育基添加過(guò)濾難度；菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物添加發(fā)酵液黏度影響發(fā)酵液過(guò)濾的要素1〕菌體細(xì)胞體積真菌菌絲體較粗大，發(fā)酵液不需特殊處置，易過(guò)濾；放線菌菌絲細(xì)而分支，交錯(cuò)成網(wǎng)格狀，較難過(guò)濾，發(fā)酵液需經(jīng)預(yù)處置，凝固蛋白質(zhì)等膠體物質(zhì)，提高過(guò)濾速度；細(xì)菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預(yù)處置，很難用常規(guī)過(guò)濾設(shè)備進(jìn)展過(guò)濾操作。2〕培育基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會(huì)添加過(guò)濾難度3〕放罐時(shí)機(jī)當(dāng)發(fā)酵液中有不溶性多糖時(shí)，會(huì)使發(fā)酵液的黏度增大而影響過(guò)濾速度；可用酶將其轉(zhuǎn)化成可溶性單糖，提高濾速。提高過(guò)濾性能的方法1〕加助濾劑助濾劑是一種不可緊縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而添加濾速；常用硅藻土、珍珠巖等；參與方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑參與發(fā)酵液中。2〕添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3〕酶解法〔沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶〕發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分別細(xì)胞破碎細(xì)胞分別高度純化廢品加工預(yù)處置胞外產(chǎn)物〔加熱、調(diào)pH、絮凝〕〔過(guò)濾、離心分別、膜分別)〔勻漿、研磨、酶解〕〔離心分別、雙水相萃取、膜分別〕〔重結(jié)晶、離子交換、色譜分別、膜分別〕〔濃縮、無(wú)菌過(guò)濾、枯燥、成型〕胞內(nèi)產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品的收得率和質(zhì)量控制。細(xì)胞破碎目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細(xì)胞內(nèi)的，特別是基因工程菌在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)成的包含體是不分泌的，故需進(jìn)展細(xì)胞破碎。大規(guī)模破碎細(xì)胞常用方法；利用高壓使細(xì)胞懸液經(jīng)過(guò)針型閥，由于忽然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)，呵斥細(xì)胞破碎。影響破碎的主要要素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)1〕高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2〕高速球磨法高速球磨機(jī)1-物料進(jìn)口2-物料出口3、4-冷卻水進(jìn)、出口5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤(pán)的高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一同快速攪拌或研磨，使細(xì)胞得以破碎。3〕超聲波法常用超聲波頻率15-25kHz；原理：由于超聲波產(chǎn)生極為劇烈的沖擊波壓力，引起黏滯性旋渦在介質(zhì)中的細(xì)胞上呵斥了剪切力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，呵斥細(xì)胞破碎；超聲波振蕩易引起溫度的猛烈上升，操作時(shí)需冷卻；通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽(yáng)性菌易破4〕酶解法專注性強(qiáng)，條件溫暖；但費(fèi)用較高酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解本身細(xì)胞壁的酶；當(dāng)改動(dòng)一定的環(huán)境條件，可誘發(fā)這種酶的過(guò)量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶景象。5〕浸透壓沖擊法將細(xì)胞先放入高浸透壓的介質(zhì)中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在到達(dá)平衡后，介質(zhì)忽然被稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，水就會(huì)迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞膨脹，引起細(xì)胞壁的破裂；此法適用于細(xì)胞壁較脆弱的，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處置的，或細(xì)胞壁合成遭到抑制的微生物；6〕反復(fù)凍結(jié)-融化法將細(xì)胞反復(fù)在低溫下忽然冷凍后在室溫下融化，引起細(xì)胞破裂；低溫冷凍一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵構(gòu)造斷裂，從而添加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度發(fā)生變化，引起細(xì)胞忽然膨脹而破裂。