病原生物學(xué)(1)課件

病原生物學(xué)(1)2024/1/6病原生物學(xué)(1)微生物的發(fā)現(xiàn)微生物在地球上已存活38億年，但真正觀察到微生物的時(shí)間在17世紀(jì)中后期荷蘭人列文虎克用自制顯微境觀察到，從此，知道了微生物的存在，開始研究發(fā)酵與微生物的關(guān)系。19世紀(jì)60年代法國(guó)科學(xué)家巴斯德(Pasteur)發(fā)現(xiàn)酒變酸可能是微生物的有害作用，然而創(chuàng)立了消毒滅菌方法。病原生物學(xué)(1)此后德國(guó)科學(xué)家柯赫（Koch）發(fā)明了純培養(yǎng)，用滅菌平板培養(yǎng)基分離到單一菌珠形成的單個(gè)菌落。1929年弗來明（Fleming）發(fā)現(xiàn)了青霉菌的抑菌現(xiàn)象——青霉素。20世紀(jì)初，微生物研究成為一門獨(dú)立學(xué)科，發(fā)展迅速，進(jìn)入分子水平和基因水平，中國(guó)人民對(duì)微生物的利用有5千年文明史，但對(duì)微生物的系統(tǒng)研究是20世紀(jì)初，最早是一批西方留學(xué)歸來的科學(xué)家開始系統(tǒng)介紹微生物學(xué)知識(shí)，從此開始微生物學(xué)研究。病原生物學(xué)(1)1910-1921年間，伍連德用近代微生物學(xué)知識(shí)對(duì)鼠疫、霍亂的防治研究，同時(shí)建立了中國(guó)衛(wèi)生防疫機(jī)構(gòu)，培養(yǎng)了一支預(yù)防鼠疫的專業(yè)隊(duì)伍，居國(guó)際領(lǐng)先地位。20世紀(jì)30年代進(jìn)入醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)性研究，如湯飛凡等在醫(yī)學(xué)細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)方面做出了高水平成績(jī)，如沙眼病原體分離和確證具有國(guó)際領(lǐng)先。病原生物學(xué)(1)一些高校開始設(shè)立釀造科目，如魏巖壽等在應(yīng)用微生物、工業(yè)微生物方面做出了開拓性工作，戴芳瀾等創(chuàng)立了我國(guó)真菌學(xué)和植物病理學(xué)。陳華癸和張憲武對(duì)根瘤固氮菌作用研究開始了農(nóng)業(yè)微生物學(xué)。高尚蔭創(chuàng)建了我國(guó)病毒學(xué)基礎(chǔ)理論研究和第一個(gè)微生物學(xué)專業(yè)。病原生物學(xué)(1)總體看，新中國(guó)成立之前，微生物學(xué)研究力量較弱，且分散，未形成研究體系。新中國(guó)成立后，有了長(zhǎng)足發(fā)展，培養(yǎng)了一大批微生物學(xué)人才。近年來，我國(guó)微生物學(xué)的專業(yè)工作者瞄準(zhǔn)世界微生物學(xué)科發(fā)展前沿，進(jìn)行微生物基因組學(xué)研究。病原生物學(xué)(1)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的發(fā)展前景

為了促進(jìn)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的發(fā)展，有效控制和消滅傳染病，應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)以下幾方面的研究：要高度重視、新現(xiàn)、再現(xiàn)病原微生物的研究。病原微生物的致病機(jī)制及機(jī)體抗感染機(jī)制的研究。建立標(biāo)準(zhǔn)化的微生物學(xué)診斷方法及技術(shù)。高效抗感染藥物的研制與開發(fā)。特殊環(huán)境中的微生物研究加強(qiáng)和完善突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處理。病原生物學(xué)(1)生物安全Biosafety一、概念：生物安全是生物技術(shù)安全（Safetyofbiotechnolgy）的簡(jiǎn)稱。狹義講：生物安全是指現(xiàn)代生物技術(shù)的研究、開發(fā)應(yīng)用以及轉(zhuǎn)基因在生物可能對(duì)生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生的潛在危險(xiǎn)（害），特別是轉(zhuǎn)基因活生物體釋放到環(huán)境中對(duì)生物多樣性構(gòu)成的威脅。病原生物學(xué)(1)廣義講：生物安全是指與生物有關(guān)的各種因素對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)、人類健康及生態(tài)環(huán)境所產(chǎn)生的危害或潛在風(fēng)險(xiǎn)。生物安全是一個(gè)系統(tǒng)的概念，從實(shí)驗(yàn)室研究到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，從技術(shù)研發(fā)到經(jīng)濟(jì)活動(dòng)，從個(gè)人安全到國(guó)家安全。都涉及生物安全問題。二、起因：根據(jù)ISO15190:2003(E)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室-安全要求》和WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》第二版（2003年修訂版），由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心、中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院等起草（車?guó)P翔），經(jīng)國(guó)務(wù)院69次常務(wù)會(huì)議通過，形成國(guó)務(wù)院令第424號(hào)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》。病原生物學(xué)(1)凡屬在實(shí)驗(yàn)室從事與病原微生物菌（毒）種、樣本有關(guān)的研究、教學(xué)、檢測(cè)、診斷等活動(dòng)的相關(guān)人員，都應(yīng)履行實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例。三、病原微生物的分類及管理國(guó)務(wù)院根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或群體的危害程度，將病原微生物分類四類：

第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。病原生物學(xué)(1)

第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。

第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。

第四類病原微生物，是指在通常情況下不會(huì)引起人類或者動(dòng)物疾病的微生物。病原生物學(xué)(1)第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。按中華人民共和國(guó)傳染病防治法將傳染病分為甲、乙、丙三類。

甲類傳染病是指：鼠疫、霍亂。

乙類傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。病原生物學(xué)(1)

丙類傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎、麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病。

