出血性卒中致腦組織纖維化機(jī)制實(shí)驗(yàn)與臨床研究

出血性卒中致腦組織纖維化機(jī)制實(shí)驗(yàn)與臨床研究研究背景、目的及意義轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β₁（Transforminggrowthfactorbeta1，TGF-β₁）是近十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與機(jī)體許多生理病理過(guò)程、啟動(dòng)和終止組織損傷修復(fù)的一種主要細(xì)胞因子。人體組織器官纖維化的病理基礎(chǔ)是膠原的合成和沉積，TGF-β₁通過(guò)刺激膠原基因過(guò)度表達(dá)及其自分泌調(diào)控等多種機(jī)制在纖維化病變過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。大量周?chē)M織損傷研究表明，正常低水平表達(dá)的TGF-β₁出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）過(guò)度產(chǎn)生與沉積而成為許多慢性疾病如腎小球硬化、肝纖維化、肺纖維化、硬皮病等疾病的致病因子。近年來(lái)TGF-β₁過(guò)度表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralneuralsystem，CNS）損傷后的炎性反應(yīng)、組織纖維增生及膠質(zhì)瘢痕形成中的重要作用也逐漸受到關(guān)注，尤其是蛛網(wǎng)膜下腔出血后并發(fā)交通性腦積水者。交通性腦積水發(fā)生機(jī)制依然不明，除了先天性與原因不明外，大多并發(fā)于蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoidhemorrhage，SAH）與CNS感染。出血及炎性變使腦膜廣泛纖維化粘連致腦脊液回吸收受阻、蛛網(wǎng)膜粒變性致腦脊液回靜脈通路受阻是較為認(rèn)可的病理機(jī)制，但腦膜纖維化發(fā)生機(jī)制及腦脊液循環(huán)與重吸收途徑至今不甚明了。Maillot等提出了腦脊液引流的上行途徑（顱蛛網(wǎng)膜下腔途徑）、淋巴途徑和靜脈途徑，后兩條途徑雖無(wú)確切的形態(tài)學(xué)證據(jù)，但是注入到椎管內(nèi)的藥物很快以高濃度出現(xiàn)在靜脈系統(tǒng)的事實(shí)，提示從腦脊液到靜脈系統(tǒng)之間有直捷通道存在。腦脊液無(wú)論經(jīng)何種途徑吸收，蛛網(wǎng)膜下腔腦膜組織都是腦脊液與靜脈系統(tǒng)間建立循環(huán)與重吸收的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)組織。目前，對(duì)其生理及病理學(xué)改變?nèi)源嬗性S多未知，尤其是在遭受出血及炎癥侵襲時(shí)腦膜纖維化病理改變發(fā)生機(jī)制不明。隨著周?chē)M織纖維化機(jī)制的不斷深入研究，以TGF-β₁為主要細(xì)胞因子參與的組織損傷與修復(fù)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制被不斷認(rèn)識(shí)，TGF-β₁在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用也開(kāi)始被人們所關(guān)注。已發(fā)現(xiàn)在腦出血、SAH、腦缺血與缺氧等疾病中，TGF-β₁有明顯異常表達(dá)，有報(bào)道重組TGF-β₁鞘內(nèi)注射及轉(zhuǎn)基因大鼠均發(fā)生腦脊液引流障礙，表明該因子在腦積水形成中的重要作用。膠質(zhì)疤痕是CNS受損或病理過(guò)程的普遍性結(jié)果，其致密屏障可阻礙神經(jīng)軸突再生及功能重建。隨著神經(jīng)干細(xì)胞移植的深入研究，許多問(wèn)題亟待解決，神經(jīng)細(xì)胞的再生阻礙也漸為人所關(guān)注。星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，As）是組成膠質(zhì)疤痕的主要膠質(zhì)細(xì)胞成分，在遭受損傷后，可產(chǎn)生各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，包括TGF-β₁。因TGF-β₁的生理功能多樣，直接抑制會(huì)導(dǎo)致許多負(fù)面效應(yīng)，而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）是介導(dǎo)TGF-β₁促纖維化作用的一個(gè)重要的下游因子，生物學(xué)效應(yīng)單一，直接抑制它的表達(dá)也許可以避免在TGF-β₁上游阻斷帶來(lái)的副作用。因此，CTGF可能作為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療CNS疾病中抑制膠質(zhì)增生負(fù)性作用的靶點(diǎn)。