生物催化技術(shù)考試總結(jié)

第一章緒論工業(yè)生物技術(shù)定義：在工業(yè)規(guī)模的消費過程中運用或部分運用生物技術(shù)來實現(xiàn)產(chǎn)品的制造，這種技術(shù)是運用微生物和生物催化劑來提供產(chǎn)品和效力.中心目的：大規(guī)模利用生物體系〔如細胞或酶〕作為催化劑實現(xiàn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化.工業(yè)生物技術(shù)是生物技術(shù)的重要組成部分第一章緒論工業(yè)生物技術(shù)開展空間提升傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)生物能源環(huán)境生物技術(shù)生物資料第一章緒論生物催化〔Biocatalysis)利用酶或有機體〔細胞或細胞器等〕作為催化劑實現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。生物轉(zhuǎn)化〔Biotransformation)氧化-復(fù)原酶催化氧化-復(fù)原反響。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反響。(1)氧化復(fù)原酶Oxidoreductase轉(zhuǎn)移酶催化基團轉(zhuǎn)移反響，即將一個底物分子的基團或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。

例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反響。(2)轉(zhuǎn)移酶Transferase水解酶催化底物的加水分解反響。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反響：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化從底物分子中移去一個基團或原子構(gòu)成雙鍵的反響及其逆反響。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如，延胡索酸裂合酶催化的反響。(4)裂合酶Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團或原子的重排過程。

例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反響。(5)異構(gòu)酶Isomerase合成酶，又稱為銜接酶，可以催化C-C、C-O、C-N以及C-S鍵的構(gòu)成反響。這類反響必需與ATP分解反響相互偶聯(lián)。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反響。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase(四)活性部位和必需基團必需基團：這些基團假設(shè)經(jīng)化學(xué)修飾使其改動，那么酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位。必需基團活性部位維持酶的空間構(gòu)造結(jié)合基團催化基團專注性催化性質(zhì)酶作用的專注性構(gòu)造專注性立體異構(gòu)專注性族〔基團〕專注性絕對專注性(五)酶作用的專注性族專注性：可作用于一類或一些構(gòu)造很類似的底物。絕對專注性：只能作用于某一底物。專注性酶的專注性是指在一定的條件下，一種酶只能催化一種或一類構(gòu)造類似的底物進展某種類型反響的特性。1．絕對專注：只催化一種底物進展快速反響，甚至是立體專注性2相對專注性：一種酶可以催化一類構(gòu)造類似的底物進展某種一樣類型的反響，這種專注性稱為相對專注性。基團專注和鍵專注酶的催化作用遭究竟物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多要素的影響。在酶的運用過程中，必需控制好各種環(huán)境條件，以充分發(fā)揚酶的催化功能。(六)影響酶催化的各種要素底物濃度的影響在底物濃度較低的情況下，酶催化反響速度與底物濃度成正比，反響速度隨著底物濃度的添加而加快。當?shù)孜餄舛鹊竭_一定的數(shù)值時，反響速度的上升不再與底物濃度成正比，而是逐漸趨向平衡。[S]VVm酶濃度的影響在底物濃度足夠高的條件下,酶催化反響速度與酶濃度成正比反響速度酶濃度溫度的影響每一種酶的催化反響都有其適宜溫度范圍和最適溫度。在最適溫度條件下，酶的催化反響速度到達最大。反響速度溫度pH值的影響酶的催化作用與反響液的pH值有很大關(guān)系,每一種酶都有其各自的適宜pH值范圍和最適pH值。反響速度pH抑制劑的影響酶的抑制劑：使酶的催化活性降低或者喪失的物質(zhì)。抑制劑有可逆性抑制劑和不可逆抑制劑之分。不可逆抑制劑：與酶分子結(jié)合后，抑制劑難于除去，酶活性不能恢復(fù)?？赡嫘砸种苿号c酶的結(jié)合是可逆的，只需將抑制劑除去，酶活性即可恢復(fù)。根據(jù)可逆性抑制造用的機理不同，酶的可逆性抑制造用可以分為競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制三種。