瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

瓊脂糖凝膠電泳的工作原理及操作天然瓊脂(agar)是一種多聚糖，主要由瓊脂糖(約占80%)及瓊脂膠組成。瓊脂糖是從海藻中提出的一種線性高聚物。它的分子結構分為一下兩種。

瓊脂糖鏈依分子內和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構成大網孔型凝膠。

D-半乳糖3，6-脫水-L-半乳糖二原理瓊脂糖是一種長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度在堿性緩沖液中DNA分子帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。由于糖－磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動帶電物質在電場中的趨向運動稱為電泳。凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為蛋白質、核酸研究的首選標準方法影響泳動率的因素包括樣品的物理性狀、支持物介質、電場強度和緩沖液離子強度瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分離范圍參數

凝膠濃度（%）線性DNA長度（bp）

0.51000～300000.7800～120001.0500～100001.2400～70001.5200～30002.050～2000三、儀器、材料與試劑微波爐瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)DNA樣品DNAmarker50×TBE10×凝膠加樣緩沖液瓊脂糖1％溴化乙錠溶液（EB）溶解瓊脂糖分離DNA片段檢測DNA片段電泳樣品DNA相對分子質量標準物電泳緩沖液沉淀DNA并起指示作用電泳支持介質嵌入DNA中，在紫外燈下顯色EB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套四、實驗步驟一瓊脂糖的配制1.配制0.8%的瓊脂糖溶液：稱量0.4g瓊脂糖倒入三角瓶中，加入50ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。2.在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解（3次）瓊脂糖。3.冷卻到60℃，加入2μl的1％EB，并搖勻，凝膠呈微紅色即可。(EB劇毒！操作時要戴上手套，）則為所需瓊脂糖凝膠液二制作膠板1.用溶解的瓊脂糖將制膠板兩端封好，（注意不可有縫隙。）插入適當梳子（注意調整梳子的高度，我個人的經驗是在托盤底面放一塊厚0.5-1mm的薄片，將梳子垂直插入，然后取走薄片。）。2.將溶解的瓊脂糖（約50℃）緩緩倒入，室溫冷卻凝固（凝膠適宜厚度為3-5mm，倒膠時一定要注意，不要讓膠中留有氣泡。）3.在室溫下放置30-45min讓膠凝固，小心拔出梳子，（垂直拔出，避免破壞點樣孔。）拔出托盤開放邊卡板，（切記！否則不導電），將膠和推盤放置在電泳槽內。4.向電泳槽中加入0.5×TBE，緩沖液高出膠面3-5mm即可。5.用移液器吸取DNA樣品2ul于塑料板上，再加入3μl的上樣緩沖液(BUFFER)，用微量移液器吹打，混勻后，小心加入點樣孔6.加marker5ul置中間或一側點樣空。三通電跑膠1.打開電源開關，按照電源兩極間距離5V/cm調節(jié)電壓（本實驗用電壓100V），可見溴酚藍條帶由負極向正極移動，當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。2.小心從電泳槽中取出凝膠，將凝膠在紫外投射分析儀中觀察結果。（DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶）。紫外透射分析儀打開后如圖。打開可見光調節(jié)膠像的位置。關閉可見光燈，然后打開紫外燈

312nm。

在工具欄中調節(jié)

對比度。選擇使圖片清晰地對比度。

打開工具欄camera進行拍照。保存。觀察實驗結果正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失我們實驗的

結果不清晰較清晰的的實驗結果1000040000200050025060001000注意事項瓊脂糖加熱煮沸三次，完全溶解至無混濁。電泳緩沖液要高出膠板3-5mm。傾倒膠板時小心，以防倒在梳子上。點樣時槍孔不能碰點樣孔，防止破壞和樣品向周圍擴散。紫外分析時應調清晰對比度。瓊脂糖電泳的一些優(yōu)點瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳，其優(yōu)點如下：(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可進行電泳。

(2)瓊脂糖凝膠結構均勻，含水量大(約占98-99%)，近似自由電泳，樣品擴散度較自由電泳小，對樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。

(3)瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結果可直接用紫外光燈監(jiān)測及定量測定。

(4)電