病原生物學(xué)(1)采集病原微生物樣本應(yīng)當(dāng)具備下列條件：（一）具有與采集病原微生物樣本所需要的生物安全防護(hù)水平相適應(yīng)的設(shè)備；（二）具有掌握相關(guān)專業(yè)知識(shí)和操作技能的工作人員；（三）具有有效的防止病原微生物擴(kuò)散和感染的措施；（四）具有保證病原微生物樣本質(zhì)量的技術(shù)方法和手段。病原生物學(xué)(1)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)立與管理實(shí)驗(yàn)室對(duì)病原微生物的生物安全防護(hù)水平，并依照安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，將實(shí)驗(yàn)室分為一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)。新建、改建、擴(kuò)建三級(jí)、四級(jí)實(shí)驗(yàn)室或者生產(chǎn)、進(jìn)口移動(dòng)式三級(jí)、四級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)遵守下列規(guī)定：病原生物學(xué)(1)（一）符合國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室體系規(guī)劃并依法履行有關(guān)審批手續(xù)；（二）經(jīng)國(guó)務(wù)院科技主管部門審查同意；（三）符合國(guó)家生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范；（四）依照《中華人民共和國(guó)環(huán)境影響評(píng)價(jià)法》的規(guī)定進(jìn)行環(huán)境影響評(píng)價(jià)并經(jīng)環(huán)境保護(hù)主管部門審查批準(zhǔn)；（五）生物安全防護(hù)級(jí)別與其擬從事的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)相適應(yīng)。病原生物學(xué)(1)三級(jí)、四級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可。國(guó)務(wù)院認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理部門確定的認(rèn)可機(jī)構(gòu)應(yīng)當(dāng)依照實(shí)驗(yàn)室生物安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及本條例的有關(guān)規(guī)定，對(duì)三級(jí)、四級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行認(rèn)可；實(shí)驗(yàn)室通過認(rèn)可的，頒發(fā)相應(yīng)級(jí)別的生物安全實(shí)驗(yàn)室證書。證書有效期為5年。一級(jí)、二級(jí)實(shí)驗(yàn)室不得從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。三級(jí)、四級(jí)實(shí)驗(yàn)室從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，應(yīng)當(dāng)具備下列條件：病原生物學(xué)(1)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛿M從事的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)符合國(guó)務(wù)院衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門的規(guī)定；（二）通過實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可；（三）具有與擬從事的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)相適應(yīng)的工作人員；（四）工程質(zhì)量經(jīng)建筑主管部門依法檢測(cè)驗(yàn)收合格。病原生物學(xué)(1)BSL-2實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和設(shè)備基本要求一、設(shè)施要求（一）無須特殊選址、普通建筑物即可，但應(yīng)有防止節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物進(jìn)入的設(shè)計(jì)。（二）在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域外應(yīng)有存放個(gè)人衣物的條件，還應(yīng)當(dāng)有供存儲(chǔ)長(zhǎng)期使用物品的空間。（三）在實(shí)驗(yàn)室門口處應(yīng)設(shè)掛衣裝置。（四）實(shí)驗(yàn)室門應(yīng)帶鎖并可自動(dòng)關(guān)閉。實(shí)驗(yàn)室的門（隔墻）有可視窗。病原生物學(xué)(1)（五）實(shí)驗(yàn)室的墻壁、天花板和地面應(yīng)平整、易清潔、不滲水以及耐化學(xué)品和消毒劑的腐蝕。地面應(yīng)防滑，不得鋪設(shè)地毯。盡可能避免管線暴露在外。（六）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)防水，耐腐蝕、耐熱。（七）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有足夠的存儲(chǔ)空間擺放物品以方便使用。實(shí)驗(yàn)室中的設(shè)備應(yīng)當(dāng)擺設(shè)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)臺(tái)與其他設(shè)備之間應(yīng)保持一定距離，以便于清潔。（八）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)洗手池，宜設(shè)置在靠近出口處。病原生物學(xué)(1)（九）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持通風(fēng)，如使用窗戶自然通風(fēng)，應(yīng)有防蟲紗窗。（十）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保證工作照明，避免不必要的反光和強(qiáng)光。（十一）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)有可靠的電力供應(yīng)和應(yīng)急照明。必要時(shí)，重要設(shè)備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等設(shè)備用電源。（十二）實(shí)驗(yàn)室出口應(yīng)有在黑暗中可明確辨認(rèn)的標(biāo)識(shí)。有適當(dāng)?shù)幕鹁瘓?bào)警器。病原生物學(xué)(1)二、設(shè)備要求：（一）應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜。（二）在實(shí)驗(yàn)室所在的建筑物內(nèi)應(yīng)配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗(yàn)證，以保證符合要求。（三）應(yīng)設(shè)洗眼設(shè)施，必要時(shí)應(yīng)有噴淋裝置。病原生物學(xué)(1)實(shí)驗(yàn)室感染的控制一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)立單位應(yīng)當(dāng)指定專門的機(jī)構(gòu)或人員承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室感染的控制工作?！ㄆ跈z查實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)▲病原微生物菌（毒）種和樣本保存與使用▲安全操作▲實(shí)驗(yàn)室廢水、廢氣排放病原生物學(xué)(1)二、對(duì)病原微生物有關(guān)的傳染病防治知識(shí)進(jìn)行宣傳教育，并定期檢查和了解實(shí)驗(yàn)室工作人員的健康狀況。三、實(shí)驗(yàn)室工作人員出現(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)室從事的高致病性病原微生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)有關(guān)的感染臨床癥狀或體征時(shí)，應(yīng)當(dāng)及時(shí)報(bào)告，并及時(shí)就診救治。病原生物學(xué)(1)四、實(shí)驗(yàn)室如發(fā)生病原微生物泄漏時(shí)，應(yīng)立即采取控制措施，防止病原微生物擴(kuò)散?！龇忾]被病原微生物污染的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所■開展流行病學(xué)調(diào)查■對(duì)病人進(jìn)行隔離治療，對(duì)相關(guān)人員進(jìn)行醫(yī)學(xué)檢查■對(duì)密切接觸者進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察■對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行消毒處理■對(duì)染疫動(dòng)物采取隔離、撲殺病原生物學(xué)(1)法律責(zé)任一、未依照本條例規(guī)定取得從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)資格證書，或取得資格證書但未經(jīng)批準(zhǔn)從事高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的。二、設(shè)立單位未建立健全安全保衛(wèi)制度，未采取安全保衛(wèi)措施的。三、未經(jīng)批準(zhǔn)運(yùn)送高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本。病原生物學(xué)(1)四、實(shí)驗(yàn)室在相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)結(jié)束后，未依照規(guī)定及時(shí)將病原微生物菌（毒）種和樣本就地銷毀或送交相關(guān)部門的。五、實(shí)驗(yàn)室使用新技術(shù)、新方法從事高致病性病原微生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)未經(jīng)國(guó)家生物安全專家委員會(huì)論證的。六、未經(jīng)批準(zhǔn)擅自從事在我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或已經(jīng)宣布消滅的病原微生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的。七、在同一實(shí)驗(yàn)室的同一區(qū)域內(nèi)同時(shí)從事兩種或以上的高致病性病原微生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的。病原生物學(xué)(1)緒論第一節(jié)微生物和病原微生物的概念一.微生物（microorganism）（一）定義：微生物(Microorganism)是存在于自然界中的一大群,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體形微小、肉眼看不見，必須借助光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡放大數(shù)百倍、數(shù)千倍，甚至數(shù)萬倍才能觀察到的微小生物。病原生物學(xué)(1)（二）種類種類繁多，10萬種以上，按其大小、結(jié)構(gòu)、組成，從生物學(xué)角度分為三大類，即非細(xì)胞型微生物：病毒原核細(xì)胞型微生物：細(xì)菌、放線菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體真核細(xì)胞型微生物：真菌歸納：一毒三菌四體

