人類卵母細胞玻璃化冷凍方法改良

人類卵母細胞玻璃化冷凍方法改良【摘要】目的：通過改進人類卵母細胞冷凍步驟來實現(xiàn)人類卵母細胞冷凍解凍后復蘇率。方法：收集試管嬰兒助孕治療（IVF-ET）患者未成熟卵母細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)成熟后用于本實驗（n=120）。與常規(guī)卵裂期胚胎玻璃化冷凍相比較，將成熟后的人類卵母細胞首先采取地冷凍保護劑濃度（5%DMSO，5%EG無蔗糖）融滴法平衡，然后置于5/8玻璃化冷凍保護液（15%DMSO，15%EG，0.8M蔗糖）及玻璃化冷凍保護液中各30秒，最后裝入載體置于液氮中保存。人類卵母細胞采用常規(guī)解凍方法解凍。結果：解凍后的人類卵母細胞存活率達到100%，解凍后卵母細胞膜保持完整。結論：該種改良的人類卵母細胞冷凍的方法具有較高的解凍存活率，為人類卵母細胞冷凍保持提供一個較好的冷凍方案。【關鍵詞】人類卵母細胞；玻璃化冷凍；滲透壓AmodifiedmethodforhumanmatureoocytesvitrificationAbstractObjectiveThepurposeofthisstudyistodevelopamodifiedmethodforthecryopreservationandefficientpost-thawrecoveryofhumanoocytes.Method120humanunfertilizationoocyteswerecollectedformIVFpatients，werefirstlyequilibratedincryoprotectantbuffer（5%DMSO，5%EGwithoutsugar）dropsfor9minsbyfusedmethod.Theoocyteswerethendehydratedby5/8xVSmedium（15%DMSO，15%EGwith0.8Msugar）and1xVSmediumfor40secondseparately.Thedehydratedoocyteswereloadedincarrierandputintheliquidnitrogenimmediately.Resultthesurvivalrateofcryo-oocytesishigh（98.3%）.Conclusionthemortifiedmethodforoocytevitrificatonhasfinesurvivalrate,andprovidesagoodmethodforhumanoocytepreservation.Keywords：humanoocyte，vitrification人類卵母細胞冷是人體體積最大的細胞，含有豐富的水分，由于其對冷凍保護劑通透性低等特點［1，2］，玻璃化冷凍效果明顯優(yōu)于慢速程序化冷凍［3,4］，但是到目前為止，還沒有一個好的冷凍方法使得卵母細胞冷凍得到廣泛臨床應用。在卵母細胞在玻璃化冷凍解凍過程中所受的損傷可以分冰晶形成、冷損傷、冷凍保護劑毒性、滲透壓損傷等，早期改善卵母細胞玻璃化冷凍的焦點主要集中在提高冷凍速度及解凍速度以防止冷凍解凍過程中冰晶的形成，甚至采用泥氮來提高冷凍速度［5,6］，而近期對于減低卵母細胞損傷的焦點主要集中在滲透壓上，通過設計特定的冷凍裝置，實現(xiàn)冷凍保護劑連續(xù)滲透壓的變化，以達到減低滲透壓變化對卵母細胞的影響［7,8］。本研究通過減低冷凍保護劑濃度及滲透壓來實現(xiàn)減低滲透壓對卵母細胞冷凍的影響。1材料和方法1.1人類卵母細胞獲取收集2016月至2017年3月間接受輔助生殖技術治療患者未受精成熟卵母細胞M2,卵母細胞形態(tài)規(guī)則，折光性好著用于實驗，共收集到卵母細胞120枚。1.2人類卵母細胞冷凍與解凍試劑的配方基礎緩沖液A液：MHTF8ml+2mlSSS；冷凍保護劑平衡液ES液：7mlMHTF+2mlSSS+0.5mlDMSO（sigma）+0.5mlEG（sigma）；玻璃化冷凍保護劑VS：3.85mlMHTF+2mlSSS+1.5mlDMSO+1.5mlEG+1.98g蔗糖；解凍液B液：MHTF6.5ml+2mlSSS+3.4g蔗糖。1.3人類卵母細胞冷凍人類卵母細胞冷凍操作在室溫下進行以液滴形式進行冷凍（液滴大小40-50微升）。首先將卵母細胞置于A液滴中1分鐘，去除所攜帶的油滴。然后采用融滴法（A液、ES液、ES液呈正三角形排列）將M2置于A液滴中，連接A液滴與ES液滴，平衡2分鐘，再連接融滴與ES液滴，平衡2分鐘。將M2置于ES液滴中5分鐘；將M2過渡到5號液滴中（2個5號液滴過渡），置于5號液滴40秒；將M2過渡到VS液滴中（2個VS液滴過渡），置于VS液滴40秒；將卵母細胞置于冷凍載體上，吸除多余液體，插入液氮中保存。1.4卵細胞解凍操作37C預熱B液（雙井皿中央空1.2ml）備用，將保存在液氮中的載體上卵母細胞迅速置于預熱的B液中，維持1分鐘，再輕輕將卵母細胞由B液轉移到AB液體（體積比：A液：B液=1：1）中，維持3分鐘，將卵母細胞由AB液轉移到1/2濃度的AB液體中，維持3分鐘。將卵母細胞液轉移到A液體中，維持5分鐘，將卵母細胞由A液轉移到A液體中，維持5分鐘。最后將解凍后的人類卵母胞置于培養(yǎng)液G1中。人類卵母細胞存活的形態(tài)學標準：細胞膜完整，細胞質遮光性強。解凍后立即觀察記錄卵母細胞存活情況，24小時后再次觀察記錄卵母細胞存活情況。