該法適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞細(xì)胞破碎方法二、提取〔初步分別〕〔一〕沉淀法〔Precipitation〕沉淀是經(jīng)過(guò)改動(dòng)條件或參與某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龅倪^(guò)程。方法簡(jiǎn)單、本錢(qián)低、運(yùn)用廣泛，初步分別的常用手段。鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法生成鹽復(fù)合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法中性鹽的參與能破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)的溶解度降低而析出。1.鹽析法(Saltingout)破壞了蛋白質(zhì)在水中存在的兩個(gè)要素(水化層和電荷),從而使蛋白質(zhì)沉淀。將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子〔如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水〞，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶景象〔比在純水中的溶解度大大添加〕；高鹽濃度那么鹽析，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低；由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)理混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

1〕蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分別的蛋白質(zhì)經(jīng)常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一同沉淀出來(lái)〔共沉景象〕。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。2〕離子強(qiáng)度和種類3〕溫度溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要要素，升高溫度可以添加許多無(wú)機(jī)鹽和小分子有機(jī)化合物的溶解度；4〕pH由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)最易沉淀，故可選擇等電點(diǎn)的pH作為鹽析pH影響鹽析的要素2.等電點(diǎn)沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在電中性時(shí)溶解度最低優(yōu)點(diǎn)：許多蛋白的等電點(diǎn)都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無(wú)機(jī)酸的價(jià)錢(qián)低廉；缺陷：酸化時(shí)易引起蛋白失活不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會(huì)發(fā)生等電點(diǎn)偏移，如胰島素的等電點(diǎn)為5.3，在與Zn2+結(jié)合構(gòu)成胰島素鋅鹽，其等電點(diǎn)升為6.2；故參與金屬離子后選擇等電點(diǎn)沉淀時(shí)，要留意調(diào)整pH。二、提取〔初步分別〕〔二〕結(jié)晶法〔crystallization〕物質(zhì)從液態(tài)〔液體或熔融體〕或氣態(tài)構(gòu)成晶體的過(guò)程叫結(jié)晶。參與能使結(jié)晶溶質(zhì)溶解度降低的物質(zhì)，讓結(jié)晶溶質(zhì)構(gòu)成過(guò)飽和液；例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脫色液中參與終濃度為60%-80%的乙醇，就結(jié)晶析出;在普魯卡因青霉素結(jié)晶時(shí)，參與一定量的食鹽，可使結(jié)晶更易析出結(jié)晶方法〔過(guò)飽和溶液構(gòu)成的方法〕1〕濃縮結(jié)晶減壓蒸發(fā)濃縮，到達(dá)過(guò)飽和2〕冷卻結(jié)晶適用于溶解度隨溫度變化很大的物質(zhì)；先加熱使其溶解，然后冷卻結(jié)晶；3〕化學(xué)反響結(jié)晶參與反響劑或調(diào)pH，使生成更低可溶性物質(zhì)；如在青霉素醋酸丁酯提取液中，參與乙醇-醋酸鉀，因構(gòu)成的青霉素鉀鹽難溶于醋酸丁酯而結(jié)晶析出。4〕解析結(jié)晶〔drowningout〕三、精制〔高度純化〕〔一〕離子交換法(Ionexchange)離子交換任務(wù)原理根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽(yáng)離子不同，電荷不同的物質(zhì)對(duì)層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改動(dòng)洗脫液的離子強(qiáng)度或pH，不同物質(zhì)就能依次從層析柱中分別出來(lái)。在離子交換過(guò)程中，離子首先分散到樹(shù)脂外表，經(jīng)過(guò)樹(shù)脂分散到交換位置，在交換位置進(jìn)展離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹(shù)脂的結(jié)合越嚴(yán)密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子分散到樹(shù)脂外表，洗脫液經(jīng)過(guò)，被交換的離子分散到外部溶液中。三、精制〔高度純化〕〔二〕色譜分別法用微量注射器針頭或微細(xì)管把樣品點(diǎn)一小點(diǎn)在層