病原生物學(xué)(1)（三）分布自然界的分布：（無處不有、無孔不入、無時(shí)不在）正常人體的分布。病原微生物：具有致病性的能引起人和動(dòng)物、植物病害的少數(shù)微生物。病原生物學(xué)(1)第一章細(xì)菌的基本性狀

第一節(jié)細(xì)菌大小與形態(tài)一、細(xì)菌的大小與測(cè)量單位測(cè)量細(xì)菌的單位—微米（m）二、細(xì)菌形態(tài)

(一)球菌(二)桿菌(三)螺形菌第一篇醫(yī)學(xué)微生物學(xué)基礎(chǔ)病原生物學(xué)(1)細(xì)菌的基本形態(tài)病原生物學(xué)(1)細(xì)菌的結(jié)構(gòu)分為基本結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu)

一、細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核質(zhì)。細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)模式圖第二節(jié)細(xì)菌的結(jié)構(gòu)病原生物學(xué)(1)1.革蘭陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁(1)組成成分：主要成分——肽聚糖（胞壁質(zhì)、粘肽）次要成分——磷壁酸肽聚糖（聚糖骨架、四肽側(cè)鏈、五肽交聯(lián)橋）(2)結(jié)構(gòu)形式：肽聚糖為三維立體結(jié)構(gòu)，具有機(jī)械強(qiáng)度十分堅(jiān)韌，另有磷壁酸附著表面。病原生物學(xué)(1)革蘭陽(yáng)性菌肽聚糖的結(jié)構(gòu)病原生物學(xué)(1)(2)革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁特殊成分——磷壁酸分類：壁磷壁酸、膜磷壁酸作用：1.革蘭陽(yáng)性菌的表面抗原2.參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子進(jìn)出3.與染色有關(guān)4.與致病有關(guān)病原生物學(xué)(1)病原生物學(xué)(1)2.革蘭陰性菌的細(xì)胞壁：(1)組成成分：肽聚糖（少量）外膜（主要部分）(2)結(jié)構(gòu)形式肽聚糖為二維平面結(jié)構(gòu)、單層平面、疏松、外有外膜加固，病原生物學(xué)(1)革蘭陰性菌肽聚糖結(jié)構(gòu)病原生物學(xué)(1)革蘭陰性菌細(xì)胞壁特殊成分——外膜組成：脂蛋白、脂質(zhì)雙層、脂多糖（酯質(zhì)A、核心多糖、特異多糖）病原生物學(xué)(1)

革蘭陽(yáng)性菌與陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較革蘭陽(yáng)性菌革蘭陰性菌構(gòu)型三維立體、堅(jiān)韌平面網(wǎng)絡(luò)、疏松肽聚糖厚、多層，50層薄、層少，1-2層糖脂含量糖多脂少糖少脂多特殊成分磷壁酸外膜意義：導(dǎo)致兩類細(xì)菌在染色性、致病性及對(duì)藥物的敏感性等方面不同。例如：青霉素，溶菌酶病原生物學(xué)(1)3.細(xì)胞壁的功能

①維持細(xì)菌固有形態(tài)②保護(hù)細(xì)菌抵抗低滲環(huán)境③參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換④決定細(xì)菌抗原性⑤與致病性有關(guān)病原生物學(xué)(1)4.細(xì)菌細(xì)胞壁缺陷型(細(xì)菌L型，bacterialLform)

概念：是細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)受到理化因素或生物因素的直接破壞或合成被抑制而導(dǎo)致細(xì)胞壁缺陷。特點(diǎn)：具有生命力，致病性和抗原性。有形態(tài)及染色性變化。具有高滲透壓生長(zhǎng)特性。具有對(duì)原菌敏感抗生素的耐受性。病原生物學(xué)(1)2.細(xì)胞膜中介體（擬線粒體）

概念：是細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)陷，折疊所形成的囊狀或管狀結(jié)構(gòu)。種類：側(cè)中介體和橫隔中介體。