2結果2.1卵母細胞在冷凍保護液中的形態(tài)變化卵母細胞在液滴首次融合后，高濃度液滴向低濃度液滴滲透，推動卵母細胞向低濃度液滴周邊移動，卵母細胞脫水，細胞體積變小。第二液滴融合后，卵母細胞稍皺縮，在ES液體中平衡后的最終體積為0.695±0.008，見圖1B；在5/8VS液中，卵母細胞體積發(fā)生局別變化，細胞皺縮嚴重，體積比：0.497±0.007，見圖1C；在VS液中的變化情況，卵母細胞體積進一步縮小，體積比：0.483±0.04，見圖卵母細胞置于等滲A液滴中形態(tài)（圖1A），細胞膜完整，折光性強，卵周隙小；卵母細胞置于ES液滴共9分鐘后的形態(tài)（圖1B），冷凍保護劑進入細胞后，細胞體積稍縮小；卵母細胞置于5/8VS液體40秒后，細胞體積急劇縮?。▓D1C）；卵母細胞置于VS液滴中40秒，細胞進一步縮?。▓D1D）；解凍后（圖1E）及解凍后24小時（圖1F），卵母細胞細胞膜完整，折光性強，卵周隙小。2.2卵母細胞解凍后存活共解凍120枚卵母細胞，未發(fā)現(xiàn)卵細胞發(fā)生解凍后瓦解，解凍后卵母細胞存活率為100%，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，解凍后卵母細胞仍存活，見圖1E，細胞膜完整，折光性強，見圖1F。3討論人類卵母細胞冷凍在人類生育力冷凍中占有重要的地位，自采用玻璃化冷凍以后，人類卵母細胞技術得到了極大的提高，但是離臨床應用還存在一定的差距。國內外學者對人類卵母細胞冷凍進行了多方面的改進［9］，尤其是Kuwayama在2005年首創(chuàng)的人類卵母細胞冷凍配方［10］。最近，對人類卵母細胞冷凍的焦點集中在冷凍保護劑滲透壓上來，連續(xù)滲透壓梯度可以降低卵母細胞形態(tài)的劇烈變化，Lai等發(fā)現(xiàn)連續(xù)密度濃度梯度中，蔗糖對小鼠卵細胞形態(tài)的維持具有重要作用［11］，其解凍后小鼠卵母細胞存活率為100%，人類未受精卵母細胞同樣可以達到100%存活率（存活標準參考Seki2012）。本研究采用新的改良冷凍方法，改良集中在初始滲透性冷凍保護劑濃度較低（5%Vs7.5%），可以減低冷凍保護劑對卵母細胞的毒性損傷，重點改良的是增加了一個VS液濃度的過渡，降低高滲透壓對細胞冷凍解凍的損傷，為人類卵母細胞實現(xiàn)簡便高效冷凍提供一種新的方法。參考文獻:.NewtonH,PeggDE,BarrassR,GosdenRG.Osmoticallyinactivevolume,hydraulicconductivity,andpermeabilitytodimethylsulphoxideofhumanmatureoocytes.ReprodFertil.1999；117(1)：27-33..EdashigeK.Themovementofwaterandcryoprotectantsacrosstheplasmamembraneofmammalianoocytesandembryosanditsrelevancetovitrification.JReprodDev.2016；62(4)：317-21.CoboA,Garcia-VelascoJA,CoelloA,DomingoJ,PellicerA,RemohiJ.Oocytevitrificationasanefficientoptionforelectivefertilitypreservation.FertilSteril.2016；105(3)：755-764.e8.KatayamaKP,StehlikJ,KuwayamaM,KatoO,StehlikE1.Highsurvivalrateofvitrifiedhumanoocytesresultsinclinicalpregnancy.FertilSteril.2003Jul；80(1)：223-4..ChianRC1,WangY,LiYR.Oocytevitrification：advances,progressandfuturegoals.JAssistReprodGenet.2014；31(4)：411-20..GookDA1,EdgarDH.Humanoocytecryopreservation.HumReprodUpdate.2007；13(6)：591-605..HeoYS1,LeeHJ,HassellBA,IrimiaD,TothTL,ElmoazzenH,TonerM.Controlledloadingofcryoprotectants(CPAs)tooocytewithlinearandcomplexCPAprofilesonamicrofluidicplatform.LabChip.2011；11(20)：3530-7..SongYS1,MoonS,HulliL,HasanSK,KayaalpE,DemirciU.Microfluidicsforcryopreservation.LabChip.2009；9(13)：1874-81..ZhangL1,2,XueX3,YanJ1,2,YanLY1,4,JinXH1,2,ZhuXH1,2,HeZZ3,LiuJ2,5,LiR1,4,QiaoJ1,4.L-proline：ahighlyeffectivecryoprotectantformouseoocytevitrification.SciRep.2016；6：26326.doi：10.1038/srep26326..KuwayamaM1,VajtaG,KatoO,LeiboSP.Highlyefficientvitrificationmethodf