病原生物學(1)課件

病原生物學(1)2024/1/6病原生物學(1)微生物的發(fā)現微生物在地球上已存活38億年，但真正觀察到微生物的時間在17世紀中后期荷蘭人列文虎克用自制顯微境觀察到，從此，知道了微生物的存在，開始研究發(fā)酵與微生物的關系。19世紀60年代法國科學家巴斯德(Pasteur)發(fā)現酒變酸可能是微生物的有害作用，然而創(chuàng)立了消毒滅菌方法。病原生物學(1)此后德國科學家柯赫（Koch）發(fā)明了純培養(yǎng)，用滅菌平板培養(yǎng)基分離到單一菌珠形成的單個菌落。1929年弗來明（Fleming）發(fā)現了青霉菌的抑菌現象——青霉素。20世紀初，微生物研究成為一門獨立學科，發(fā)展迅速，進入分子水平和基因水平，中國人民對微生物的利用有5千年文明史，但對微生物的系統(tǒng)研究是20世紀初，最早是一批西方留學歸來的科學家開始系統(tǒng)介紹微生物學知識，從此開始微生物學研究。病原生物學(1)1910-1921年間，伍連德用近代微生物學知識對鼠疫、霍亂的防治研究，同時建立了中國衛(wèi)生防疫機構，培養(yǎng)了一支預防鼠疫的專業(yè)隊伍，居國際領先地位。20世紀30年代進入醫(yī)學微生物學實驗性研究，如湯飛凡等在醫(yī)學細菌學、病毒學、免疫學方面做出了高水平成績，如沙眼病原體分離和確證具有國際領先。病原生物學(1)一些高校開始設立釀造科目，如魏巖壽等在應用微生物、工業(yè)微生物方面做出了開拓性工作，戴芳瀾等創(chuàng)立了我國真菌學和植物病理學。陳華癸和張憲武對根瘤固氮菌作用研究開始了農業(yè)微生物學。高尚蔭創(chuàng)建了我國病毒學基礎理論研究和第一個微生物學專業(yè)。病原生物學(1)總體看，新中國成立之前，微生物學研究力量較弱，且分散，未形成研究體系。新中國成立后，有了長足發(fā)展，培養(yǎng)了一大批微生物學人才。近年來，我國微生物學的專業(yè)工作者瞄準世界微生物學科發(fā)展前沿，進行微生物基因組學研究。病原生物學(1)醫(yī)學微生物學的發(fā)展前景

為了促進醫(yī)學微生物學的發(fā)展，有效控制和消滅傳染病，應繼續(xù)加強以下幾方面的研究：要高度重視、新現、再現病原微生物的研究。病原微生物的致病機制及機體抗感染機制的研究。建立標準化的微生物學診斷方法及技術。高效抗感染藥物的研制與開發(fā)。特殊環(huán)境中的微生物研究加強和完善突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的應急處理。病原生物學(1)生物安全Biosafety一、概念：生物安全是生物技術安全（Safetyofbiotechnolgy）的簡稱。狹義講：生物安全是指現代生物技術的研究、開發(fā)應用以及轉基因在生物可能對生物多樣性、生態(tài)環(huán)境和人類健康產生的潛在危險（害），特別是轉基因活生物體釋放到環(huán)境中對生物多樣性構成的威脅。病原生物學(1)廣義講：生物安全是指與生物有關的各種因素對社會經濟、人類健康及生態(tài)環(huán)境所產生的危害或潛在風險。生物安全是一個系統(tǒng)的概念，從實驗室研究到產業(yè)化生產，從技術研發(fā)到經濟活動，從個人安全到國家安全。都涉及生物安全問題。二、起因：根據ISO15190:2003(E)《醫(yī)學實驗室-安全要求》和WHO《實驗室生物安全手冊》第二版（2003年修訂版），由中國疾病預防控制中心、中國軍事醫(yī)學科學院等起草（車鳳翔），經國務院69次常務會議通過，形成國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》。病原生物學(1)凡屬在實驗室從事與病原微生物菌（毒）種、樣本有關的研究、教學、檢測、診斷等活動的相關人員，都應履行實驗室生物安全管理條例。三、病原微生物的分類及管理國務院根據病原微生物的傳染性、感染后對個體或群體的危害程度，將病原微生物分類四類：

第一類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物非常嚴重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現或者已經宣布消滅的微生物。病原生物學(1)

第二類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物嚴重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。

第三類病原微生物，是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物。

第四類病原微生物，是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。病原生物學(1)第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。按中華人民共和國傳染病防治法將傳染病分為甲、乙、丙三類。

甲類傳染病是指：鼠疫、霍亂。

乙類傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細菌性和阿米巴性痢疾、肺結核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風、猩紅熱、布魯病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲病、瘧疾。病原生物學(1)

丙類傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風疹、急性出血性結膜炎、麻風病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲病、絲蟲病，除霍亂、細菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病。