功能：由于呼吸酶含量增多，參與細(xì)菌細(xì)胞呼吸，與細(xì)胞代謝相關(guān)。橫隔中介體還與細(xì)胞分裂有關(guān)。病原生物學(xué)(1)3.細(xì)胞質(zhì)(1)核糖體：細(xì)菌合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所(2)質(zhì)粒（plasmid）概念：是存在于菌細(xì)胞內(nèi)、獨(dú)立于染色體外的一種遺傳物質(zhì)，為雙鏈環(huán)狀DNA，不受染色體控制，可自我復(fù)制，也可隨意丟失。種類：有F質(zhì)粒、R質(zhì)粒和VI質(zhì)粒。(3)胞質(zhì)顆粒：異染顆粒4.核質(zhì)病原生物學(xué)(1)二、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)1.莢膜（capsule）概念：是某些z細(xì)菌細(xì)胞壁外包繞的一層粘液性物質(zhì)。

種類：真莢膜(>0.2μm)、微莢膜(<0.2μm)成分：多糖或多肽形成條件：營(yíng)養(yǎng)豐富、動(dòng)物體內(nèi)

功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)的損傷作用具有抗原性病原生物學(xué)(1)2.鞭毛（flagellum）概念：是附著于某些細(xì)菌表面細(xì)長(zhǎng)、柔軟，呈波浪狀彎曲的絲狀物。種類：根據(jù)數(shù)目、位置分四種

成分：蛋白質(zhì)（彈性纖維蛋白）

功能：運(yùn)動(dòng)器官（數(shù)目與運(yùn)動(dòng)力無關(guān)）與致病性有關(guān)具有抗原性

檢查：電鏡觀察、特殊染色、暗視野觀察半固體穿刺、平板接種病原生物學(xué)(1)革蘭陰性細(xì)菌鞭毛的構(gòu)造細(xì)菌鞭毛的類型病原生物學(xué)(1)3.菌毛（pilus）概念：是附著于某些細(xì)菌表面，比鞭毛的數(shù)目眾多，纖細(xì)、短而直的絲狀物。種類：普通菌毛、性菌毛功能：與細(xì)菌的致病性有關(guān)性菌毛為中空管狀，能通過接合傳遞質(zhì)粒，故與細(xì)菌的變異有關(guān)

特點(diǎn)：由于纖細(xì)普通光鏡不能觀察，需電鏡觀察。病原生物學(xué)(1)4.芽胞（spore）概念：是某些細(xì)菌在一定條件下，胞漿脫水濃縮在菌體內(nèi)形成的圓形或橢圓形小體。

種類：根據(jù)形態(tài)、大小、位置分若干種。意義：有鑒別細(xì)菌的作用芽胞對(duì)環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，可作為臨床上消毒滅菌的指標(biāo)形成：一個(gè)細(xì)菌一個(gè)芽胞

不利條件有利條件一個(gè)繁殖體病原生物學(xué)(1)細(xì)菌芽胞形態(tài)示意圖細(xì)菌芽胞結(jié)構(gòu)示意圖病原生物學(xué)(1)

組成：元素、化合物、無機(jī)鹽、水

物理性狀：光學(xué)性質(zhì)、表面積、帶電現(xiàn)象、半透性、滲透壓第三節(jié)細(xì)菌的化學(xué)組成與物理性狀病原生物學(xué)(1)第四節(jié)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)繁殖條件1.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2.pH3.溫度根據(jù)細(xì)菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍不同可分為：嗜冷菌：生長(zhǎng)范圍(5℃~30℃)最適溫度(10℃~20℃)嗜溫菌：生長(zhǎng)范圍(10℃~45℃)最適溫度(20℃~40℃)嗜熱菌：生長(zhǎng)范圍(25℃~95℃)最適溫度(50℃~60℃)病原生物學(xué)(1)

4.氣體：O2、CO2、混合氣體

根據(jù)細(xì)菌對(duì)氧的要求不同將細(xì)菌分為四類：（1）專性需氧菌：結(jié)核桿菌（2）微需氧菌：幽門螺桿菌（3）兼性厭氧菌：大多數(shù)病原菌（4）專性厭氧菌：破傷風(fēng)桿菌病原生物學(xué)(1)專性厭氧菌在有氧環(huán)境中不能生長(zhǎng)的機(jī)制：缺乏氧化還原電勢(shì)高的呼吸酶—細(xì)胞色素和細(xì)胞色素氧化酶缺乏分解有毒氧基團(tuán)的酶—超氧化物歧化酶、觸酶和過氧化物酶

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖1.細(xì)菌個(gè)體的生長(zhǎng)繁殖2.細(xì)菌群體的生長(zhǎng)繁殖

病原生物學(xué)(1)生長(zhǎng)曲線:（1）遲緩期：（2）對(duì)數(shù)期：研究細(xì)菌的生物學(xué)性狀在此期（3）穩(wěn)定期：細(xì)菌代謝產(chǎn)物多在此期產(chǎn)生（4）衰亡期：病原生物學(xué)(1)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線圖病原生物學(xué)(1)

細(xì)菌代謝及代謝產(chǎn)物

1.分解代謝產(chǎn)物(1)糖發(fā)酵試驗(yàn)（單糖發(fā)酵試驗(yàn)）病原生物學(xué)(1)(2)甲基紅試驗(yàn)丙酮酸分解產(chǎn)生其他酸類使培養(yǎng)基PH低于4.5加入甲基紅指示劑數(shù)滴顯紅色為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性顯桔黃色為甲基紅試驗(yàn)陰性大腸桿菌病原生物學(xué)(1)(3)VP試驗(yàn)葡萄糖些細(xì)菌某分解丙酮酸乙酰甲基甲醇鹼性環(huán)境中氧化二乙酰培養(yǎng)基中精氨酸所含胍基生成紅色化合物（VP試驗(yàn)陽(yáng)性）脫羧縮合病原生物學(xué)(1)(4)吲哚試驗(yàn)

