研究生開題報(bào)告

苜?；ㄈ~病毒自然群體分子遺傳結(jié)構(gòu)分析開題報(bào)告01選題依據(jù)

文獻(xiàn)綜述0203技術(shù)路線04預(yù)期結(jié)果05

進(jìn)度安排目錄CONTENTS06已開展的研究工作選題依據(jù)選題依據(jù)苜蓿是全世界最重要的豆科牧草,被譽(yù)為“牧草之王〞。具有產(chǎn)草量高、草質(zhì)優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富，而且種植規(guī)模大。目前，我國(guó)苜蓿種植面積居各種牧草之首，達(dá)7000多萬(wàn)畝，居世界第2位。我國(guó)苜蓿種植面積的不斷擴(kuò)大，為病害大面積發(fā)生和流行創(chuàng)造了有利條件。其中苜?；ㄈ~病毒引起的苜?；ㄈ~病害在苜蓿病毒病中為主流種。選題依據(jù)AMV的基因組結(jié)構(gòu)AMV病毒侵染的苜蓿病癥電鏡下ＡＭＶ病毒粒子的形態(tài)2023年河北滄州苜?；ㄈ~病危害嚴(yán)重文獻(xiàn)綜述文獻(xiàn)綜述植物病毒分子群體遺傳結(jié)構(gòu)分析遺傳變異是在基因組復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)錯(cuò)誤而產(chǎn)生的。理論上講，所有病毒都具有產(chǎn)生大量具多樣性的種群的潛能。病毒在所有生物中具有最快的變異速度，尤其是RNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒，因?yàn)槠浠蚪M的一個(gè)特點(diǎn)是在它們的復(fù)制及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中存在易于發(fā)生錯(cuò)誤的復(fù)制過(guò)程。遺傳多樣性作為一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程至少有兩個(gè)階段組成:1)在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中的變異產(chǎn)生。2)突變體在寄主細(xì)胞內(nèi)、在整個(gè)生物體中以及在侵染擴(kuò)散過(guò)程中的命運(yùn)。這兩個(gè)過(guò)程的發(fā)生和驅(qū)動(dòng)機(jī)制是完全不同的。突變的產(chǎn)生從本質(zhì)上說(shuō)是一個(gè)隨機(jī)事件，而單個(gè)變異體的命運(yùn)那么取決于它們?cè)谌后w中的適合度〔或者產(chǎn)生侵染性后代的能力〕(Domingo，1996)。

文獻(xiàn)綜述

植物RNA病毒變異的來(lái)源有突變、同源或非同源重組、多分體病毒間基因組片段的重排。植物DNA病毒群體的遺傳變異和進(jìn)化的研究報(bào)道目前是相當(dāng)少的。但是關(guān)于植物DNA病毒的突變率還是得到了證實(shí)—每循環(huán)一次是10-3個(gè)核苷酸(Drake，1998)。在病毒群體遺傳結(jié)構(gòu)分析法中，同源性序列分析，基因組排列順序、基因組的基因組成、外界環(huán)境對(duì)基因的影響以及系統(tǒng)進(jìn)化樹等的分析是研究的主要方面。主要利用MEGA、DNAsp、RDP和BEAST等。最早被描述的植物病毒種群遺傳結(jié)構(gòu)是煙草輕型綠花葉病毒(TMGMV)(Rodrygueze等，1998)。Vivesm等(2002)報(bào)道柑橘皰葉病毒(CLBV)的西班牙種群遺傳多樣性在已報(bào)道的植物病毒中最低，這可能因?yàn)镃LBV在西班牙屬于單一起源，并且剛引進(jìn)。