病原生物學(1)采集病原微生物樣本應當具備下列條件：（一）具有與采集病原微生物樣本所需要的生物安全防護水平相適應的設備；（二）具有掌握相關專業(yè)知識和操作技能的工作人員；（三）具有有效的防止病原微生物擴散和感染的措施；（四）具有保證病原微生物樣本質量的技術方法和手段。病原生物學(1)實驗室的設立與管理實驗室對病原微生物的生物安全防護水平，并依照安全國家標準的規(guī)定，將實驗室分為一級、二級、三級、四級。新建、改建、擴建三級、四級實驗室或者生產、進口移動式三級、四級實驗室應當遵守下列規(guī)定：病原生物學(1)（一）符合國家生物安全實驗室體系規(guī)劃并依法履行有關審批手續(xù)；（二）經國務院科技主管部門審查同意；（三）符合國家生物安全實驗室建筑技術規(guī)范；（四）依照《中華人民共和國環(huán)境影響評價法》的規(guī)定進行環(huán)境影響評價并經環(huán)境保護主管部門審查批準；（五）生物安全防護級別與其擬從事的實驗活動相適應。病原生物學(1)三級、四級實驗室應當通過實驗室國家認可。國務院認證認可監(jiān)督管理部門確定的認可機構應當依照實驗室生物安全國家標準以及本條例的有關規(guī)定，對三級、四級實驗室進行認可；實驗室通過認可的，頒發(fā)相應級別的生物安全實驗室證書。證書有效期為5年。一級、二級實驗室不得從事高致病性病原微生物實驗活動。三級、四級實驗室從事高致病性病原微生物實驗活動，應當具備下列條件：病原生物學(1)（一）實驗目的和擬從事的實驗活動符合國務院衛(wèi)生主管部門或者獸醫(yī)主管部門的規(guī)定；（二）通過實驗室國家認可；（三）具有與擬從事的實驗活動相適應的工作人員；（四）工程質量經建筑主管部門依法檢測驗收合格。病原生物學(1)BSL-2實驗室設施和設備基本要求一、設施要求（一）無須特殊選址、普通建筑物即可，但應有防止節(jié)肢動物和嚙齒動物進入的設計。（二）在實驗室工作區(qū)域外應有存放個人衣物的條件，還應當有供存儲長期使用物品的空間。（三）在實驗室門口處應設掛衣裝置。（四）實驗室門應帶鎖并可自動關閉。實驗室的門（隔墻）有可視窗。病原生物學(1)（五）實驗室的墻壁、天花板和地面應平整、易清潔、不滲水以及耐化學品和消毒劑的腐蝕。地面應防滑，不得鋪設地毯。盡可能避免管線暴露在外。（六）實驗臺面應防水，耐腐蝕、耐熱。（七）實驗室應有足夠的存儲空間擺放物品以方便使用。實驗室中的設備應當擺設穩(wěn)定。實驗臺與其他設備之間應保持一定距離，以便于清潔。（八）每個實驗室應設洗手池，宜設置在靠近出口處。病原生物學(1)（九）實驗室應保持通風，如使用窗戶自然通風，應有防蟲紗窗。（十）實驗室內應保證工作照明，避免不必要的反光和強光。（十一）實驗室內應有可靠的電力供應和應急照明。必要時，重要設備如培養(yǎng)箱、生物安全柜、冰箱等設備用電源。（十二）實驗室出口應有在黑暗中可明確辨認的標識。有適當的火警報警器。病原生物學(1)二、設備要求：（一）應在實驗室內配備生物安全柜。（二）在實驗室所在的建筑物內應配備高壓蒸汽滅菌器，并按期檢查和驗證，以保證符合要求。（三）應設洗眼設施，必要時應有噴淋裝置。病原生物學(1)實驗室感染的控制一、實驗室的設立單位應當指定專門的機構或人員承擔實驗室感染的控制工作。▲定期檢查實驗室的生物安全防護▲病原微生物菌（毒）種和樣本保存與使用▲安全操作▲實驗室廢水、廢氣排放病原生物學(1)二、對病原微生物有關的傳染病防治知識進行宣傳教育，并定期檢查和了解實驗室工作人員的健康狀況。三、實驗室工作人員出現與本實驗室從事的高致病性病原微生物相關實驗活動有關的感染臨床癥狀或體征時，應當及時報告，并及時就診救治。病原生物學(1)四、實驗室如發(fā)生病原微生物泄漏時，應立即采取控制措施，防止病原微生物擴散。■封閉被病原微生物污染的實驗場所■開展流行病學調查■對病人進行隔離治療，對相關人員進行醫(yī)學檢查■對密切接觸者進行醫(yī)學觀察■對現場進行消毒處理■對染疫動物采取隔離、撲殺病原生物學(1)法律責任一、未依照本條例規(guī)定取得從事高致病性病原微生物實驗室活動資格證書，或取得資格證書但未經批準從事高致病性病原微生物實驗活動的。二、設立單位未建立健全安全保衛(wèi)制度，未采取安全保衛(wèi)措施的。三、未經批準運送高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本。病原生物學(1)四、實驗室在相關實驗活動結束后，未依照規(guī)定及時將病原微生物菌（毒）種和樣本就地銷毀或送交相關部門的。五、實驗室使用新技術、新方法從事高致病性病原微生物相關實驗活動未經國家生物安全專家委員會論證的。六、未經批準擅自從事在我國尚未發(fā)現或已經宣布消滅的病原微生物相關實驗活動的。七、在同一實驗室的同一區(qū)域內同時從事兩種或以上的高致病性病原微生物相關實驗活動的。病原生物學(1)緒論第一節(jié)微生物和病原微生物的概念一.微生物（microorganism）（一）定義：微生物(Microorganism)是存在于自然界中的一大群,結構簡單、體形微小、肉眼看不見，必須借助光學顯微鏡或電子顯微鏡放大數百倍、數千倍，甚至數萬倍才能觀察到的微小生物。病原生物學(1)（二）種類種類繁多，10萬種以上，按其大小、結構、組成，從生物學角度分為三大類，即非細胞型微生物：病毒原核細胞型微生物：細菌、放線菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體真核細胞型微生物：真菌歸納：一毒三菌四體