培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)中的色氨酸某些細(xì)菌具有色氨酸酶分解吲哚（靛基質(zhì)）無色氣體加入吲哚試劑形成玫瑰紅色吲哚病原生物學(xué)(1)(5)硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基中的含硫氨基酸某些細(xì)菌能分解產(chǎn)生硫化氫（H2S）無色氣體，遇鉛或亞鐵離子形成黑色的硫化鉛或硫化鐵病原生物學(xué)(1)(6)枸椽酸鹽還原試驗(yàn)細(xì)菌能利用的碳源只有枸櫞酸鹽，當(dāng)某種細(xì)菌利用枸櫞酸鹽時(shí)，可將其分解為碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。指示劑溴麝香草酚蘭由淡綠色變成深藍(lán)色。合成性代謝產(chǎn)物

1.熱原質(zhì)2.毒素和侵襲性酶

3.色素4.抗生素

5.細(xì)菌素6.維生素病原生物學(xué)(1)細(xì)菌人工培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)基、細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及用途。意義：1.研究細(xì)菌2.傳染病診斷3.研制生物制品4.基因工程第六節(jié)細(xì)菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)檢查病原生物學(xué)(1)病原微生物感染的實(shí)驗(yàn)診斷一、標(biāo)本采集的基本原則1、根據(jù)感染特征：采集相應(yīng)標(biāo)本，無定位體征常取血樣本2、盡早采集：▲疾病早期▲使用抗菌藥物之前▲未出現(xiàn)繼發(fā)感染及合并癥之前▲機(jī)體免疫因素未形成之前病原生物學(xué)(1)3、無菌采集：避免人為污染，確保結(jié)果可靠性。4、正確運(yùn)送及保存：標(biāo)本采集后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室最好在2h之內(nèi)，用于培養(yǎng)的標(biāo)本不應(yīng)超過24h。5、標(biāo)本量必須滿足檢驗(yàn)需要：如血液成人5~10ml，嬰幼兒1~3ml?！裱囵B(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基與血液標(biāo)本量比例應(yīng)大于10:1●呼吸道：上呼吸道取咽拭子，鼻咽試子，下呼吸道取痰液（晨疾最佳）●尿液標(biāo)本：中段尿、腎盂尿、膀胱穿刺病原生物學(xué)(1)●糞便：膿血粘液區(qū)2~3g，液體便1~2ml●腦脊液：腰椎穿刺采集3~5ml●生殖道：分泌物、宮頸粘液●膿液、胸腹水：穿刺法病原生物學(xué)(1)二、病原微生物的形態(tài)學(xué)檢查1、顯微鏡■普通光學(xué)顯微鏡：光源、單雙目■暗視野顯微鏡：通過遮光板形成暗場(chǎng)背景■熒光顯微鏡：產(chǎn)生365~435nm之間波長(zhǎng)■相差顯微鏡：通過相差板的光柵作用，使光相差異轉(zhuǎn)換成光的強(qiáng)度差異?！龅怪蔑@微鏡：光線從物體背面穿透■電子顯微鏡：利用電子流代替可見光，波長(zhǎng)一般為0.005nm■病原生物學(xué)(1)2、不染色標(biāo)本檢查：用于觀察病原微生物活體的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，常用懸滴法、壓滴法、毛細(xì)管法3、染色標(biāo)本檢查：★染色原理：目前使用的染料一般為人工合成染料，為一種含有色基和助色基的苯環(huán)有機(jī)化合物，前者賦予化合物顏色，后者賦予化合物結(jié)合能力?！锶玖闲再|(zhì)：目前醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用染料有三種：酸性染料：顯色離子帶負(fù)電荷，如剛果紅堿性染料：顯色離子帶正電荷，如結(jié)晶紫復(fù)合染料（中性染料）：如伊紅美蘭★染色方法：分單染色法和復(fù)染色法，前者有正染和負(fù)染色法，后者有革蘭染色、抗酸染色、熒光染色★另外有特殊染色法：如英膜染色、芽胞染色、鞭毛染色病原生物學(xué)(1)三、病原微生物的分離培養(yǎng)1、培養(yǎng)基（概念、種類）2、接種方法液體：研磨接種法涂布接種法半固體：穿刺接種法傾注接種法固體斜面：蜿延劃線接種法固體平板：連續(xù)分區(qū)劃線接種法病原生物學(xué)(1)3、培養(yǎng)方法普通培養(yǎng)：37℃、18~24h二氧化碳培養(yǎng)：5~10%CO2環(huán)境（燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱）厭氧培養(yǎng)基：物理、化學(xué)、生物法四、病原微生物的代謝產(chǎn)物檢測(cè)與鑒定1、糖發(fā)酵試驗(yàn)2、氧化-發(fā)酵試驗(yàn)（O-F試驗(yàn)）病原生物學(xué)(1)常用鑒定方法有：

