2023年馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范

三、馬傳染性貧血防治技術(shù)規(guī)范

馬傳染性貧血（EquineInfectiousAnemia,EIA,簡(jiǎn)稱(chēng)馬傳貧）,

是由反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬馬傳貧病毒引起的馬屬動(dòng)物傳染病。我國(guó)

將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病。

為預(yù)防、控制和消滅馬傳貧，依據(jù)《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》

及有關(guān)的法律法規(guī)，制定本規(guī)范。

1適用范圍

本規(guī)范規(guī)定了馬傳貧的診斷、疫情報(bào)告、疫情處理、防治措施、

控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)。

本規(guī)范適用于中華人民共和國(guó)境內(nèi)從事馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)、經(jīng)營(yíng)，馬

屬動(dòng)物產(chǎn)品加工、經(jīng)營(yíng)，及從事動(dòng)物防疫活動(dòng)的單位和個(gè)人。

2診斷

2.1流行特點(diǎn)

本病只感染馬屬動(dòng)物，其中，馬最易感，騾、驢次之，且無(wú)品種、

性別、年齡的差異。病馬和帶毒馬是主要的傳染源。主要通過(guò)虻、蚊、

刺蠅及螺等吸血昆蟲(chóng)的叮咬而傳染，也可通過(guò)病毒污染的器械等傳播。

多呈地方性流行或散發(fā)，以7?9月份發(fā)生較多。在流行初期多呈急

性型經(jīng)過(guò)，致死率較高，以后呈亞急性或慢性經(jīng)過(guò)。

2.2臨床特征

本病潛伏期長(zhǎng)短不一，一般為20?40天，最長(zhǎng)可達(dá)90天。

根據(jù)臨床特征，常分為急性、亞急性、慢性和隱性四種類(lèi)型。

急性型高熱稽留。發(fā)熱初期，可視黏膜潮紅，輕度黃染；隨病

程發(fā)展逐漸變?yōu)辄S白至蒼白；在舌底、口腔、鼻腔、陰道黏膜及眼結(jié)

膜等處，常見(jiàn)鮮紅色至暗紅色出血點(diǎn)（斑）等。

亞急性型呈間歇熱。一般發(fā)熱39（以上，持續(xù)3?5天退熱至

常溫，經(jīng)3?15天間歇期又復(fù)發(fā)。有的患病馬屬動(dòng)物出現(xiàn)溫差倒轉(zhuǎn)現(xiàn)

象。

慢性型不規(guī)則發(fā)熱，但發(fā)熱時(shí)間短。病程可達(dá)數(shù)月或數(shù)年。

隱性型無(wú)可見(jiàn)臨床癥狀，體內(nèi)長(zhǎng)期帶毒。

2.3病理變化

2.3.1剖檢變化

急性型主要表現(xiàn)敗血性變化，可視黏膜、漿膜出現(xiàn)出血點(diǎn)（斑），

尤其以舌下、齒齦、鼻腔、陰道黏膜、眼結(jié)膜、回腸、盲腸和大結(jié)腸

的漿膜、黏膜以及心內(nèi)外膜尤為明顯。肝、脾腫大，肝切面呈現(xiàn)特征

性檳榔狀花紋。腎顯著增大，實(shí)質(zhì)濁腫，呈灰黃色，皮質(zhì)有出血點(diǎn)。

心肌脆弱，呈灰白色煮肉樣，并有出血點(diǎn)。全身淋巴結(jié)腫大，切

面多汁，并常有出血。

亞急性和慢性型主要表現(xiàn)貧血、黃染和細(xì)胞增生性反應(yīng)。脾中

（輕）度腫大，堅(jiān)實(shí)，表面粗糙不平，呈淡紅色；有的脾萎縮，切面

小梁及濾泡明顯；淋巴小結(jié)增生，切面有灰白色粟粒狀突起。不同程

度的肝腫大，呈土黃或棕紅色，質(zhì)地較硬，切面呈豆蔻狀花紋（豆蔻

肝）；管狀骨有明顯的紅髓增生灶。

2.3.2病理組織學(xué)變化

主要表現(xiàn)為肝、脾、淋巴結(jié)和骨髓等組織器官內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞

明顯腫脹和增生。急性病例主要為組織細(xì)胞增生，亞急性及慢性病例

則為淋巴細(xì)胞增生，在增生的組織細(xì)胞內(nèi)，常有吞噬的鐵血黃素。

2.4實(shí)驗(yàn)室診斷

2.4.1馬傳貧瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）（見(jiàn)附件）。

2.4.2馬傳貧酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（見(jiàn)附件）。

2.4.3馬傳貧病原分離鑒定（見(jiàn)附件）。

2.4.4結(jié)果判定

具備馬傳貧流行特點(diǎn)、臨床癥狀、病理變化，可做出初步診斷;

2.4.1或2.4.2或2.4.3結(jié)果陽(yáng)性,即可確診。

3疫情報(bào)告

3.1任何單位和個(gè)人發(fā)現(xiàn)疑似疫情，應(yīng)當(dāng)及時(shí)向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)

督機(jī)構(gòu)報(bào)告。

3.2動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到疫情報(bào)告并確認(rèn)后，按《動(dòng)物疫情報(bào)

告管理辦法》及有關(guān)規(guī)定及時(shí)上報(bào)。

4疫情處理

4.1發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病馬屬動(dòng)物后，畜主應(yīng)立即隔離疑似患病馬

屬動(dòng)物，限制其移動(dòng)，并立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告。動(dòng)物防

疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)接到報(bào)告后，應(yīng)及時(shí)派員到現(xiàn)場(chǎng)診斷，包括流行病學(xué)調(diào)查、

臨床癥狀檢查、病理解剖檢查、采集病料、實(shí)驗(yàn)室診斷等，并根據(jù)診

斷結(jié)果采取相應(yīng)防治措施。

4.2在馬屬動(dòng)物飼養(yǎng)地，確診為馬傳貧病畜后，當(dāng)?shù)乜h級(jí)以上人

民政府畜牧獸醫(yī)行政管理部門(mén)應(yīng)當(dāng)劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)；縣級(jí)

以上地方人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門(mén)和單位采取隔離、撲殺、銷(xiāo)

毀、消毒、限制易感動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品及有關(guān)物品出入等控制、撲滅措

施。

若呈暴發(fā)流行時(shí)，由當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)行政管理部門(mén)，及時(shí)報(bào)請(qǐng)同級(jí)

人民政府決定對(duì)疫區(qū)實(shí)行封鎖，逐級(jí)上報(bào)國(guó)務(wù)院畜牧獸醫(yī)行政管理部

門(mén)。縣級(jí)以上人民政府根據(jù)需要組織有關(guān)部門(mén)和單位采取隔離、撲殺

等強(qiáng)制性控制和撲滅措施，并迅速通報(bào)毗鄰地區(qū)。

4.2.1劃定疫點(diǎn)、疫區(qū)、受威脅區(qū)

疫點(diǎn)指患病馬屬動(dòng)物所在的地點(diǎn)，一般是指患病馬屬動(dòng)物所在

的養(yǎng)殖場(chǎng)（戶(hù)）；散養(yǎng)時(shí)，是指患病馬屬動(dòng)物所在的自然村（屯）；或

其它有關(guān)屠宰、經(jīng)營(yíng)單位。

疫區(qū)疫點(diǎn)外延3公里范圍內(nèi)的區(qū)域，包括病畜發(fā)病前3個(gè)月經(jīng)

常活動(dòng)，可能污染的地區(qū)。疫區(qū)劃分時(shí)注意考慮疫區(qū)的飼養(yǎng)環(huán)境和天

然屏障（如河流、山脈等）。

受威脅區(qū)是指疫區(qū)外延5公里范圍內(nèi)的區(qū)域。

4.2.2封鎖

疫區(qū)封鎖期間，禁止染疫和疑似染疫的馬屬動(dòng)物及其產(chǎn)品出售、

轉(zhuǎn)讓和調(diào)群；繁殖馬屬動(dòng)物要用人工授精方法進(jìn)行配種；種用馬屬動(dòng)

物不得對(duì)疫區(qū)外馬屬動(dòng)物配種；對(duì)可疑馬屬動(dòng)物要嚴(yán)格隔離檢疫；關(guān)