抑制劑的影響競爭性抑制：指抑制劑和底物競爭與酶分子結(jié)合而引起的抑制造用。機制：競爭性抑制劑與酶作用底物的構(gòu)造類似。它與酶分子結(jié)合以后，底物分子就不能與酶分子結(jié)合，從而對酶的催化起到抑制造用。例如，丙二酸是琥珀酸的構(gòu)造類似物。丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。競爭性抑制的特點：是酶催化反響的最大反響速度Vm不變，而米氏常數(shù)Km增大。抑制劑的影響非競爭性抑制〔noncompetitiveinhibition〕：指抑制劑與底物分別與酶分子上的不同位點結(jié)合，而引起酶活性降低的抑制造用。機制：由于非競爭性抑制劑是與酶的活性中心以外的位點結(jié)合，所以，抑制劑的分子構(gòu)造能夠與底物分子的構(gòu)造毫不相關(guān)。添加底物濃度也不能使非競爭性抑制造用逆轉(zhuǎn)。非競爭性抑制的特點：最大反響速度Vm減小，而米氏常數(shù)Km不變。抑制劑的影響反競爭性抑制(uncompetitiveinhibition)：在底物與酶分子結(jié)合生成中間復(fù)合物后，抑制劑再與中間復(fù)合物結(jié)合而引起的抑制造用。機制：反競爭性抑制劑不能與未結(jié)合底物的酶分子結(jié)合，只需當?shù)孜锱c酶分子結(jié)合以后由于底物的結(jié)合引起酶分子構(gòu)造的某些變化，使抑制劑的結(jié)合部位展現(xiàn)出來，抑制劑才干結(jié)合并產(chǎn)生抑制造用。所以亦不能經(jīng)過添加底物濃度使反競爭抑制造用逆轉(zhuǎn)。反競爭性抑制的特點：最大反響速度Vm和米氏常數(shù)Km同時減小。激活劑的影響酶的激活劑或活化劑：可以添加酶的催化活性或使酶的催化活性顯示出來的物質(zhì)。常見的激活劑有Ca++、Mg++、Co++、Zn++、Mn++等金屬離子和Cl-等無機負離子。例如，氯離子〔Cl-〕是α-淀粉酶的激活劑，鈷離子〔Co+2〕和鎂離子〔Mg+2〕是葡萄糖異構(gòu)酶的激活劑等。有的酶也可以作為激活劑，經(jīng)過激活劑的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性顯示出來。酶的消費方法提取分別法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample五大要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水培育基幾乎是一切對微生物進展研討和利用任務(wù)的根底培育基〔medium〕是人工配制的，適宜微生物生長繁衍或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培育基都應(yīng)該具備微生物生長所需求五大營養(yǎng)要素微生物發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物具備的條件：〔1〕酶的產(chǎn)量高；〔2〕產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；〔3〕容易培育和管理；〔4〕利于酶的分別純化；〔5〕平安可靠、無毒性等。構(gòu)成細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物中氮素〔不能用作能源〕氮源有機氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏無機氮源銨鹽、硝酸鹽參與酶的組成、構(gòu)成酶活性基、激活酶活性維持細胞構(gòu)造的穩(wěn)定性調(diào)理細胞浸透壓控制細胞的氧化復(fù)原電位有時可作某些微生物生長的能源物質(zhì)常用：硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物以及含有鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等元素的化合物。氮源無機鹽需求留意適宜的碳氮比實驗室的常用培育基：細菌：牛肉膏蛋白胨培育基〔或簡稱普通肉湯培育基〕；放線菌：高氏1號合成培育基培育；酵母菌：麥芽汁培育基；霉菌：查氏合成培育基；例如枯草芽孢桿菌：普通培育：肉湯培育基或LB培育基；自然轉(zhuǎn)化：根底培育基；察看芽孢：生孢子培育基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培育基；1、酶生物合成的方式細胞在一定條件下培育生長，其生長過程普通閱歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段經(jīng)過分析比較細胞生長與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶生物合成的方式分為4種類型。即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。同步合成型酶的生物合成與細胞生長同步進展的一種酶生物合成方式。