1.雙歧索引對(duì)于較特征性的細(xì)菌來說，雙歧索引較為方便實(shí)用，對(duì)少數(shù)相互區(qū)別較困難的細(xì)菌，鑒定項(xiàng)目較多顯得繁瑣。2.表解法：將各種菌及其多種特性列成炬陣表格，顯而易見，便于分析。3.數(shù)碼鑒定法將生化反應(yīng)模式 數(shù)學(xué)模式某細(xì)菌的生化反應(yīng)結(jié)果 數(shù)字再將獲得的數(shù)字細(xì)菌名稱轉(zhuǎn)化成查閱檢索手冊(cè)轉(zhuǎn)化成病原生物學(xué)(1)病原生物學(xué)(1)病原微生物的分子生物學(xué)檢測(cè)一、核酸雜交：1、核酸雜交技術(shù)檢測(cè)病原微生物核酸是臨床診斷學(xué)的重大發(fā)現(xiàn)，是基因組相似性研究中更加直接的方法。其原理是利用雙鏈DNA加熱后產(chǎn)生的單鏈DNA混合物，在溫度降低并保持恒溫25℃（低于溶點(diǎn)溫度）時(shí)，互補(bǔ)序列會(huì)發(fā)生重新配對(duì)，形成穩(wěn)定的雙鏈DNA。病原生物學(xué)(1)將分離于不同微生物的DNA單鏈混合，并保持在一定的恒溫條件下，DNA的互補(bǔ)序列發(fā)生配對(duì)，形成雜交DNA雙鏈，該過程稱交雜（Hybridization）常用帶有酶、化學(xué)熒光物或放射性同位素標(biāo)記的已知序列核苷酸單鏈作為探針，在一定恒溫條件下，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，探針與待測(cè)標(biāo)本中的核酸雜交，通過雜交信號(hào)的檢測(cè)，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原微生物基因及其分子大小。病原生物學(xué)(1)將未標(biāo)記的來源于某種微生物DNA單鏈固定于硝酸纖維膜或民龍膜上，在適宜溫度下與用32P、3H或14C放射性標(biāo)記的已知微生物DNA單鏈片段進(jìn)行雜交，如果雜交同源性在70%以上，熔點(diǎn)溫度（Tm）相差小于5%，則可以認(rèn)為是同一微生物的不同菌珠。病原生物學(xué)(1)一、細(xì)菌DNA由四個(gè)堿基組成：鳥嘌呤（G）腺嘌呤（A）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）嚴(yán)格的堿基配對(duì)：A＝TG＝C常以G＋C堿基對(duì)的摩爾百分比來測(cè)定細(xì)菌DNA四個(gè)堿基對(duì)的含量來鑒定細(xì)菌。病原生物學(xué)(1)二、細(xì)菌DNA提取過程(一)細(xì)菌的培養(yǎng)及細(xì)菌收集細(xì)菌培養(yǎng)：液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)細(xì)菌收集：一般要求收集2-3克濕菌體(二)細(xì)菌破壁1.超聲波破壁法2.氧化鋁磨碎法3.反復(fù)凍融法4.化學(xué)試劑破壁法，十二烷基磺酸鈉“SDS”5.溶菌酶溶解法6.其他方法：細(xì)菌研磨法、玻璃珠研磨法。病原生物學(xué)(1)三、細(xì)菌DNA的提取方法(一)Marmur氯仿提取法濕菌體2~3克離心洗滌一次懸浮于30~35ml250g/L的SDS于60℃加熱10分鐘，使之破裂加入5mol/LNaCIO4(終濃度為1mol/L)置入帶塞的玻璃溶器中，加入等體積的氯仿一異戊醇(24:1v/v)5000~1000r/min離心5min分層0.1mol/LNaCl50ml溶液0.1mol/LEDTApH8.0溶液冷卻到室溫后振蕩20min上層水相含核酸中層蛋白質(zhì)下層氯仿一異戊醇病原生物學(xué)(1)吸出上層含核酸的水相加入二倍體積的乙醇用攪拌棒攪拌用棒卷出絲狀DNA，靠壁擠干再充分溶于10~15ml0.1SSC(0.15mol/LNaCl~0.15mol/L檸檬酸三鈉)Ph7.0±0.2簡(jiǎn)稱ISSC稀釋10倍為0.1SSC待全部溶解，再用10SSC(1SSC濃縮10倍)調(diào)整到約1SSC的濃度再與等體積的氯仿一異戊醇一起振蕩15min重復(fù)一次進(jìn)行清除蛋白，直到看不見變性蛋白為止病原生物學(xué)(1)注意：1.被溶解的細(xì)菌濃度不能太低。2.SDS為陰離子去污劑，各廠家、批號(hào)、等級(jí)差異較大。3.離心分層后，取水相液體要準(zhǔn)確。病原生物學(xué)(1)(二)細(xì)菌DNA中G+C摩爾百分比測(cè)定1.化學(xué)方法用電泳和層析等技術(shù)2.物理方法用熱變性溫度(目前常用方法)G+C摩爾百分比測(cè)定，是細(xì)菌分類鑒定的一種重要方法。缺點(diǎn)：不能表達(dá)出DNA堿基的排列順序。病原生物學(xué)(1)核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)（techniqueofnucleicacidhybridization）是由現(xiàn)代分子生物學(xué)的重要方法之一。是用特定標(biāo)記的已知核酸序列與待測(cè)核酸進(jìn)行特異性的雜交結(jié)合，形成雜交體，并利用相應(yīng)的顯示技術(shù)來檢測(cè)目標(biāo)核酸的存在及其位置的分子生物學(xué)方法。病原生物學(xué)(1)一、核酸探針(DNA探針)就是指帶有標(biāo)記物的，能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知核酸序列片段。(一)核酸探針的種類根據(jù)標(biāo)記方法放射性探針非放射性探針根據(jù)核酸性質(zhì)DNA探針CDNA探針RNA探針寡核苷酸探針病原生物學(xué)(1)1.NDA探針DNA探針是目前最常用的核酸探針，因具有三大優(yōu)點(diǎn)：這類探針克隆在質(zhì)粒載體上，可無限繁殖，取之不盡；DNA探針與RNA探針相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性；DNA探針標(biāo)記方法較成熟，制備方法簡(jiǎn)便。DNA探針一般長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)，可以是雙鏈DNA，也可是單鏈DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。病原生物學(xué)(1)2.CDNA探針CDNA是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子(complementaryDNA)，CDNA是由RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，這種DNA探針不含有內(nèi)含子序列，尤其適用基因表達(dá)檢測(cè)。3.RNA探針是一類很有前途的核酸探針，常用細(xì)胞mRNA和病毒RNA，具有高雜交效率。但易降解，標(biāo)記復(fù)雜之缺點(diǎn)。病原生物學(xué)(1)4.寡核苷酸探針根據(jù)某一特殊核酸序列，選擇其中最穩(wěn)定區(qū)域，經(jīng)人工合成，為18~30個(gè)堿基，能識(shí)別一個(gè)堿基。具有以下特點(diǎn)：由于鏈短，序列復(fù)雜底低，分子量小，交雜耗時(shí)短；一次性可合成大量寡核苷酸探針；短探針，堿基錯(cuò)配能降低雜交體的Tm值。病原生物學(xué)(1)二、標(biāo)記物32P半衰期14.3d35S半衰期87.1d14C半衰期125I半衰期60d3H半衰期12.3年病原生物學(xué)(1)三、基因重組載體載體的功能是將一個(gè)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞具體的條件1.其本身是復(fù)制子，能自我復(fù)制。2.分子量小，帶有選擇標(biāo)記。3.對(duì)幾種限制性內(nèi)切酶有單一切點(diǎn)。4.并有一定非必要區(qū)，允許外源基因插入。病原生物學(xué)(1)Southern印跡雜交兩個(gè)主要過程：一是將待測(cè)核酸分子通過一定方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上(即印跡，blotting)。二是固定于膜上的核酸同標(biāo)記的探針在一定溫度和離子強(qiáng)度下退火(復(fù)性)即分子雜交過程。病原生物學(xué)(1)一、待測(cè)核酸樣品的制備病毒感染的細(xì)胞組織或分泌物提取DNA酚/氯仿抽取法用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA0.1~1μg待切DNA適當(dāng)限制性內(nèi)切酶緩沖液20~50ul用滅菌Eppendorf管置合適溫度下保溫一個(gè)小時(shí)，加入EDTA65℃加熱滅活限制性內(nèi)切酶樣品DNA病原生物學(xué)(1)二、瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNADNA樣品0.3~3%瓊脂糖凝膠在一定電場(chǎng)下進(jìn)行電泳1~3h得到很多DNA條帶將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理移到堿性溶液(0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl)在用中性pH的緩沖液(0.5mol/LTris-HClpH7.51.5mol/LNaCl)使DNA變性并斷裂形成較短的單鏈DNA片段中和凝膠中的緩沖液在20×SSC中平衡凝膠10min保持單鏈狀態(tài)DNA片段，易于同探針雜交病原生物學(xué)(1)三、轉(zhuǎn)膜將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上(硝酸纖維膜)(必須保持凝膠電泳時(shí)區(qū)帶位置不變)病原生物學(xué)(1)四、雜交(一)預(yù)雜交DNA片段與探針進(jìn)行雜交前必須先進(jìn)行預(yù)雜交，因能結(jié)合DNA片段的膜，同樣能結(jié)合探針DNA，所以須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。(二)正式雜交病原生物學(xué)(1)五、放射性自顯影用放射性同位素標(biāo)記dNTP（2’-單脫氧核苷酸），測(cè)定核酸序列是應(yīng)用最早。放射性試劑a-32p有強(qiáng)放射性和散射性，少用a-35S標(biāo)記dATP，高自顯影條帶分辨率病原生物學(xué)(1)Northern印跡雜交