閉馬屬動(dòng)物交易市場(chǎng)。禁止非疫區(qū)的馬屬動(dòng)物進(jìn)入疫區(qū)，并根據(jù)撲滅

疫情的需要對(duì)出入封鎖區(qū)的人員、運(yùn)輸工具及有關(guān)物品采取消毒和其

它限制性措施。

4.2.3隔離

當(dāng)發(fā)生馬傳貧時(shí)，要及時(shí)應(yīng)用臨床檢查、血清學(xué)試驗(yàn)等方法對(duì)可

疑感染馬屬動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，將馬屬動(dòng)物群分為患病群、

疑似感染群和假定健康群三類(lèi)。立即撲殺患病群，隔離疑似感染群、

假定健康群，經(jīng)過(guò)3個(gè)月觀(guān)察，不再發(fā)病后，方可解除隔離。

4.2.4監(jiān)測(cè)

疫區(qū)內(nèi)應(yīng)對(duì)同群馬屬動(dòng)物隔離飼養(yǎng)，所有馬屬動(dòng)物每隔1個(gè)月進(jìn)

行一次血清學(xué)監(jiān)測(cè)；受威脅地區(qū)每3個(gè)月進(jìn)行一次血清學(xué)監(jiān)測(cè)。

4.2.5撲殺

患病馬屬動(dòng)物、陽(yáng)性馬屬動(dòng)物在不放血條件下進(jìn)行撲殺。

4.2.6無(wú)害化處理

病畜和陽(yáng)性畜及其胎兒、胎衣、排泄物等按照GB16548《畜禽病

害肉尸及其產(chǎn)品無(wú)害化處理規(guī)程》進(jìn)行。

4.2.7消毒

對(duì)患病和疑似患病的馬屬動(dòng)物污染的場(chǎng)所、用具、物品嚴(yán)格進(jìn)行

消毒；受污染的糞便、墊料等必須采用堆積密封發(fā)酵1個(gè)月等方法處

理。

4.2.8封鎖的解除

封鎖的疫區(qū)內(nèi)最后一匹陽(yáng)性馬屬動(dòng)物撲殺處理后，并經(jīng)徹底消毒

等處理后，對(duì)疫區(qū)監(jiān)測(cè)90天，未見(jiàn)新病例；且經(jīng)血清學(xué)檢查3次（每

次間隔30天），未檢出陽(yáng)性馬屬動(dòng)物的，對(duì)所污染場(chǎng)所、設(shè)施設(shè)備和

受污染的其它物品徹底消毒，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢查合格后,

方可由原發(fā)布封鎖令機(jī)關(guān)解除封鎖。

5預(yù)防與控制

5.1檢疫

異地調(diào)入的馬屬動(dòng)物，必須來(lái)自非疫區(qū)。

調(diào)出馬屬動(dòng)物的單位和個(gè)人，應(yīng)按規(guī)定報(bào)檢，經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)

督機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢疫（應(yīng)包括血清學(xué)檢查），合格后方可調(diào)出。

馬屬動(dòng)物需憑當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)出具的檢疫證明運(yùn)輸。運(yùn)輸

途中發(fā)現(xiàn)疑似馬傳貧病畜時(shí)，貨主及運(yùn)輸部門(mén)應(yīng)及時(shí)向就近的動(dòng)物防

疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)報(bào)告，確診后，由動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)就地監(jiān)督畜主實(shí)施撲

殺等處理措施。

調(diào)入后必須隔離觀(guān)察30天以上，并經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)兩

次臨床綜合診斷和血清學(xué)檢查，確認(rèn)健康無(wú)病，方可混群飼養(yǎng)。

5.2監(jiān)測(cè)和凈化

5.2.1馬傳貧控制區(qū)、穩(wěn)定控制區(qū)采取“監(jiān)測(cè)、撲殺、消毒、

凈化”的綜合防治措施。每年對(duì)全縣6?12月齡的幼駒，用血清學(xué)方

法監(jiān)測(cè)一次。如果檢出陽(yáng)性馬屬動(dòng)物，除按規(guī)定撲殺處理外，應(yīng)對(duì)疫

區(qū)內(nèi)的所有馬屬動(dòng)物進(jìn)行臨床檢查和血清學(xué)檢查，每隔3個(gè)月檢查一

次，直至連續(xù)2次血清學(xué)檢查全部陰性為止。

5.2.2馬傳貧消滅區(qū)采取“以疫情監(jiān)測(cè)為主”的綜合性防治措

施，每縣每年抽查存欄馬屬動(dòng)物的1%（存欄不足10000匹的，抽檢

數(shù)不少于100匹，存欄不足100匹的全檢），做血清學(xué)檢查，進(jìn)行疫情

監(jiān)測(cè)，及時(shí)掌握疫情動(dòng)態(tài)。

6控制和消滅標(biāo)準(zhǔn)