該類型酶的生物合成速度與細胞生長速度嚴密聯(lián)絡(luò)，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細胞的生長而開場；在細胞進入旺盛生長期時，酶大量生成；當細胞生出息入平衡期后，酶的合成隨著停頓。大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種方式進展生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培育基中生長，在單寧或沒食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶〔tanaseEC3.1.1.20〕。影響產(chǎn)酶的環(huán)境要素發(fā)酵溫度、PH、溶氧誘導(dǎo)物阻遏物外表活性劑產(chǎn)酶促進劑的運用延續(xù)合成型酶的生物合成在細胞的生長階段開場，在細胞生出息入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培育基中培育，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶〔Polygalacturonase，EC3.2.1.15〕的生物合成。中期合成型該類型的酶在細胞生長一段時間以后才開場，而在細胞生出息入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停頓。例如，枯草桿菌堿性磷酸酶〔Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成方式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成遭到其反響產(chǎn)物無機磷酸的反響阻遏，而磷又是細胞生長所必不可缺的營養(yǎng)物質(zhì)，培育基中必需有磷的存在。這樣，在細胞生長的開場階段,培育基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只需當細胞生長一段時間，培育基中的磷幾乎被細胞用完〔低于0.01mmol/L〕以后，該酶才開場大量生成。又由于堿性磷酸酶所對應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只需30min左右，所以當細胞進入平衡期后，酶的生物合成隨著停頓。滯后合成型此類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開場其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細胞生長一段時間甚至進入平衡期以后才開場所成，主要緣由是由于遭到培育基中存在的阻遏物的阻遏作用。只需隨著細胞的生長，阻遏物幾乎被細胞用完而使阻遏解除后，酶才開場大量合成。假設(shè)培育基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細胞生出息入平衡期后的相當長的一段時間內(nèi)，繼續(xù)進展酶的生物合成。理想的酶合成方式酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培育基中阻遏物的存在是影響酶生物合成方式的主要要素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細胞生出息入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細胞生出息入平衡期而停頓酶的生物合成；不受培育基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細胞生長而開場酶的合成；遭到培育基中某些物質(zhì)阻遏的，那么要在細胞生長一段時間甚至在平衡期后，酶才開場所成并大量積累。在酶的發(fā)酵消費中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成方式應(yīng)是延續(xù)合成型。由于屬于延續(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過程中沒有生長期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細胞一開場生長就有酶產(chǎn)生，直至細胞生出息入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長的時間。對于其他合成方式的酶，可以經(jīng)過基因工程\細胞工程等先進技術(shù),選育得到優(yōu)良的菌株,并經(jīng)過工藝條件的優(yōu)化控制,使他們的生物合成方式更加接近于延續(xù)合成型?；乇竟?jié)2、酶消費過程中細胞生長動力學(xué)細胞在控制一定條件的培育基中生長的過程中,其生長速度遭到細胞內(nèi)外各種要素的影響,變化比較復(fù)雜，情況各不一樣。細胞生長動力學(xué)主要研討細胞生長速度以及外界環(huán)境要素對細胞生長速度影響的規(guī)律。1950年，法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細胞生長的動力學(xué)方程。