病原生物學(1)（三）分布自然界的分布：（無處不有、無孔不入、無時不在）正常人體的分布。病原微生物：具有致病性的能引起人和動物、植物病害的少數微生物。病原生物學(1)第一章細菌的基本性狀

第一節(jié)細菌大小與形態(tài)一、細菌的大小與測量單位測量細菌的單位—微米（m）二、細菌形態(tài)

(一)球菌(二)桿菌(三)螺形菌第一篇醫(yī)學微生物學基礎病原生物學(1)細菌的基本形態(tài)病原生物學(1)細菌的結構分為基本結構和特殊結構

一、細菌的基本結構細胞壁、細胞膜、細胞漿、核質。細菌的基本結構模式圖第二節(jié)細菌的結構病原生物學(1)1.革蘭陽性菌的細胞壁(1)組成成分：主要成分——肽聚糖（胞壁質、粘肽）次要成分——磷壁酸肽聚糖（聚糖骨架、四肽側鏈、五肽交聯(lián)橋）(2)結構形式：肽聚糖為三維立體結構，具有機械強度十分堅韌，另有磷壁酸附著表面。病原生物學(1)革蘭陽性菌肽聚糖的結構病原生物學(1)(2)革蘭陽性菌細胞壁特殊成分——磷壁酸分類：壁磷壁酸、膜磷壁酸作用：1.革蘭陽性菌的表面抗原2.參與調節(jié)細胞內外離子進出3.與染色有關4.與致病有關病原生物學(1)病原生物學(1)2.革蘭陰性菌的細胞壁：(1)組成成分：肽聚糖（少量）外膜（主要部分）(2)結構形式肽聚糖為二維平面結構、單層平面、疏松、外有外膜加固，病原生物學(1)革蘭陰性菌肽聚糖結構病原生物學(1)革蘭陰性菌細胞壁特殊成分——外膜組成：脂蛋白、脂質雙層、脂多糖（酯質A、核心多糖、特異多糖）病原生物學(1)

革蘭陽性菌與陰性菌細胞壁結構比較革蘭陽性菌革蘭陰性菌構型三維立體、堅韌平面網絡、疏松肽聚糖厚、多層，50層薄、層少，1-2層糖脂含量糖多脂少糖少脂多特殊成分磷壁酸外膜意義：導致兩類細菌在染色性、致病性及對藥物的敏感性等方面不同。例如：青霉素，溶菌酶病原生物學(1)3.細胞壁的功能

①維持細菌固有形態(tài)②保護細菌抵抗低滲環(huán)境③參與營養(yǎng)物質交換④決定細菌抗原性⑤與致病性有關病原生物學(1)4.細菌細胞壁缺陷型(細菌L型，bacterialLform)

概念：是細菌細胞壁的肽聚糖結構受到理化因素或生物因素的直接破壞或合成被抑制而導致細胞壁缺陷。特點：具有生命力，致病性和抗原性。有形態(tài)及染色性變化。具有高滲透壓生長特性。具有對原菌敏感抗生素的耐受性。病原生物學(1)2.細胞膜中介體（擬線粒體）

概念：是細菌細胞膜內陷，折疊所形成的囊狀或管狀結構。種類：側中介體和橫隔中介體。

功能：由于呼吸酶含量增多，參與細菌細胞呼吸，與細胞代謝相關。橫隔中介體還與細胞分裂有關。病原生物學(1)3.細胞質(1)核糖體：細菌合成蛋白質的場所(2)質粒（plasmid）概念：是存在于菌細胞內、獨立于染色體外的一種遺傳物質，為雙鏈環(huán)狀DNA，不受染色體控制，可自我復制，也可隨意丟失。種類：有F質粒、R質粒和VI質粒。(3)胞質顆粒：異染顆粒4.核質病原生物學(1)二、細菌的特殊結構1.莢膜（capsule）概念：是某些z細菌細胞壁外包繞的一層粘液性物質。