凝血酶是血腫成分中最特殊的物質(zhì)，隨著不同凝血酶受體相繼發(fā)現(xiàn)，凝血酶被當(dāng)作一種細(xì)胞外信號(hào)分子，具有廣泛的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，凝血酶對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)與毒性雙重作用與出血量密切相關(guān)而在出血性腦損傷中倍受關(guān)注。用小劑量凝血酶（1～2u／ml）預(yù)處理可明顯保護(hù)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞免受低血糖、缺血缺氧等損傷引起的細(xì)胞死亡；較高濃度的凝血酶可使神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突退變，軸突回縮、細(xì)胞聚集，膠質(zhì)細(xì)胞星形化受阻，并破壞細(xì)胞間的相互作用以及和毛細(xì)血管間的聯(lián)系；而微克分子濃度的凝血酶便可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞程序性死亡；加入水蛭素（hirudin）、蛋白酶連素-1等凝血酶特異性抑制物時(shí)，這些效應(yīng)會(huì)逆轉(zhuǎn)。在周?chē)M織研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶和TGF-β₁共同介導(dǎo)對(duì)SMalphA基因的表達(dá)增加，造成人成纖維母細(xì)胞過(guò)度分化，刺激腎近曲小管上皮細(xì)胞分泌和產(chǎn)生金屬蛋白酶，促進(jìn)Ⅳ型膠原合成，而在中樞組織方面的相關(guān)性研究未見(jiàn)報(bào)道。探討凝血酶在出血性腦血管病中與TGF-β₁的相關(guān)性，研究在中樞組織損傷修復(fù)中的作用，并在此層面進(jìn)行有效抑制，不僅為防治SAH后交通性腦積水找到有效的作用靶點(diǎn)，也可能成為治療腦細(xì)胞水腫、炎性改變、膠質(zhì)瘢痕形成共同的作用靶點(diǎn)。周?chē)M織有研究表明細(xì)胞因子TGF-β₁在皮膚增生性瘢痕形成中起到相當(dāng)重要的作用，它可增加膠原基因的轉(zhuǎn)錄及膠原合成，而糖皮質(zhì)激素可通過(guò)多種途徑抑制膠原的轉(zhuǎn)錄、合成。但有關(guān)糖皮質(zhì)激素作用的確切分子生物學(xué)機(jī)制及與TGF-β₁之間的相互關(guān)系仍不明確。Ghahary等以膠原基因的調(diào)控序列為研究對(duì)象，在轉(zhuǎn)錄水平探討地塞米松與TGF-β₁之間的相互作用及對(duì)人a1（Ⅰ）前膠原基因啟動(dòng)活性的影響。實(shí)驗(yàn)顯示：在正常成纖維細(xì)胞中，TGF-β₁能明顯上調(diào)Ⅰ膠原基因的啟動(dòng)活性，而地塞米松則能顯著抑制Ⅰ膠原基因的啟動(dòng)活性，提示它們能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Ⅰ膠原基因的轉(zhuǎn)錄，這與它們?cè)谀z原基因mRNA水平的作用相一致。同時(shí)，地塞米松能拮抗TGF-β₁對(duì)人a1（Ⅰ）前膠原基因啟動(dòng)活性的上調(diào)作用，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步證實(shí)了Meisler的研究。由此可見(jiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平地塞米松抗纖維化作用不僅表現(xiàn)為能直接抑制膠原基因的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，而且能拮抗TGF-β₁的致纖維化作用。廣泛纖維化、膠質(zhì)增生是CNS損傷的標(biāo)志，研究TGF-β₁在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的異常表達(dá)機(jī)制，探討CNS組織損傷后纖維化修復(fù)機(jī)制。利用RT-PCR、Western-blotting、RNA干擾、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)技術(shù)，研究TGF-β₁、凝血酶等對(duì)大鼠星形細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、軟腦膜纖維化、星形細(xì)胞的CTGF表達(dá)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）表達(dá)等；提出凝血酶可能作為啟動(dòng)因子參與TGF-β₁的過(guò)度表達(dá)，可能由TGF-β₁誘導(dǎo)，CTGF介導(dǎo)星形細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化理論；揭示組織纖維化機(jī)制，償試解決神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中的再生阻礙及組織纖維化粘連中的關(guān)鍵問(wèn)題，為防治中樞組織粘連性疾病如交通性腦積水（communicatinghydrocephalus）等尋找新思路，為促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞移植軸突的再生修復(fù)、抑制膠質(zhì)膠質(zhì)瘢痕的負(fù)性作用、最大限度地保存和恢復(fù)神經(jīng)功能尋找有效的干預(yù)位點(diǎn)。