在培育過程中，細胞生長速率與細胞濃度成正比假設(shè)培育基中只需一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長限制要素時，μ為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。KS為莫諾德常數(shù)，是指比生長速率到達最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度?；乇竟?jié)莫諾德方程是根本的細胞生長動力學(xué)方程。在發(fā)酵過程優(yōu)化以及發(fā)酵過程控制方面具有重要的運用價值。不少學(xué)者從不同的情況出發(fā)或運用不同的方法，對莫諾德方程進展了修正，得出了適用于不同情況的各種動力學(xué)模型。延續(xù)培育時的方程變化方式3、產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)主要研討細胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境要素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學(xué)的研討可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研討群體細胞的產(chǎn)酶速率及其影響要素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)或這稱為非構(gòu)造動力學(xué)。也可以從細胞內(nèi)部著眼，研討細胞中酶合成速率及其影響要素，這謂之微觀產(chǎn)酶動力學(xué)或稱為構(gòu)造動力學(xué)。細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需求對細胞進展破碎處置。1〕機械破碎2〕物理破碎3〕化學(xué)破碎4〕酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機酶的分別純化細胞破碎1.機械破碎法◆經(jīng)過機械運動所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細胞破碎的方法稱為機械破碎法?！舫Ｓ玫钠扑闄C械有組織搗碎機，細胞研磨器，勻漿器等?！魴C械破碎法分為3種:搗碎法，研磨法和勻漿法。酶的分別純化細胞破碎2.物理破碎法◆經(jīng)過溫度、壓力、聲波等各種物理要素的作用，使組織細胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細胞的破碎?！舫Ｓ玫奈锢砥扑榉ǚ椒ㄓ袦囟炔钇扑榉?、壓力差破碎法、超聲波破碎法：(1)溫度差破碎法：利用溫度的忽然變化，由于熱脹冷縮的作用而使細胞破碎的方法稱為溫度差破碎法。酶的分別純化2.物理破碎法(2)壓力差破碎法：經(jīng)過壓力的忽然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的有高壓沖擊法、忽然降壓法、及浸透壓變化法等。(3)超聲波破碎法：利用超聲波發(fā)生器所發(fā)出的聲波或超聲波的作用，使細胞膜產(chǎn)生空穴作用〔cavitation〕而使細胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。酶的分別純化化學(xué)破碎法◆經(jīng)過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎的方法稱為化學(xué)破碎法?！舫Ｓ玫幕瘜W(xué)試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑，和曲通〔Triton〕、吐溫〔Tween〕等外表活性劑。酶的分別純化化學(xué)破碎法◆有機溶劑可以使細胞膜的磷脂構(gòu)造破壞，從而改動細胞膜的透過性，使胞內(nèi)酶等細胞內(nèi)物質(zhì)釋放到細胞外?！敉獗砘钚詣┛梢院图毎ぶ械牧字约爸鞍紫嗷プ饔?，使細胞膜構(gòu)造破壞，從而添加細胞膜的透過性。酶的分別純化酶促破碎法◆經(jīng)過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層構(gòu)造遭到破壞，而到達細胞破碎的方法稱為酶促破碎法，或稱為酶學(xué)破碎法?！魧⒓毎谝欢ǖ膒H值和溫度條件下保溫一段時間，利用細胞本身酶系的作用，使細胞破壞，而使細胞內(nèi)物質(zhì)釋出的方法，稱為自溶法。酶的分別純化

自溶法效果的好壞取決于溫度、pH值、離子強度等自溶條件的選擇與控制。