種類：真莢膜(>0.2μm)、微莢膜(<0.2μm)成分：多糖或多肽形成條件：營養(yǎng)豐富、動物體內

功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質的損傷作用具有抗原性病原生物學(1)2.鞭毛（flagellum）概念：是附著于某些細菌表面細長、柔軟，呈波浪狀彎曲的絲狀物。種類：根據數目、位置分四種

成分：蛋白質（彈性纖維蛋白）

功能：運動器官（數目與運動力無關）與致病性有關具有抗原性

檢查：電鏡觀察、特殊染色、暗視野觀察半固體穿刺、平板接種病原生物學(1)革蘭陰性細菌鞭毛的構造細菌鞭毛的類型病原生物學(1)3.菌毛（pilus）概念：是附著于某些細菌表面，比鞭毛的數目眾多，纖細、短而直的絲狀物。種類：普通菌毛、性菌毛功能：與細菌的致病性有關性菌毛為中空管狀，能通過接合傳遞質粒，故與細菌的變異有關

特點：由于纖細普通光鏡不能觀察，需電鏡觀察。病原生物學(1)4.芽胞（spore）概念：是某些細菌在一定條件下，胞漿脫水濃縮在菌體內形成的圓形或橢圓形小體。

種類：根據形態(tài)、大小、位置分若干種。意義：有鑒別細菌的作用芽胞對環(huán)境的抵抗力強，可作為臨床上消毒滅菌的指標形成：一個細菌一個芽胞

不利條件有利條件一個繁殖體病原生物學(1)細菌芽胞形態(tài)示意圖細菌芽胞結構示意圖病原生物學(1)

組成：元素、化合物、無機鹽、水

物理性狀：光學性質、表面積、帶電現象、半透性、滲透壓第三節(jié)細菌的化學組成與物理性狀病原生物學(1)第四節(jié)細菌的營養(yǎng)與生長繁殖條件1.營養(yǎng)物質2.pH3.溫度根據細菌對溫度的適應范圍不同可分為：嗜冷菌：生長范圍(5℃~30℃)最適溫度(10℃~20℃)嗜溫菌：生長范圍(10℃~45℃)最適溫度(20℃~40℃)嗜熱菌：生長范圍(25℃~95℃)最適溫度(50℃~60℃)病原生物學(1)

4.氣體：O2、CO2、混合氣體

根據細菌對氧的要求不同將細菌分為四類：（1）專性需氧菌：結核桿菌（2）微需氧菌：幽門螺桿菌（3）兼性厭氧菌：大多數病原菌（4）專性厭氧菌：破傷風桿菌病原生物學(1)專性厭氧菌在有氧環(huán)境中不能生長的機制：缺乏氧化還原電勢高的呼吸酶—細胞色素和細胞色素氧化酶缺乏分解有毒氧基團的酶—超氧化物歧化酶、觸酶和過氧化物酶

細菌的生長繁殖1.細菌個體的生長繁殖2.細菌群體的生長繁殖

病原生物學(1)生長曲線:（1）遲緩期：（2）對數期：研究細菌的生物學性狀在此期（3）穩(wěn)定期：細菌代謝產物多在此期產生（4）衰亡期：病原生物學(1)細菌的生長曲線圖病原生物學(1)

細菌代謝及代謝產物

1.分解代謝產物(1)糖發(fā)酵試驗（單糖發(fā)酵試驗）病原生物學(1)(2)甲基紅試驗丙酮酸分解產生其他酸類使培養(yǎng)基PH低于4.5加入甲基紅指示劑數滴顯紅色為甲基紅試驗陽性顯桔黃色為甲基紅試驗陰性大腸桿菌病原生物學(1)(3)VP試驗葡萄糖些細菌某分解丙酮酸乙酰甲基甲醇鹼性環(huán)境中氧化二乙酰培養(yǎng)基中精氨酸所含胍基生成紅色化合物（VP試驗陽性）脫羧縮合病原生物學(1)(4)吲哚試驗

培養(yǎng)基內蛋白質中的色氨酸某些細菌具有色氨酸酶分解吲哚（靛基質）無色氣體加入吲哚試劑形成玫瑰紅色吲哚病原生物學(1)(5)硫化氫試驗培養(yǎng)基中的含硫氨基酸某些細菌能分解產生硫化氫（H2S）無色氣體，遇鉛或亞鐵離子形成黑色的硫化鉛或硫化鐵病原生物學(1)(6)枸椽酸鹽還原試驗細菌能利用的碳源只有枸櫞酸鹽，當某種細菌利用枸櫞酸鹽時，可將其分解為碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。指示劑溴麝香草酚蘭由淡綠色變成深藍色。合成性代謝產物