(Northernblotting)一、原理：是將RNA樣品通過瓊脂凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用帶標(biāo)記物的探針對(duì)固相膜上的RNA進(jìn)行雜交，常用于RNA病毒核酸的檢測(cè)。病原生物學(xué)(1)二、步驟1.RNA樣品提取氯化鋰—尿素法熱酚法PolgA+的寡聚dT纖維素親和法2.電泳分離：甲醛瓊脂糖凝膠電泳3.轉(zhuǎn)移和紫外線交聯(lián):將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜后，用波長(zhǎng)254nm，600μw/cm2，紫外線燈下，曝光5min，取出尼龍膜置80℃，烘烤60min后尼龍膜即可雜交。4.雜交與結(jié)果檢測(cè)病原生物學(xué)(1)原位雜交是用特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針，與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，此雜交能保持細(xì)胞的完整性，但能對(duì)細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行定性、定位測(cè)定。病原生物學(xué)(1)臨床標(biāo)本組織切片經(jīng)甲醛溶液固定經(jīng)石蠟包埋將標(biāo)本片和組織片上加入探針如果是細(xì)菌菌落稱菌落原位雜交如果是細(xì)胞稱組織原位雜交病原生物學(xué)(1)斑點(diǎn)雜交硝酸纖維素膜具有吸附單鏈DNA或RNA的特性，可將樣品直接點(diǎn)在樣品膜上，經(jīng)變性，固定后進(jìn)行雜交，稱斑點(diǎn)雜交(dotblothybridization)。病原生物學(xué)(1)免疫印跡法(immunoblot)免疫印跡法，也稱免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)。1975年southern首先用于分析核酸，故稱核酸印跡，southernblot。1977年Alwine將此法用RNA研究，取名Northernblot1979年Towbin，又?jǐn)U展到蛋白分析，又稱蛋白印跡。其后，Burnetle則名之為Westernblot，以后Gershou改稱為immunoblot。1982年Reinhart將此方法中轉(zhuǎn)移電泳一步省去，而采用直接吸印法，因而把該法改良后，又稱Easternblot病原生物學(xué)(1)基本原理：是將凝膠電泳與固相免疫測(cè)定兩種方法結(jié)合起來的一種技術(shù)。方法步驟：

1.將抗原物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多糖)通過聚苯烯酰胺凝膠電泳分離。2.將電泳分離的組分轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)上(硝酸纖維素濾紙)。3.轉(zhuǎn)移后的組分進(jìn)行免疫法測(cè)定。病原生物學(xué)(1)應(yīng)用范圍：1.病原體抗原的鑒定與分析，篩選尋找特異性抗原。2.抗體的鑒定與分析，分析患者對(duì)不同抗原組分的抗體應(yīng)答狀態(tài)，目前用于艾滋病的診斷。3.免疫復(fù)合物的分析。病原生物學(xué)(1)一、基本原理：是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，但反應(yīng)體系較為簡(jiǎn)單。包括變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)反應(yīng)。(1)變性：通過加熱(95℃)使雙鏈DNA解開成單鏈DNA。(2)退火(引物粘合)：當(dāng)溫度突然降低時(shí)(55℃)，濃度很高的引物與其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3’-OH末端。聚合酶鏈反應(yīng)PCR病原生物學(xué)(1)（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4種dNTP及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化引物在3’端不斷延伸，在模板DNA鏈上形成新鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增1倍。（4）在DNA聚酶作用下，引物擴(kuò)增延伸，每經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸一個(gè)循環(huán)，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作為下一循環(huán)的模板，經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后原DNA量增加至106-109倍（拷貝）病原生物學(xué)(1)病原生物學(xué)(1)病原生物學(xué)(1)病原生物學(xué)(1)引物的要求：▲長(zhǎng)度在15-30bP▲G+C含量應(yīng)在45-55%之間▲堿基分布均勻，避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上▲