目的1．研究凝血酶與TGF-β₁過(guò)度表達(dá)的相關(guān)性，探討SAH后交通性腦積水的發(fā)生機(jī)制。2．研究TGF-β₁對(duì)培養(yǎng)的新生SD大鼠星形細(xì)胞膠質(zhì)化及CTGF表達(dá)的影響。采用體外培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，以TGF-β₁為刺激因子，建立腦損傷的細(xì)胞模型，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以及該細(xì)胞骨架蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）與CTGF基因翻譯水平和蛋白質(zhì)合成水平的變化，探討CNS損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)化的發(fā)生機(jī)制。3．研究SAH后腦室擴(kuò)大的影像學(xué)改變，探討地塞米松蛛網(wǎng)膜下腔炎性抑制對(duì)交通性腦積水發(fā)生的預(yù)防作用。方法1．選用體重200g～300g雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組21只，對(duì)照組15只。采用經(jīng)枕骨大孔蛛網(wǎng)膜下腔注藥法。實(shí)驗(yàn)組大鼠用10％水合氯醛（3ml／kg）腹腔麻醉，取側(cè)臥頭低體位，經(jīng)枕骨大孔穿刺成功抽出0.2ml腦脊液后，將大鼠凝血酶（3u，0.3ml）注入蛛網(wǎng)膜下腔。完成后拔針，按壓穿刺點(diǎn)3min并保持頭低位30min，后放入鼠籠觀察。對(duì)照組大鼠用0.3ml生理鹽水替代大鼠凝血酶以相同方法注入蛛網(wǎng)膜下腔。按照注入藥物后的時(shí)間點(diǎn)1d，10d和20d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各又隨機(jī)分為3組。各組大鼠到達(dá)相應(yīng)時(shí)間后再次麻醉，分別留取各大鼠腦脊液200μl，即刻以2000r／min離心20min，取上清液置于-60℃冰箱保存待測(cè)。然后即刻打開(kāi)胸腔，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管，剪開(kāi)右心耳引流，用生理鹽水沖洗至引流液清亮，以4％多聚甲醛液（4℃，pH7.4）緩慢灌注固定約30min，取腦浸入4％多聚甲醛固定液中，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，每份標(biāo)本經(jīng)額、頂、枕部作冠狀切片，切片厚度5μm。采用Masson’s三重染色后封固。將組織于40×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察，并用計(jì)算機(jī)顯微圖像采集分析系統(tǒng)進(jìn)行分析測(cè)量軟腦膜平均厚度。使用大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子定量ELISA試劑盒，按使用說(shuō)明測(cè)定腦脊液TGF-β₁濃度。2．體外培養(yǎng)大鼠星形細(xì)胞：參照McCarthy的培養(yǎng)方法并加以改良，多次差速粘附處理及傳代，傳三代，進(jìn)行GFAP免疫熒光染色鑒定細(xì)胞。用不同濃度TGF-β₁孵育培養(yǎng)As24h，倒置相差顯微鏡下觀察As形態(tài)，半定量RT-PCR測(cè)GFAPmRNA的相對(duì)表達(dá)量，Western-blotting進(jìn)行GFAP蛋白定量，觀察TGF-β₁誘導(dǎo)As反應(yīng)性膠質(zhì)化。對(duì)不同濃度TGF-β₁孵育培養(yǎng)的反應(yīng)性膠質(zhì)化As，半定量RT-PCR測(cè)CTGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量，Western-blotting進(jìn)行CTGF蛋白定量，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平研究TGF-β₁對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞CTGF表達(dá)的影響。3．按急性期CT顯示蛛網(wǎng)膜下腔的出血量參照Hijdra方法評(píng)分，選取積分為4分以上的SAH患者，常規(guī)治療組（對(duì)照組）和常規(guī)治療加地塞米松鞘內(nèi)注射組（治療組），分別于病程的初期和20d后在頭顱CT上行腦室各值測(cè)量，包括哈（Huckman）氏值、三腦室寬度、側(cè)腦室體寬度和最大顱內(nèi)橫徑，并計(jì)算前角指數(shù)和側(cè)腦室體寬指數(shù)。