1.熱原質2.毒素和侵襲性酶

3.色素4.抗生素

5.細菌素6.維生素病原生物學(1)細菌人工培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)基、細菌在培養(yǎng)基中的生長情況及用途。意義：1.研究細菌2.傳染病診斷3.研制生物制品4.基因工程第六節(jié)細菌的人工培養(yǎng)及形態(tài)檢查病原生物學(1)病原微生物感染的實驗診斷一、標本采集的基本原則1、根據感染特征：采集相應標本，無定位體征常取血樣本2、盡早采集：▲疾病早期▲使用抗菌藥物之前▲未出現繼發(fā)感染及合并癥之前▲機體免疫因素未形成之前病原生物學(1)3、無菌采集：避免人為污染，確保結果可靠性。4、正確運送及保存：標本采集后運送到實驗室最好在2h之內，用于培養(yǎng)的標本不應超過24h。5、標本量必須滿足檢驗需要：如血液成人5~10ml，嬰幼兒1~3ml?！裱囵B(yǎng)時，培養(yǎng)基與血液標本量比例應大于10:1●呼吸道：上呼吸道取咽拭子，鼻咽試子，下呼吸道取痰液（晨疾最佳）●尿液標本：中段尿、腎盂尿、膀胱穿刺病原生物學(1)●糞便：膿血粘液區(qū)2~3g，液體便1~2ml●腦脊液：腰椎穿刺采集3~5ml●生殖道：分泌物、宮頸粘液●膿液、胸腹水：穿刺法病原生物學(1)二、病原微生物的形態(tài)學檢查1、顯微鏡■普通光學顯微鏡：光源、單雙目■暗視野顯微鏡：通過遮光板形成暗場背景■熒光顯微鏡：產生365~435nm之間波長■相差顯微鏡：通過相差板的光柵作用，使光相差異轉換成光的強度差異。■倒置顯微鏡：光線從物體背面穿透■電子顯微鏡：利用電子流代替可見光，波長一般為0.005nm■病原生物學(1)2、不染色標本檢查：用于觀察病原微生物活體的運動狀態(tài)，常用懸滴法、壓滴法、毛細管法3、染色標本檢查：★染色原理：目前使用的染料一般為人工合成染料，為一種含有色基和助色基的苯環(huán)有機化合物，前者賦予化合物顏色，后者賦予化合物結合能力?！锶玖闲再|：目前醫(yī)學檢驗中常用染料有三種：酸性染料：顯色離子帶負電荷，如剛果紅堿性染料：顯色離子帶正電荷，如結晶紫復合染料（中性染料）：如伊紅美蘭★染色方法：分單染色法和復染色法，前者有正染和負染色法，后者有革蘭染色、抗酸染色、熒光染色★另外有特殊染色法：如英膜染色、芽胞染色、鞭毛染色病原生物學(1)三、病原微生物的分離培養(yǎng)1、培養(yǎng)基（概念、種類）2、接種方法液體：研磨接種法涂布接種法半固體：穿刺接種法傾注接種法固體斜面：蜿延劃線接種法固體平板：連續(xù)分區(qū)劃線接種法病原生物學(1)3、培養(yǎng)方法普通培養(yǎng)：37℃、18~24h二氧化碳培養(yǎng)：5~10%CO2環(huán)境（燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱）厭氧培養(yǎng)基：物理、化學、生物法四、病原微生物的代謝產物檢測與鑒定1、糖發(fā)酵試驗2、氧化-發(fā)酵試驗（O-F試驗）病原生物學(1)常用鑒定方法有：