為了防止其他微生物在自溶細胞液中生長，必要時可以添加少量的甲苯、氯仿、疊氮鈉等防腐劑?！舾鶕?jù)細胞外層構(gòu)造的特點，還可以外加適當?shù)拿缸饔糜诩毎?，使細胞壁破壞，并在低浸透壓的溶液中，使細胞破裂。酶的分別方法超臨界萃取超臨界萃取又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分別物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而到達分別的一種萃取技術(shù)。超臨界流體〔supercriticalfluid,SF〕是一種物質(zhì)形狀，當物質(zhì)在超越臨界溫度及臨界壓力以上，氣體與液體的性質(zhì)會趨近于類似，最后會達成一個均勻相流表達象。超臨界流體類似氣體具有可緊縮性，而且又兼具有類似液體的流動性，密度普通都介于0.1到1.0g/ml之間。酶的分別方法4層析分別吸附層析吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分別的方法。吸附層析通常采用柱型安裝，將吸附劑裝在吸附柱中，安裝成吸附層析柱。酶的分別方法4層析分別吸附層析層析時，欲分別的混合溶液自柱頂參與，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再參與洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。酶的分別方法4層析分別吸附層析吸附劑與洗脫劑的選擇極性物質(zhì)容易被極性外表吸附；非極性物質(zhì)容易被非極性外表吸附；溶液中溶解度越大的物質(zhì)越難被吸附。無機吸附劑和有機吸附劑。吸附劑通常由一些化學(xué)性質(zhì)不活潑的多孔資料制成，比外表積很大。酶的分別方法4層析分別吸附層析洗脫劑選擇◆對于極性組分，用極性大的溶劑洗脫效果較好?！舳鴮τ诜菢O性組分，那么用非極性溶劑洗脫較佳?！粝疵搫┑姆N類有：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等。酶的分別方法1、沉淀分別鹽析沉淀法鹽析沉淀機理◆鹽之所以會改動蛋白質(zhì)的溶解度，是由于鹽在溶液中離解為正離子和負離子。由于反離子作用，使蛋白質(zhì)分子外表的電荷改動，同時由于離子的存在改動了溶液中水的活度，使分子外表的水化膜改動。酶和細胞固定化技術(shù)固定化酶的定義經(jīng)過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚讣砜`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自在流動，但能使酶充分發(fā)揚催化作用；過去曾稱其為水不溶酶或固相酶。細胞和酶固定化技術(shù)固定化酶固定化酶新方法無載體固定化酶新技術(shù)交聯(lián)溶解酶、交聯(lián)酶晶體、交聯(lián)酶聚集體和交聯(lián)噴霧枯燥酶。定向固定化新技術(shù)借助化學(xué)方法的位點專注性固定化磷蛋白的位點專注性固定化免疫球蛋白的位點專注性固定化糖蛋白的位點專注性固定化利用基因工程的位點專注性固定化新型固定化資料的運用經(jīng)過磁性、輻射、光、等離子體、電子等新資料新方法均可制備高活性固定化酶。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化固定化動物細胞的特點：〔2〕提高產(chǎn)率：動物細胞固定化后，可先在生長培育基中生長繁衍，使細胞在載體上構(gòu)成最正確分布并到達一定的細胞密度。然后可簡便地改換成發(fā)酵培育基，控制發(fā)酵條件，使細胞從生長期轉(zhuǎn)變到消費期，以利于提高產(chǎn)率。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化固定化動物細胞的特點：〔3〕固定化動物細胞可反復(fù)運用或延續(xù)運用較長的時間。例如，中國倉鼠卵巢細胞〔CHO〕消費人干擾素可以穩(wěn)定地消費30天。〔4〕固定化細胞易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分別純化，提高產(chǎn)質(zhì)量量。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化動物細胞固定化方法：◆動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種。(1)吸附法：◆大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培育過程中，必需趨向于附著在固體外表。故此吸附法特別適宜于動物細胞的固定化。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞3、動物細胞固定化動物細胞固定化資料：轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，外表經(jīng)過一定方法處置而帶上電荷。微載體是指顆粒細小的固定化載體，直徑普通為100～200μm，相對密度接近1.0。是由帶有外表電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等資料制成。