6.1穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

6.1.1縣級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

A、全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)連續(xù)5年沒(méi)有馬傳貧臨床病例；

B、全縣（市、區(qū)或旗）停止注苗一年后，連續(xù)兩年每年抽檢300

匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿(mǎn)300匹全檢），經(jīng)血清學(xué)檢查，全部陰性。

6.1.2市級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.1.3省級(jí)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.1.4全國(guó)穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)

全國(guó)所有省（市、自治區(qū)）均達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)。

6.2馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

6.2.1縣級(jí)達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)，在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，還應(yīng)

符合以下條件：

全縣（市、區(qū)或旗）范圍內(nèi)在達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)后，連續(xù)兩年每

年抽檢200匹份馬屬動(dòng)物血清（不滿(mǎn)200匹者全檢），血清學(xué)檢查全

部為陰性。

6.2.2市級(jí)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全市（地、盟、州）所有縣（市、區(qū)、旗）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

6.2.3省級(jí)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全省所有市（地、盟、州）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

6.2.4全國(guó)馬傳貧消滅標(biāo)準(zhǔn)

全國(guó)所有省（市、自治區(qū)）均達(dá)到消滅標(biāo)準(zhǔn)。

附件1

馬傳染性貧血瓊脂擴(kuò)散反應(yīng)試行操作方法

1檢驗(yàn)用瓊脂板的制備

1.1取高級(jí)瓊脂糖1克或普通瓊脂1.2克直接放入加有500mL

蒸惚水的三角瓶中，配成2%的瓊脂溶液，在沸水浴中煮沸，全融化

后再冷凝，切成1?l.Scn?小塊，裝入干凈砂布袋中，用10倍量自來(lái)

水沖漂兩天，每天換水兩次，然后改用無(wú)離子水沖漂1?2天，每天

換水兩次。將沖漂完畢的瓊脂小塊裝入1000mL三角燒瓶中，同時(shí)加

入500mL無(wú)離子水再加入相當(dāng)于配制1000mL磷酸緩沖液（PBS液）

或硼酸緩沖液（BBS液）的各種鹽類(lèi)用量，再加入1%硫柳汞溶液10mL,

在沸水浴中使之全融化并混勻。

若是取優(yōu)質(zhì)瓊脂1克時(shí)，可直接放入含有萬(wàn)分之一硫柳汞的

100mL的PBS或BBS液中，用熱水浴融化混勻。

1.2融化后以?xún)蓪蛹啿紛A薄層脫脂棉過(guò)濾，除去不溶性雜質(zhì)。

1.3將直徑90mm的平皿放在水平臺(tái)上，每平皿倒入熱融化瓊脂

液15?18mL,厚度約2.5mm左右，注意不要產(chǎn)生氣泡，冷凝后加蓋，

把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存兩周左右。根據(jù)

受檢血清樣品多少亦可采用大、中、小三種不同規(guī)格的玻璃板。10

X16cm的玻璃板加注熱瓊脂液40mL；6X7cm的加注11mL；32X7.6cm

的加注6mLo

瓊脂經(jīng)處理后配成的瓊脂液，可裝瓶中用膠塞蓋好，以防水分蒸

發(fā)，待使用瓊脂板時(shí)，現(xiàn)融化現(xiàn)倒。

1.4打孔

反應(yīng)孔現(xiàn)用現(xiàn)打。打孔器為外徑5mm直徑的薄壁型金屬打孔器。

在坐標(biāo)紙上畫(huà)好七孔型圖案。把坐標(biāo)紙放在帶有瓊脂板的平皿或玻璃

板下面，照?qǐng)D案在固定位置上用金屬管打孔，將切下的瓊脂板取出,

勿使瓊脂膜與玻璃面離動(dòng)。外周孔徑為5mm,中央孔徑為5mm,孔間

距3mm,如圖1所示。

圖17孔型

(1)(2)