1.雙歧索引對于較特征性的細菌來說，雙歧索引較為方便實用，對少數相互區(qū)別較困難的細菌，鑒定項目較多顯得繁瑣。2.表解法：將各種菌及其多種特性列成炬陣表格，顯而易見，便于分析。3.數碼鑒定法將生化反應模式 數學模式某細菌的生化反應結果 數字再將獲得的數字細菌名稱轉化成查閱檢索手冊轉化成病原生物學(1)病原生物學(1)病原微生物的分子生物學檢測一、核酸雜交：1、核酸雜交技術檢測病原微生物核酸是臨床診斷學的重大發(fā)現，是基因組相似性研究中更加直接的方法。其原理是利用雙鏈DNA加熱后產生的單鏈DNA混合物，在溫度降低并保持恒溫25℃（低于溶點溫度）時，互補序列會發(fā)生重新配對，形成穩(wěn)定的雙鏈DNA。病原生物學(1)將分離于不同微生物的DNA單鏈混合，并保持在一定的恒溫條件下，DNA的互補序列發(fā)生配對，形成雜交DNA雙鏈，該過程稱交雜（Hybridization）常用帶有酶、化學熒光物或放射性同位素標記的已知序列核苷酸單鏈作為探針，在一定恒溫條件下，按堿基互補配對原則，探針與待測標本中的核酸雜交，通過雜交信號的檢測，從而鑒定標本中有無相應的病原微生物基因及其分子大小。病原生物學(1)將未標記的來源于某種微生物DNA單鏈固定于硝酸纖維膜或民龍膜上，在適宜溫度下與用32P、3H或14C放射性標記的已知微生物DNA單鏈片段進行雜交，如果雜交同源性在70%以上，熔點溫度（Tm）相差小于5%，則可以認為是同一微生物的不同菌珠。病原生物學(1)一、細菌DNA由四個堿基組成：鳥嘌呤（G）腺嘌呤（A）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）嚴格的堿基配對：A＝TG＝C常以G＋C堿基對的摩爾百分比來測定細菌DNA四個堿基對的含量來鑒定細菌。病原生物學(1)二、細菌DNA提取過程(一)細菌的培養(yǎng)及細菌收集細菌培養(yǎng)：液體培養(yǎng)，固體培養(yǎng)細菌收集：一般要求收集2-3克濕菌體(二)細菌破壁1.超聲波破壁法2.氧化鋁磨碎法3.反復凍融法4.化學試劑破壁法，十二烷基磺酸鈉“SDS”5.溶菌酶溶解法6.其他方法：細菌研磨法、玻璃珠研磨法。病原生物學(1)三、細菌DNA的提取方法(一)Marmur氯仿提取法濕菌體2~3克離心洗滌一次懸浮于30~35ml250g/L的SDS于60℃加熱10分鐘，使之破裂加入5mol/LNaCIO4(終濃度為1mol/L)置入帶塞的玻璃溶器中，加入等體積的氯仿一異戊醇(24:1v/v)5000~1000r/min離心5min分層0.1mol/LNaCl50ml溶液0.1mol/LEDTApH8.0溶液冷卻到室溫后振蕩20min上層水相含核酸中層蛋白質下層氯仿一異戊醇病原生物學(1)吸出上層含核酸的水相加入二倍體積的乙醇用攪拌棒攪拌用棒卷出絲狀DNA，靠壁擠干再充分溶于10~15ml0.1SSC(0.15mol/LNaCl~0.15mol/L檸檬酸三鈉)Ph7.0±0.2簡稱ISSC稀釋10倍為0.1SSC待全部溶解，再用10SSC(1SSC濃縮10倍)調整到約1SSC的濃度再與等體積的氯仿一異戊醇一起振蕩15min重復一次進行清除蛋白，直到看不見變性蛋白為止病原生物學(1)注意：1.被溶解的細菌濃度不能太低。2.SDS為陰離子去污劑，各廠家、批號、等級差異較大。3.離心分層后，取水相液體要準確。病原生物學(1)(二)細菌DNA中G+C摩爾百分比測定1.化學方法用電泳和層析等技術2.物理方法用熱變性溫度(目前常用方法)G+C摩爾百分比測定，是細菌分類鑒定的一種重要方法。缺點：不能表達出DNA堿基的排列順序。病原生物學(1)核酸雜交技術核酸雜交技術（techniqueofnucleicacidhybridization）是由現代分子生物學的重要方法之一。是用特定標記的已知核酸序列與待測核酸進行特異性的雜交結合，形成雜交體，并利用相應的顯示技術來檢測目標核酸的存在及其位置的分子生物學方法。病原生物學(1)一、核酸探針(DNA探針)就是指帶有標記物的，能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸序列片段。(一)核酸探針的種類根據標記方法放射性探針非放射性探針根據核酸性質DNA探針CDNA探針RNA探針寡核苷酸探針病原生物學(1)1.NDA探針DNA探針是目前最常用的核酸探針，因具有三大優(yōu)點：這類探針克隆在質粒載體上，可無限繁殖，取之不盡；DNA探針與RNA探針相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性；DNA探針標記方法較成熟，制備方法簡便。DNA探針一般長度在幾百堿基對，可以是雙鏈DNA，也可是單鏈DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。病原生物學(1)2.CDNA探針CDNA是指互補于mRNA的DNA分子(complementaryDNA)，CDNA是由RNA經反轉錄產生的，這種DNA探針不含有內含子序列，尤其適用基因表達檢測。3.RNA探針是一類很有前途的核酸探針，常用細胞mRNA和病毒RNA，具有高雜交效率。但易降解，標記復雜之缺點。病原生物學(1)4.寡核苷酸探針根據某一特殊核酸序列，選擇其中最穩(wěn)定區(qū)域，經人工合成，為18~30個堿基，能識別一個堿基。具有以下特點：由于鏈短，序列復雜底低，分子量小，交雜耗時短；一次性可合成大量寡核苷酸探針；短探針，堿基錯配能降低雜交體的Tm值。病原生物學(1)二、標記物32P半衰期14.3d35S半衰期87.1d14C半衰期125I半衰期60d3H半衰期12.3年病原生物學(1)三、基因重組載體載體的功能是將一個外源基因導入受體細胞具體的條件1.其本身是復制子，能自我復制。2.分子量小，帶有選擇標記。3.對幾種限制性內切酶有單一切點。4.并有一定非必要區(qū)，允許外源基因插入。病原生物學(1)Southern印跡雜交兩個主要過程：一是將待測核酸分子通過一定方法轉移并結合到一定的固相支持物上(即印跡，blotting)。二是固定于膜上的核酸同標記的探針在一定溫度和離子強度下退火(復性)即分子雜交過程。病原生物學(1)一、待測核酸樣品的制備病毒感染的細胞組織或分泌物提取DNA酚/氯仿抽取法用限制性內切酶消化基因組DNA0.1~1μg待切DNA適當限制性內切酶緩沖液20~50ul用滅菌Eppendorf管置合適溫度下保溫一個小時，加入EDTA65℃加熱滅活限制性內切酶樣品DNA病原生物學(1)二、瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNADNA樣品0.3~3%瓊脂糖凝膠在一定電場下進行電泳1~3h得到很多DNA條帶將電泳凝膠浸泡在0.25mol/L的HCl溶液短暫的脫嘌呤處理移到堿性溶液(0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl)在用中性pH的緩沖液(0.5mol/LTris-HClpH7.51.5mol/LNaCl)使DNA變性并斷裂形成較短的單鏈DNA片段中和凝膠中的緩沖液在20×SSC中平衡凝膠10min保持單鏈狀態(tài)DNA片段，易于同探針雜交病原生物學(1)三、轉膜將凝膠中的單鏈DNA片段轉移到固相支持物上(硝酸纖維膜)(必須保持凝膠電泳時區(qū)帶位置不變)病原生物學(1)四、雜交(一)預雜交DNA片段與探針進行雜交前必須先進行預雜交，因能結合DNA片段的膜，同樣能結合探針DNA，所以須將膜上所有能與DNA結合的位點全部封閉。(二)正式雜交病原生物學(1)五、放射性自顯影用放射性同位素標記dNTP（2’-單脫氧核苷酸），測定核酸序列是應用最早。放射性試劑a-32p有強放射性和散射性，少用a-35S標記dATP，高自顯影條帶分辨率病原生物學(1)Northern印跡雜交