微載體已用于多種動物細胞的固定化；細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4原生質(zhì)體固定化固定化原生質(zhì)體的特點：(1)固定化原生質(zhì)體由于解除了細胞壁這一分散屏障，可添加細胞膜的通透性，有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳送和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4原生質(zhì)體固定化(2)固定化原生質(zhì)體由于有載體的維護作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保管穩(wěn)定性，可反復(fù)運用和延續(xù)運用較長的時間，利于延續(xù)化消費。在冰箱保管較長時間后仍能堅持其消費才干。(3)固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分別純化，提高產(chǎn)質(zhì)量量。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4原生質(zhì)體固定化(4)固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培育基中需求添加浸透壓穩(wěn)定劑，以堅持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些浸透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵終了后，可用層析或膜分別技術(shù)等方法與產(chǎn)物分別。細胞和酶固定化技術(shù)固定化細胞4原生質(zhì)體固定化固定化原生質(zhì)體的運用固定化原生質(zhì)體一方面堅持了細胞原有的新陳代謝特性，可以照常產(chǎn)生原來在細胞內(nèi)產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，另一方面又去除了細胞壁這一分散屏障，有利于胞內(nèi)產(chǎn)物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經(jīng)過細胞破碎和提取工藝而在發(fā)酵液中獲得所需的發(fā)酵產(chǎn)物，為胞內(nèi)物質(zhì)的工業(yè)化消費開辟了新途徑。固定化原生質(zhì)體可用于各種氨基酸、酶和生物堿等物質(zhì)的消費以及甾體轉(zhuǎn)化等。細胞和酶固定化技術(shù)固定化酶與細胞的比較固定化細胞固定化酶適合胞內(nèi)酶胞內(nèi)、外酶都適合既可完成單一反應(yīng)，也可以完成輔助因子參與的代謝過程應(yīng)用于單一反應(yīng)，不能完成復(fù)雜的代謝過程固定化之前不用進行分離純化固定化前必須進行分離純化獲得高度密集的工程菌集合體，較長時間地反復(fù)使用或連續(xù)使用不能獲得難避免副產(chǎn)物的產(chǎn)生，存在細胞膜、細胞壁的擴散限制作用可以控制避免不需要的副產(chǎn)物生成，不存在細胞膜的擴散限制作用細胞和酶固定化技術(shù)固定化載體和方法的比較與選擇酶的構(gòu)造酶活性中心〔activitysite)酶的活性中心包括兩個功能部位：一個是結(jié)合部位，是酶與底物結(jié)合的基團，決議酶的專注性；另一個是催化部位，催化底物敏感鍵發(fā)生化學(xué)變化的基團，決議酶的催化才干。但這兩個部位并不是各自獨立存在的，相互聯(lián)絡(luò)。改動酶特性有兩種主要的方法1)經(jīng)過分子修飾的方法來改動已分別出來的天然酶的活性。2)經(jīng)過基因工程方法改動編碼酶分子的基因此到達改造酶的目的。1什么是酶分子修飾？經(jīng)過各種方法使酶分子的構(gòu)造發(fā)生某些改動，從而改動酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子經(jīng)過人工的方法與一些化學(xué)基團〔物質(zhì)〕，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進展共價銜接，從而改動酶的構(gòu)造和性質(zhì)。酶分子修飾的原理1、修飾劑分子存在多個反響基團，可與酶構(gòu)成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性〞構(gòu)造。從而加強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性。酶分子修飾的原理2、大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間妨礙或靜電斥力阻撓抑制劑，“遮蓋〞了酶的活性部位。從而維護酶活性部位并起到低抗抑制劑和抗蛋白水解酶的作用。酶分子修飾的原理3、酶分子上許多敏感基團交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的能夠性。4、酶蛋白氨基酸組成的抗原決議簇，與修飾劑構(gòu)成了共價鍵。破壞了抗原決議簇—抗原性降低乃至消除，“遮蓋〞了抗原決議簇—妨礙抗原、抗體結(jié)合。消除酶的抗原性，使酶穩(wěn)定。酶分子修飾的原理5、大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子外表構(gòu)成“緩沖外殼〞，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。