4．采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以（?）±s表示，采用析因方差分析，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用單向方差分析，各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；腦脊液TGF-β₁濃度（pg／ml）與軟腦膜平均厚度（μm）兩項(xiàng)指標(biāo)間采用線性相關(guān)分析；不同濃度TGF-β₁致GFAPmRNA、CTGFmRNA及蛋白表達(dá)量變化采用單因素方差分析，組間采用LSD法多重比較；影像學(xué)資料分析組內(nèi)病程前后對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間病程前后對(duì)比采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。結(jié)果1．大鼠腦脊液TGF-β₁濃度值檢測(cè)結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示，腦脊液TGF-β₁濃度值實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有顯著性（F=60.743，P=0.000）；不同時(shí)間之間差異無(wú)顯著性（F=0.128，P=0.881）；組別同時(shí)間兩因素?zé)o交互作用（F=1.223，P=0.309），即兩組隨時(shí)間變化趨勢(shì)差異不顯著。實(shí)驗(yàn)組1d、10d、20d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組所測(cè)腦脊液TGF-β₁濃度分別是239.02±129.40、309.07±57.30、283.16±128.87（pg／ml），與各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，分別經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯示差異均有顯著性意義（P均＜0.05），實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組。各組內(nèi)不同時(shí)間之間比較，經(jīng)onewayANOVA分析，對(duì)照組內(nèi)腦脊液TGF-β₁濃度隨時(shí)間變化有差異，經(jīng)LSD法組間多重比較，第1d組高于第10d和第20d組?？赡転榇┐虛p傷，血液破入蛛網(wǎng)膜下腔，血小板釋放TGF-β₁所致，如圖1所示，而實(shí)驗(yàn)組內(nèi)腦脊液TGF-β₁呈持續(xù)高濃度（表1）。2．大鼠軟腦膜平均厚度值測(cè)定結(jié)果經(jīng)析因方差分析顯示，軟腦膜平均厚度值實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有顯著性（F=32.178，P=0.000）：不同時(shí)間之間差異有顯著性（F=9.763，P=0.001）；組別同時(shí)間兩因素有交互作用（F=6.798，P=0.004），即兩組隨時(shí)間變化趨勢(shì)是不同的。實(shí)驗(yàn)組軟腦膜平均厚度值在1d、10d、20d三個(gè)時(shí)間點(diǎn)組所測(cè)值分別為3.68±0.43、4.29±0.52、5.67±0.77（μm），與各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，分別經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，除了1d外（t=0.564，P=0.585），其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，兩組間差異均有顯著性意義（P均＜0.001），實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組（表2）。各組內(nèi)不同時(shí)間之間比較，經(jīng)onewayANOVA分析，顯示軟腦膜平均厚度值實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間之間有顯著差異（F=20.858，P=0.000）；經(jīng)過(guò)LSD法組間多重比較，20d組高于1d組和10d組。如圖1-2所示，10d組、20d組軟腦膜平均厚度值的增加隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸明顯。3．經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示腦脊液TGF-β₁濃度和軟腦膜平均厚度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系（r_s=0.541，P=0.001）。4．經(jīng)過(guò)處理培養(yǎng)的細(xì)胞傳三代，進(jìn)行GFAP