(Northernblotting)一、原理：是將RNA樣品通過瓊脂凝膠電泳進行分離，再轉移到固相支持物上，用帶標記物的探針對固相膜上的RNA進行雜交，常用于RNA病毒核酸的檢測。病原生物學(1)二、步驟1.RNA樣品提取氯化鋰—尿素法熱酚法PolgA+的寡聚dT纖維素親和法2.電泳分離：甲醛瓊脂糖凝膠電泳3.轉移和紫外線交聯(lián):將RNA轉移到尼龍膜后，用波長254nm，600μw/cm2，紫外線燈下，曝光5min，取出尼龍膜置80℃，烘烤60min后尼龍膜即可雜交。4.雜交與結果檢測病原生物學(1)原位雜交是用特定標記的已知順序核酸為探針，與細胞或組織中的核酸進行雜交，此雜交能保持細胞的完整性，但能對細胞或組織中的核酸進行定性、定位測定。病原生物學(1)臨床標本組織切片經甲醛溶液固定經石蠟包埋將標本片和組織片上加入探針如果是細菌菌落稱菌落原位雜交如果是細胞稱組織原位雜交病原生物學(1)斑點雜交硝酸纖維素膜具有吸附單鏈DNA或RNA的特性，可將樣品直接點在樣品膜上，經變性，固定后進行雜交，稱斑點雜交(dotblothybridization)。病原生物學(1)免疫印跡法(immunoblot)免疫印跡法，也稱免疫轉印技術。1975年southern首先用于分析核酸，故稱核酸印跡，southernblot。1977年Alwine將此法用RNA研究，取名Northernblot1979年Towbin，又擴展到蛋白分析，又稱蛋白印跡。其后，Burnetle則名之為Westernblot，以后Gershou改稱為immunoblot。1982年Reinhart將此方法中轉移電泳一步省去，而采用直接吸印法，因而把該法改良后，又稱Easternblot病原生物學(1)基本原理：是將凝膠電泳與固相免疫測定兩種方法結合起來的一種技術。方法步驟：

1.將抗原物質(蛋白質、多糖)通過聚苯烯酰胺凝膠電泳分離。2.將電泳分離的組分轉移到固相基質上(硝酸纖維素濾紙)。3.轉移后的組分進行免疫法測定。病原生物學(1)應用范圍：1.病原體抗原的鑒定與分析，篩選尋找特異性抗原。2.抗體的鑒定與分析，分析患者對不同抗原組分的抗體應答狀態(tài)，目前用于艾滋病的診斷。3.免疫復合物的分析。病原生物學(1)一、基本原理：是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術，但反應體系較為簡單。包括變性-復性-延伸三步循環(huán)反應。(1)變性：通過加熱(95℃)使雙鏈DNA解開成單鏈DNA。(2)退火(引物粘合)：當溫度突然降低時(55℃)，濃度很高的引物與其互補的模板在局部形成雜交鏈，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3’-OH末端。聚合酶鏈反應PCR病原生物學(1)（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4種dNTP及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化引物在3’端不斷延伸，在模板DNA鏈上形成新鏈，從而使模板DNA擴增1倍。（4）在DNA聚酶作用下，引物擴增延伸，每經過變性、復性、延伸一個循環(huán)，模板DNA增加一倍，而新合成的DNA又作為下一循環(huán)的模板，經過25-30個循環(huán)后原DNA量增加至106-109倍（拷貝）病原生物學(1)病原生物學(1)病原生物學(1)病原生物學(1)引物的要求：▲長度在15-30bP▲G+C含量應在45-55%之間▲堿基分布均勻，避免連續(xù)出現4個以上▲