文獻(xiàn)綜述2023年-至今，本實(shí)驗(yàn)室的吳蓓蕾老師利用生物信息學(xué)對(duì)麥類病毒群體的分子進(jìn)行了大量的研究，取得了很大的進(jìn)展〔Parizipouretal.,2023virusgenes；Wuetal.,2023ScientificReport；Wuetal.,2023PLosone；Wuetal.,2023BMCbiologyevolution〕。利用MEGA、RDP、DNAsp和BEAST等軟件，發(fā)現(xiàn)WDV和BYDV群體存在豐富的多樣性；兩個(gè)群體重組現(xiàn)象普遍〔Wuetal.,2023ScientificReport；Wuetal.,2023PLosone〕，其中WDV群體的重組子類型主要有三種，重組主要集中在Rep、cp和mp的邊界以及Rep、cp和SIR的內(nèi)部〔Wuetal.,2023〕。Wuetal.,2023BMCbiologyevolution文獻(xiàn)綜述在共分化的條件下，計(jì)算出進(jìn)化速度為10-8替代/點(diǎn)/年，發(fā)現(xiàn)玉米線條病毒屬病毒與其相應(yīng)的寄主共分化超過(guò)5千萬(wàn)年，但該推論適合于小麥矮縮病毒，并不適合于玉米線條病毒及其它非洲的條紋病毒〔Wuetal.,2023〕，利用CAPS軟件對(duì)WDV病毒各個(gè)蛋白內(nèi)的共進(jìn)化位點(diǎn)與蛋白間結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分析，以及這些位點(diǎn)所處的選擇壓力狀態(tài)、群體的重組位點(diǎn)與共進(jìn)化位點(diǎn)的是否重合等的解析，獲得了兩個(gè)群體的分化差異特點(diǎn)以及各個(gè)蛋白的進(jìn)化特點(diǎn)。利用I-TASSER軟件，預(yù)測(cè)WDV-W、WDV-B和ODV群體內(nèi)各個(gè)蛋白與其他蛋白的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)(Wuetal.,2023ScientificReport〕。這為通過(guò)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)來(lái)研究蛋白間互作奠定了根底。Wuetal.,2023ScientificReport自1949年AMV第一次在三葉草上報(bào)道以來(lái)，國(guó)外許多研究者已較早對(duì)其電鏡下病毒粒子形態(tài)及理化性質(zhì)、寄主范圍、病毒的別離及提純等做了深入研究。1987年我國(guó)的魏寧生、李毅從西北農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的白三葉草上別離得到了AMV，并進(jìn)行了進(jìn)一步研究；1994年陳集雙等在白三葉草上也別離到了AMV，并且他們別離到的AMV與Kreitlow等報(bào)道的黃色塊斑株系相類似。Parrella等〔2000〕和Xu等〔2006〕研究指出AMV的分子群體可以依據(jù)地域劃分為不同的類群，說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中受到地域的限制影響，但研究中使用的別離物的數(shù)據(jù)量少，缺乏以深刻說(shuō)明AMV的分子進(jìn)化特點(diǎn)。Bergua〔2023〕集合60個(gè)別離物進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化研究，指出AMV的分子群體遺傳結(jié)構(gòu)存在多樣性，依據(jù)RNA1的核苷酸序列可以劃分為兩大類群，同時(shí)RNA3也可依據(jù)核苷酸序列劃分為兩大類群，法國(guó)、意大利、西班牙、美國(guó)、加拿大和贊比亞等國(guó)都有這兩大類群的分布；序列分析發(fā)現(xiàn)該病毒的三分體基因組間存在豐富的重組現(xiàn)象。但是這個(gè)重組現(xiàn)象到底是什么樣的？我國(guó)AMV群體的分子進(jìn)化具有什么樣的特點(diǎn)？。苜?；ㄈ~病毒研究進(jìn)展：文獻(xiàn)綜述

本研究擬連續(xù)2年在我國(guó)不同地域的苜蓿生態(tài)區(qū)采集AMV樣本，進(jìn)行基因組測(cè)序與分子群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，獲得自然群體的多樣性和變異特點(diǎn)；從而解析AMV自然群體分子進(jìn)化的特點(diǎn)與機(jī)制。同時(shí)為我國(guó)苜蓿花葉病毒病害的預(yù)警和防治提供理論和技術(shù)支撐。技術(shù)路線技術(shù)路線苜?；ㄈ~病毒自然群體分子遺傳結(jié)構(gòu)分析自然群體的采集與分析我國(guó)不同生態(tài)區(qū)連續(xù)兩年采集AMV樣本基因組序列測(cè)定，利用MEGA、DNAsp、RDP和BEAST等軟件進(jìn)行核苷酸與氨基酸變異動(dòng)態(tài)統(tǒng)計(jì)分析AMV變異位點(diǎn)，變異區(qū)段以及蛋白結(jié)構(gòu)的變化解析AMV自然群體遺傳結(jié)構(gòu)的變異特點(diǎn)預(yù)期結(jié)果

1首次在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)各個(gè)苜蓿產(chǎn)區(qū)進(jìn)行苜?；ㄈ~病毒病害的調(diào)查，得到苜?；ㄈ~病毒在我國(guó)不同種植區(qū)的發(fā)病情況。2獲得大量的AMV基因組全序列。

3從分子結(jié)構(gòu)上解析得到析該病毒的進(jìn)化特點(diǎn)與進(jìn)化機(jī)制。預(yù)期結(jié)果進(jìn)度安排計(jì)劃進(jìn)度2017年3月—4月做準(zhǔn)備工作，準(zhǔn)備試驗(yàn)材料和試劑等用品并進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。查閱文獻(xiàn)資料，撰寫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2017年5月—8月在黑龍江、內(nèi)蒙、新疆、云南、河北、四川，西藏等地區(qū)采集樣品并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行基因組序列測(cè)定。2017年9月—12月繼續(xù)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行基因組序列測(cè)定。2018年1月—2月整理數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。2018年3月撰寫論文，準(zhǔn)備答辯已開展的研究工作已開展的研究工作圖注：圖中省份后寫的數(shù)字代表2023年采集疑似AMV的樣品數(shù)，箭頭所指的省份〔紫色〕代表我們方案中將要采集樣品的生態(tài)區(qū)。2023-2023年間苜蓿病毒病害樣品采集方案表采樣地類型河北滄州寧夏吳忠錫林浩特安徽新疆樣品數(shù)2648122127AMV26431287陽(yáng)性率100%90%100%38%30%我國(guó)5個(gè)省市自治區(qū)苜蓿花葉病毒的陽(yáng)性樣品檢測(cè)情況表已開展的研究工作已開展的研究工作基于AMV-mp基因的32個(gè)別離物構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖注：在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，AMV群體明顯分為2大類群I和II，I類群全部來(lái)自中國(guó)別離物，II類群主要來(lái)自國(guó)外〔西班牙、意大利和新西蘭〕別離物。中國(guó)類群中的地域劃分非常明顯，河北滄州、新疆、安徽、內(nèi)蒙古都存在多樣性，其中河北滄州AMV多樣性最好，別離物HBCZ2023-1、3和5分布在安徽類群與新疆類群中，這為我們的研究奠定了根底。AMV的RNA1