(3)G(4)

(5)(6)

當(dāng)受檢血清數(shù)量多時(shí)，可用如圖2所示的檢測(cè)40份血清的圖案。

圖240孔型

010203040506

+G+G+G+

070809101112

1314151617181920

+G+G+G+G+

2122232425262728

293031323334

+GG+G+

353637383940

注解：圖1、圖2中的“G”字周?chē)鷳?yīng)有圓圈。

2抗原

檢驗(yàn)用抗原按馬傳貧瓊擴(kuò)抗原生產(chǎn)制造及檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)。

3血清

3.1檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清：能與合格抗原在12小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生明顯

致密的沉淀線(xiàn)的馬傳貧血清，做8倍以上的稀釋仍保持陽(yáng)性反應(yīng)者為

宜，小量分裝，凍結(jié)保存，使用時(shí)要注意防止散毒。

3.2受檢血清：來(lái)自受檢馬的不腐敗的血清，勿加防腐劑和抗凝

劑。

4抗原及血清的添加

打孔完畢，在瓊脂板上端寫(xiě)上日期及編號(hào)等。在圖1（7孔型）的

中央孔加抗原，2、5孔加檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，其余1、3、4、6孔

加入受檢血清。在圖2（40份血清）的孔型所有①②③……數(shù)字號(hào)孔分

別加入受檢馬血清，G為加抗原孔，+為加檢驗(yàn)用包被陽(yáng)性血清孔，

加至孔滿(mǎn)為止。平皿加蓋，待孔中液體吸干后，將平皿倒置，以防水

分蒸發(fā)；瓊脂板則放入鋪有數(shù)層濕紗布的帶蓋搪瓷盤(pán)中。置15?30（

條件下進(jìn)行反應(yīng)，逐日觀(guān)察3天并記錄結(jié)果。

5判定

陽(yáng)性：當(dāng)檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間只有一條明顯致密

的沉淀線(xiàn)時(shí)，受檢血清孔與抗原孔之間形成一條沉淀線(xiàn)；或者陽(yáng)性血

清的沉淀線(xiàn)末端向毗鄰的受檢血清的抗原側(cè)偏彎者，此種受檢血清判

定為陽(yáng)性。

陰性：受檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線(xiàn)，或者標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清

孔與抗原孔之間的沉淀線(xiàn)向毗鄰的受檢血清孔直伸或向受檢血清孔

側(cè)偏彎者，此種受檢血清為陰性。

疑似：標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清孔與抗原孔之間的沉淀線(xiàn)末端，似乎向毗鄰

受檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎，但不易判斷時(shí)，可將抗原稀釋2倍、4倍、6

倍、8倍進(jìn)行復(fù)試，最后判定結(jié)果。觀(guān)察時(shí)間可延至5天。

判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)從不同折光角度仔細(xì)觀(guān)察平皿上抗原孔與受檢血

清孔之間有無(wú)沉淀線(xiàn)。

判斷時(shí)要注意非特異性沉淀線(xiàn)。例如當(dāng)受檢馬匹近期注射過(guò)組織

培養(yǎng)疫苗，如乙型腦炎疫苗等，可見(jiàn)與檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的沉淀線(xiàn)

