丙泊酚對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡的影響

丙泊酚對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡的影響目的紅細(xì)胞在體內(nèi)和體外受環(huán)境因素刺激會(huì)出現(xiàn)類似有核細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,表現(xiàn)為膜磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)外露,細(xì)胞皺縮體積變小、細(xì)胞膜囊泡化,這種現(xiàn)象與衰老的紅細(xì)胞表現(xiàn)極為相似。為了與有核細(xì)胞凋亡相區(qū)別,稱其為衰亡(eryptosis)。衰亡的紅細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬,避免了溶血釋放血紅蛋白引起的組織器官損傷,但衰亡使紅細(xì)胞壽命縮短,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起貧血。過氧化氫(H2O2)是否會(huì)引起人紅細(xì)胞衰亡?對(duì)紅細(xì)胞一氧化氮(NO)、亞硝酸鹽(NO2-)和硝酸鹽(NO3-)代謝有什么影響?丙泊酚(propofol,PPF)對(duì)人紅細(xì)胞衰亡以及NO、NO2-和NO3-代謝的影響是什么?為了解釋這些問題,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：①用H2O2建立體外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡模型；②觀察不同劑量PPF對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡的影響；③檢測細(xì)胞內(nèi)NO、NO2-和NO3-含量的變化；④探討丙泊酚對(duì)人紅細(xì)胞的保護(hù)作用和抗氧化損傷機(jī)制。方法第一部分：H202誘導(dǎo)紅細(xì)胞衰亡模型的建立。從健康志愿者全血提純紅細(xì)胞,制備成2%紅細(xì)胞懸液,使懸液含(mmol/1):氯化鈉145,氯化鉀4,氯化鈣2,葡萄糖5,PH=7.4。紅細(xì)胞懸液分成6組(n=3)：空白對(duì)照組(C),H2O25μm/1組(H5O),H2O2100μm/1組(H100),H2O2200μm/1組(H200),H2O2400μm/1組(H400)及離子霉素(Ionomycin)0.1μmol/L組(Ion)。Ion組孵育15分鐘,其余各組孵育3小時(shí)。應(yīng)用酶標(biāo)分析儀檢測紅細(xì)胞溶血率,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組紅細(xì)胞PS標(biāo)記率和前向角值(forwardandscatter,FSC)。根據(jù)這三項(xiàng)指標(biāo)確定研究模型。第二部分：PPF預(yù)處理對(duì)紅細(xì)胞衰亡及NO代謝的影響。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置：取制備2%紅細(xì)胞懸液分為6組(n=4)：①對(duì)照組(C)；②H202組(H)；③丙泊酚10μmol/L+H202組(P12.5+H)；④丙泊酚25μmol/L+H202組(P25+H)；⑤丙泊酚50μmol/L+H202組(P50+H)；⑥丙泊酚100μmol/L+H202組(P12.50+H)組。后4組依次用反應(yīng)濃度為12.5、25、50、100μmol/L的丙泊酚預(yù)處理30min再加H202刺激。C組為單純2%紅細(xì)胞懸液,其余各組H2O2的反應(yīng)濃度均為200μmol/L。陽性和陰性對(duì)照組的設(shè)置(n=4)：以離子霉素(Ionomycin)0.1μmol/L組(Ion)和丙泊酚50μmo1/L+Ion(P50+Ion)作為PS外露和細(xì)胞體積變化的陽性對(duì)照。以英脫利匹特50μmol/L組(In50)和英脫利匹特50μmol/L+H202組(In50+H)兩組為丙泊酚陰性對(duì)照,以維生素E50μmol/L組(E50)和維生素E50μmol/L+H202組(E50+H)做為清除自由基的陽性對(duì)照。各組PPF預(yù)處理時(shí)間為30分鐘,均置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中50rpm,37℃孵育3小時(shí)。應(yīng)用AnnexinV熒光染色檢測各組紅細(xì)胞PS標(biāo)記率,FSC以及用Fluo-4/AM檢測紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。實(shí)驗(yàn)組采用Griess法,委托北京華英生物技術(shù)研究室檢測紅細(xì)胞內(nèi)NO、NO2-和N03-含量。結(jié)果第一部分：與C組相比,H400組紅細(xì)胞溶血率顯著增加(P<0.05),而H50、H100、H200三組無明顯溶血(P>0.05)。紅細(xì)胞PS標(biāo)記率H200和H400兩組比C組明顯增加(P<0.05),H200組FSC比C組減少明顯(P<0.05)。故選擇反應(yīng)濃度為200μm/1的H202用于制作人紅細(xì)胞氧化應(yīng)激衰亡模型。第二部分：PS標(biāo)記率：與H組(15.20±1.01)相比,P12.5+H、P25+H、P50+H和P100+H組的PS標(biāo)記率都降低,分別為9.39±2.35、4.35±3.62、3.09±1.66和1.68±0.28,差異均具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。FSC值：與H組(1767.67±9.19)相比,P12.5+H、P25+H、P50+H和P100+H四組FSC均有增加,分別是1783.83±33.26、1797.21±97.13、1810.61±16.28和1792.97±24.83,其中P50+H與H組相比,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。Ca2+濃度：與C組相比,H組Ca2+熒光強(qiáng)度無明顯改變(P>0.05)。與H組相比,PPF預(yù)處理各濃度組Ca2+熒光強(qiáng)度增加,但差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。NO含量：H組(2.40±0.02)比C組(2.99±0.05)低(P<0.05),P25+H組(3.03±0.13)和P50+H組(3.14±O.11)比H組明顯改善(P<0.05),且呈劑量依賴性。NO2-含量：H組(22.54±O.14)比C組(24.01±0.33)低(P<0.05),P12.5+H組(22.93±0.16)、P25+H組(24.05±0.71)、P100+H組(27.61±2.99)均比H組高(P<0.05)。NO3-含量：H組(44.77±4.02)及PPF各濃度組均比C組(31.14±1.48)高。結(jié)論1、低劑量的H2O2能在體外誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡,表現(xiàn)為PS外露、細(xì)胞體積縮小,但細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化不明顯;2、丙泊酚通過清除自由基保護(hù)人紅細(xì)胞抵抗氧化損傷,抑制衰亡；3、H2O2誘導(dǎo)人紅細(xì)胞衰亡不是通過Ca2+內(nèi)流引起,丙泊酚對(duì)單純Ca2+內(nèi)流引起的紅細(xì)胞衰亡無明顯抑