修飾劑的選擇原那么1.修飾劑的分子量及鏈的長度〔要求有較大的分子量〕。2.修飾劑上反響基團的數(shù)目及位置〔要求有較多的反響活性基團〕。3.修飾劑上反響基團的活化方法與條件〔要求有完善的方法〕。酶分子修飾的根本要求和條件對酶分子進展修飾必需在修飾原理、修飾劑和反響條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。〔1〕酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等?！?〕酶活性中心的情況活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反響盡能夠在酶穩(wěn)定條件下進展，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高?！?〕pH與離子強度pH決議了酶蛋白分子中反響基團的解離形狀。由于它們的解離形狀不同，反響性能也不同?！?〕修飾反響的溫度與時間嚴厲控制溫度和時間可以減少以致消除一些非專注性的修飾反響?！?〕反響體系中酶與修飾劑的比例回本章目錄酶分子的修飾方法修飾方法外表化學(xué)修飾酶分子內(nèi)部修飾大分子修飾小分子修飾交聯(lián)修飾固定化修飾蛋白主鏈修飾氨基酸置換修飾金屬離子置換修飾二、酶的定向進化概念人為地發(fā)明特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對基因進展隨機突變，從一個或多個曾經(jīng)存在的親本酶〔天然的或者人為獲得的〕出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，經(jīng)過一定的挑選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進化酶。定向進化＝隨機突變＋選擇酶的非水相催化酶的非水相催化酶在非水介質(zhì)中進展的催化作用稱為酶的非水相催化。在非水相中，酶分子遭到非水相介質(zhì)的影響，其催化特性與在水相中催化有著較大的不同。酶的非水相催化非水相酶催化的特性〔1〕添加非極性基質(zhì)的溶解度；〔2〕使某些本來在水相不能進展的反響順利進展，如肽的合成、酯的合成等；〔3〕可減少在水相容易發(fā)生的副反響，如酸酐的水解、鹵化物的水解等；〔4〕容易分別回收；〔5〕無微生物污染；酶的非水相催化類型有機介質(zhì)氣相介質(zhì)離子介質(zhì)超臨界介質(zhì)一、酶非水相催化的幾種類型1、有機介質(zhì)中的酶催化：有機介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機溶劑中進展的催化反響。特點：1〕適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。2〕酶在有機介質(zhì)中由于可以根本堅持其完好的構(gòu)造和活性中心的空間構(gòu)象，所以可以發(fā)揚其催化功能。一、酶非水相催化的幾種類型1、有機介質(zhì)中的酶催化克利巴諾夫〔Klibanov〕研討闡明：酶在一定濃度的有機溶劑中具有一定的“分子記憶〞效應(yīng)，這種記憶是由于酶存在配體而產(chǎn)生的，當配體被移走后，由于大量有機溶劑存在形狀下酶構(gòu)象的高度剛性，使得這種與配體具有高親和性的構(gòu)象得以堅持，而過量水的介入會加速這種記憶喪失。KlibanovAM.Enzymememory-whatisrememberedandwhy?[J].Nature,1995,374:596-600.一、酶非水相催化的幾種類型2、氣相介質(zhì)中的酶催化定義：氣相介質(zhì)中的酶催化是指酶在氣相介質(zhì)中進展的催化反響。特點：1〕適用于底物是氣體或者可以轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反響。2〕由于氣體介質(zhì)的密度低，分散容易，所以酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點。一、酶非水相催化的幾種類型3、超臨界流體介質(zhì)中的酶催化定義：超臨界介質(zhì)中的酶催化是指酶在超臨界流體中進展的催化反響。條件要求：1〕用于酶催化反響的超臨界流體該當對酶的構(gòu)造沒有破壞作用，對催化作用沒有明顯的不良影響；2〕具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對設(shè)備沒有腐蝕性；3〕超臨界溫度不能太高或太低，最好在室溫附近或在酶催化的最適溫度附近；4〕超臨界壓力不能太高，可節(jié)約緊縮動力費用；5〕超臨界流體要容易獲得，價錢要廉價等。酶非水相催化的幾種類型4、離子液介質(zhì)中的酶催化：離子液介質(zhì)中的酶催化是指酶在離子液中進展的催化作用。離子液〔ionicliquids〕是由有機陽離子與有機〔無機〕陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作器具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)