自身無互補序列▲兩個引物之間同源堿基小于4個病原生物學(1)以上三步構成一個循環(huán)，每一循環(huán)的產物可作為下一次循環(huán)反應的模板，大約經25-30次循環(huán)反應，可使特異性DNA片段擴增100萬倍(2小時)。（1）兩種引物：為保證DNA聚合酶能夠對兩條互補鏈均能進行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補DNA鏈的3’-端。引物決定了PCR擴增產物的大小及其特異性，引物設計及合成的優(yōu)劣直接涉及有效擴增能否成功，引物設計應考慮下述原則:病原生物學(1)

①引物長度：15—30個堿基為宜，引物過短會使特異性降低，引物越長，擴增的特異性越好，但敏感性相應下降。

②G+C含量：在40%-60%為宜，引物Tm值可用公式計算：Tm=4（G+C）+2（A+T）

③堿基分布的隨機性。應盡量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3’端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。病原生物學(1)

④引物自身：不應該存在互補序列，連續(xù)互補堿基不能多于3bp，否則引物自身會折疊形成發(fā)夾狀二級結構。

⑤兩個引物之間不應該有多于4個的互補或同源堿基，尤其應避免3’端的互補重疊，以防形成二聚體。

⑥引物的3’端：引物的3’端是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對，不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。引物的3’端最佳堿基選擇是G和C，因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。

病原生物學(1)⑦引物的5’端：引物的5’端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大，因此可以被修飾。引物的5’端的修飾包括加酶切位點，標記生物素、熒光素、地高辛等，引入蛋白質結合DNA序列，引入突變位點等。⑧引物的特異性：引物與非特異性擴增序列的同源性不要超過90%或有8個互補堿基同源。病原生物學(1)(2)耐熱Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：這是在耐熱細菌體內提取的一種DNA聚合酶，可保證在95℃，30分鐘以上不會變性失活。0.5-5U/100μL。(3)四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPs。20-200μM。(4)緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時所需的適當的溶液pH值。10-50mmol/LTris-HCl(室溫pH8.3-8.8,72℃pH7.2)。(5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs濃度高0.5-2.5mmol/L。病原生物學(1)三.反應條件(1)溫度和時間變性:95℃,30S；退火：45℃-55℃，30S-1min；延伸：72℃，<1kb延伸1min,3-4kb需3-4min(2)循環(huán)次數循環(huán)次數取決于模板DNA的濃度,理論上循環(huán)225次后,PCR產物的累積即達最大值,但實際操作中,每步反應不可能達100%效率,一般按75%計算25-30次比較合理,循環(huán)次數太少,產物的量不多,循環(huán)次數過多,會導致PCR反應”平臺效應”的出現。

病原生物學(1)擴增產物分析

◆凝膠電泳分析法

◆斑點雜交分析法

◆酶譜分析法根據酶切位置

◆序列分析法病原生物學(1)四、PCR技術的特點1.高度的敏感性PCR產物的生成是以指數方式增加的，它可對單拷貝基因、單個細胞、單根頭發(fā)、一滴血等微量標本進行分析。2.高度的特異性在PCR實驗中，只要引物設計合理，反應溫度適宜（>50~55℃），其擴增的特異性是很高的。其它因素如：酶濃度、dNTP、Mg2+、pH等對PCR的忠實性也有一定的影響。

病原生物學(1)3.操作簡便、迅速已有多種類型的PCR擴增儀，只需把反應材料按一定的比例混合，置于儀器內，反應便會按所輸入的程序進行。4.適用樣品廣PCR可特異擴增任何微量（pg、ng）的目的DNA或RNA片段，樣品既可以是純化的，又可以是粗制的；既可以是新鮮組織，也可以是陳舊樣品；既可以是細胞，又可以是體液；既可以是完整的大分子DNA，也可以是部分降解的DNA。因此，PCR技術對擴增樣品的要求不嚴格。病原生物學(1)五、PCR技術在醫(yī)學中的應用由于PCR技術敏感、特異且操作簡便，加上商品化PCR試劑盒的廣泛應用，使得PCR在臨床疾病的診斷、法醫(yī)學鑒定中具有極為重要的應用價值，并能為大多數實驗室所接受。1.PCR用于感染性疾病病原體的診斷和研究（病毒、細菌、寄生蟲檢測）2．遺傳性疾病及腫瘤的診斷病原生物學(1)第八節(jié)動物試驗動物試驗是臨床細菌學檢驗的重要組成部分。具有以下實用價值：1、分離鑒定病原體2、測定細菌的毒力LD50、ID503、制備免疫血清4、建立致病動物模型，很多疾病的機制，首先采用動物模型進行研究所證實5、