自身無互補(bǔ)序列▲兩個(gè)引物之間同源堿基小于4個(gè)病原生物學(xué)(1)以上三步構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，大約經(jīng)25-30次循環(huán)反應(yīng)，可使特異性DNA片段擴(kuò)增100萬倍(2小時(shí))。（1）兩種引物：為保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)DNA鏈的3’-端。引物決定了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及其特異性，引物設(shè)計(jì)及合成的優(yōu)劣直接涉及有效擴(kuò)增能否成功，引物設(shè)計(jì)應(yīng)考慮下述原則:病原生物學(xué)(1)

①引物長(zhǎng)度：15—30個(gè)堿基為宜，引物過短會(huì)使特異性降低，引物越長(zhǎng)，擴(kuò)增的特異性越好，但敏感性相應(yīng)下降。

②G+C含量：在40%-60%為宜，引物Tm值可用公式計(jì)算：Tm=4（G+C）+2（A+T）

③堿基分布的隨機(jī)性。應(yīng)盡量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3’端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。病原生物學(xué)(1)

④引物自身：不應(yīng)該存在互補(bǔ)序列，連續(xù)互補(bǔ)堿基不能多于3bp，否則引物自身會(huì)折疊形成發(fā)夾狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。

⑤兩個(gè)引物之間不應(yīng)該有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊，以防形成二聚體。

⑥引物的3’端：引物的3’端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。引物的3’端最佳堿基選擇是G和C，因?yàn)樗鼈冃纬傻膲A基配對(duì)比較穩(wěn)定。

病原生物學(xué)(1)⑦引物的5’端：引物的5’端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此可以被修飾。引物的5’端的修飾包括加酶切位點(diǎn)，標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，引入突變位點(diǎn)等。⑧引物的特異性：引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性不要超過90%或有8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。病原生物學(xué)(1)(2)耐熱Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：這是在耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可保證在95℃，30分鐘以上不會(huì)變性失活。0.5-5U/100μL。(3)四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPs。20-200μM。(4)緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤簆H值。10-50mmol/LTris-HCl(室溫pH8.3-8.8,72℃pH7.2)。(5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs濃度高0.5-2.5mmol/L。病原生物學(xué)(1)三.反應(yīng)條件(1)溫度和時(shí)間變性:95℃,30S；退火：45℃-55℃，30S-1min；延伸：72℃，<1kb延伸1min,3-4kb需3-4min(2)循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度,理論上循環(huán)225次后,PCR產(chǎn)物的累積即達(dá)最大值,但實(shí)際操作中,每步反應(yīng)不可能達(dá)100%效率,一般按75%計(jì)算25-30次比較合理,循環(huán)次數(shù)太少,產(chǎn)物的量不多,循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)導(dǎo)致PCR反應(yīng)”平臺(tái)效應(yīng)”的出現(xiàn)。

病原生物學(xué)(1)擴(kuò)增產(chǎn)物分析

◆凝膠電泳分析法

◆斑點(diǎn)雜交分析法

◆酶譜分析法根據(jù)酶切位置

◆序列分析法病原生物學(xué)(1)四、PCR技術(shù)的特點(diǎn)1.高度的敏感性PCR產(chǎn)物的生成是以指數(shù)方式增加的，它可對(duì)單拷貝基因、單個(gè)細(xì)胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析。2.高度的特異性在PCR實(shí)驗(yàn)中，只要引物設(shè)計(jì)合理，反應(yīng)溫度適宜（>50~55℃），其擴(kuò)增的特異性是很高的。其它因素如：酶濃度、dNTP、Mg2+、pH等對(duì)PCR的忠實(shí)性也有一定的影響。

病原生物學(xué)(1)3.操作簡(jiǎn)便、迅速已有多種類型的PCR擴(kuò)增儀，只需把反應(yīng)材料按一定的比例混合，置于儀器內(nèi)，反應(yīng)便會(huì)按所輸入的程序進(jìn)行。4.適用樣品廣PCR可特異擴(kuò)增任何微量（pg、ng）的目的DNA或RNA片段，樣品既可以是純化的，又可以是粗制的；既可以是新鮮組織，也可以是陳舊樣品；既可以是細(xì)胞，又可以是體液；既可以是完整的大分子DNA，也可以是部分降解的DNA。因此，PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增樣品的要求不嚴(yán)格。病原生物學(xué)(1)五、PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用由于PCR技術(shù)敏感、特異且操作簡(jiǎn)便，加上商品化PCR試劑盒的廣泛應(yīng)用，使得PCR在臨床疾病的診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定中具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值，并能為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所接受。1.PCR用于感染性疾病病原體的診斷和研究（病毒、細(xì)菌、寄生蟲檢測(cè)）2．遺傳性疾病及腫瘤的診斷病原生物學(xué)(1)第八節(jié)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)是臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的重要組成部分。具有以下實(shí)用價(jià)值：1、分離鑒定病原體2、測(cè)定細(xì)菌的毒力LD50、ID503、制備免疫血清4、建立致病動(dòng)物模型，很多疾病的機(jī)制，首先采用動(dòng)物模型進(jìn)行研究所證實(shí)5、