末端不是融合而為交叉狀，兩個(gè)血清間產(chǎn)生的自家免疫沉淀線(xiàn)等。

6溶液的配制

6.1pH7.4的0.Olmol/L磷酸緩沖生理鹽水（PBS液）

6.212水磷酸氫二鈉（NazHPO,?12H20）2.9克

磷酸二氫鉀0.3克

氯化鈉8.0克

無(wú)離子水或蒸儲(chǔ)水加至1000mL

6.3pH8.6硼酸緩沖液（BBS液）

四硼酸鈉8.8克

硼酸4.65克

無(wú)離子水或蒸儲(chǔ)水加至1000mL

6.4硫柳汞溶液

硫柳汞1.?？?/p>

無(wú)離子水或蒸鐳水1000mL

附件2

馬傳染性貧血酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接法）

1總則

本規(guī)程所規(guī)定的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）適用于馬傳染性貧

血（以下簡(jiǎn)稱(chēng)馬傳貧）的檢疫，也可以用于馬傳貧弱毒苗免疫馬的抗

體監(jiān)測(cè)。

2材料準(zhǔn)備

2.1器材

2.1.1聚苯乙烯微量反應(yīng)板

2.1.2酶標(biāo)儀

2.2抗原、酶標(biāo)記抗體和陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清

2.3試驗(yàn)溶液（配置方法見(jiàn)附錄）

2.3.1抗原稀釋掖

2.3.2沖洗液

2.3.3酶標(biāo)記抗體及血清稀釋液

2.3.4底物溶液

2.3.5反應(yīng)終止液

3操作方法

3.1包被抗原

用抗原稀釋液將馬傳貧ELISA抗原作20倍稀釋?zhuān)梦⒘恳埔浩?/p>

將稀釋抗原加到各孔內(nèi)，每孔100U1。蓋好蓋，置4（冰箱放置24

小時(shí)。

3.2沖洗

甩掉孔內(nèi)的包被液，注入沖洗液浸泡3分鐘，甩干，再重新注入

沖洗液，按此方法洗3次。

3.3被檢血清

每份被檢血清及陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清均以血清稀釋液作

20倍稀釋?zhuān)糠荼粰z血清依次加兩孔，每孔加100口1。每塊反應(yīng)板

均需設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照血清各兩孔，蓋好蓋，置37C水浴作用1小

時(shí)。

3.4沖洗

方法同“3.2”。

3.5加酶標(biāo)記抗體

將酶標(biāo)記抗體用稀釋液作1000倍稀釋。每孔加100H1,蓋好蓋，

置372水浴作用1小時(shí)。

3.6沖洗

方法同“3.2”。

3.7加底物溶液

每孔加新配制的底物溶液100口1,于25P?3(TC避光反應(yīng)10分

鐘。

3.8終止反應(yīng)

每孔滴加終止劑25Ulo

3.9比色

用酶標(biāo)測(cè)試儀在波長(zhǎng)492nm下，測(cè)各孔降解產(chǎn)物的吸收值。

4結(jié)果判定

被檢血清兩孔的平均吸收值與同塊板陰性對(duì)照血清兩個(gè)孔的平

均吸收值之比22,且被檢血清吸收值20.2者，為馬傳貧陽(yáng)性。

5附錄

5.1聚苯乙烯微量板的處理

5.1.1將聚苯乙烯微量板用溫水反復(fù)沖洗，徹底沖掉灰塵。

5.1.2用無(wú)離子水沖洗3?4遍，室溫或37匕溫箱晾干，置無(wú)塵

干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2試液的配制

5.2.1抗原稀釋液:0.Imol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液。

甲液:0.Imol/LpH9.5碳酸鈉溶液,稱(chēng)取無(wú)水Na2co3IO.6克，

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

乙液：0.Imol/LpH9.5碳酸氫鈉溶液，稱(chēng)取NaHC038.4克,以

無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

取甲液200mL、乙液700mL混合即成。

5.3沖洗液:0.02mol/LpH7.2PBS-O.05%吐溫-20。

5.3.10.02mol/LpH7.2PBS液

甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液稱(chēng)取Na2HP04.12H2071.64

克，以無(wú)離子水溶液溶解至1000mL。

乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液稱(chēng)取NaH2P.2H2031.21克,

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mL。

取甲液360mL,乙液140mL,NaCL38克，無(wú)離子水溶解至5000mLo

5.3.20.02mol/LpH7.2PBS液1000mL,加吐溫-20液0.5mL

混勻即成。

5.3.3酶標(biāo)記抗體和血清稀釋液：

0.02mol/LpH7.2PBS-0.05%吐溫-20,加0.1%明膠,加10%健康

牛血清。

5.3.4底物溶液：pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液，內(nèi)含0.04%鄰苯

二胺和0.045%過(guò)氧化氫。

5.3.4.1pH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩沖液：

甲液0.Imol/L檸檬酸溶液，稱(chēng)取檸檬酸（C6H8。7?壓0）21.01克

以無(wú)離子水溶液溶解至1000mLo

乙液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液。

取甲液2