實(shí)驗(yàn)報(bào)告-細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別與計(jì)數(shù)

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞復(fù)蘇及細(xì)胞鑒別與計(jì)數(shù)1引言1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諢o菌操作技術(shù)。掌握細(xì)胞復(fù)蘇技術(shù)。掌握用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法。學(xué)習(xí)死活細(xì)胞鑒別的方法。了解細(xì)胞污染的判定方法。了解細(xì)胞形態(tài)的多樣性。1.2實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞復(fù)蘇：以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程，復(fù)蘇時(shí)要快速融化，必須將凍存在-196°C液氮中的細(xì)胞在1分鐘內(nèi)快速融化至37°C，使細(xì)胞迅速通過最易受損的溫度區(qū)間-5-0°C，使凍存時(shí)細(xì)胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。細(xì)胞計(jì)數(shù)：采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由一塊長約7.5cm，寬3.5cm的厚玻璃制成，平臺中部上下各有一個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室分9大格，每格邊長1mm，面積1mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.1mm3。四角的大格劃分為16個(gè)中方格，一般用作白細(xì)胞、血小板組織培養(yǎng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)。中央的大方格則由雙線劃分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格面積為0.04mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.004mm3，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，用于紅細(xì)胞、微生物細(xì)胞的計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)原則：細(xì)胞壓線則計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右，鏡下計(jì)數(shù)，有時(shí)偶爾有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。對每個(gè)試樣重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其算數(shù)平均值。2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及操作步驟2.1實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、co2培養(yǎng)箱、酒精燈、酒精棉球、酒精噴壺、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸、移液器、槍頭等2.2實(shí)驗(yàn)試劑DMEM培養(yǎng)基、血清、抗生素等2.3實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞復(fù)蘇：實(shí)驗(yàn)室和超凈工作臺消毒，紫外照射20Min左右。穿好實(shí)驗(yàn)服，進(jìn)無菌室前穿鞋套、洗手。關(guān)閉紫外燈，開日光燈和開風(fēng)機(jī)，超凈工作臺臺面應(yīng)整潔，用75%酒精擦雙手消毒，擦拭臺面。自液氮中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即投A40C水浴鍋中解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化。正確擺放超凈臺內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品，點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備一次性滴管和移液管。將凍存管放入離心機(jī)中800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。小心將凍存管移入超凈臺中，用75%的酒精棉球擦拭凍存管外部，打開凍存管用巴氏吸管棄上清，加1mL的DMEM培養(yǎng)基吹打細(xì)胞使之均勻，取90uL細(xì)胞懸液和10uL臺盼藍(lán)染液于小指管中進(jìn)行活細(xì)胞染色計(jì)數(shù)。剩余細(xì)胞懸液吸至一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加4mL的DMEM培養(yǎng)基，將蓋子擰好稍回轉(zhuǎn)，混勻，鏡下看細(xì)胞密度和狀態(tài)?？赐旰蠹?xì)胞培養(yǎng)瓶放進(jìn)5%CO2培養(yǎng)箱中。整理實(shí)驗(yàn)用品，使超凈工作臺整潔干凈。細(xì)胞計(jì)數(shù)：檢查計(jì)數(shù)板：在正式計(jì)數(shù)前，先用顯微鏡檢查計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，看其是否有雜質(zhì)或干枯的菌體。若有污物，則需要按以下步驟清洗：1）擦洗，用藥棉蘸取95%酒精，輕輕擦洗計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室。2）沖洗，用蒸餾水沖洗計(jì)數(shù)板，并用毛邊紙吸干其上的水分，最后用擦鏡紙擦干凈。3）鏡檢，鏡檢清洗后的計(jì)數(shù)板，直至計(jì)數(shù)室無污物時(shí)，才可用于細(xì)胞的計(jì)數(shù)。加樣：先將蓋玻片安放在計(jì)數(shù)室上面，然后搖勻樣品取懸液，從蓋玻片邊緣滴加細(xì)胞懸液，連續(xù)2-3次，直至充滿計(jì)數(shù)板和蓋玻片間的空隙。計(jì)數(shù)：將加好樣品的計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺的中央，然后按下列步驟操作：1）找計(jì)數(shù)室，先在低倍鏡下尋找計(jì)數(shù)板上的大方格位置。尋找時(shí)顯微鏡的光圈要適當(dāng)縮小，使視野偏暗。然后順著大方格線，移動計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。2）轉(zhuǎn)高倍鏡，轉(zhuǎn)至高倍鏡后，適當(dāng)調(diào)節(jié)光度，使細(xì)胞和計(jì)數(shù)室線條均清晰為止。然后將計(jì)數(shù)室一角的中格移至視野中。3）計(jì)數(shù)，計(jì)算計(jì)數(shù)板的四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計(jì)算左側(cè)和上方的，右和下的不計(jì)算在內(nèi)。4）重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取算術(shù)平均值。細(xì)胞數(shù)/mL細(xì)胞原液=4大格細(xì)胞總數(shù)/4X104清洗：計(jì)數(shù)完畢后，計(jì)數(shù)板先用95%酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水沖洗，然后吸干，最后用擦鏡紙擦干凈。3結(jié)果與分析3.1細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表1細(xì)胞在初始培f養(yǎng)時(shí)的顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)數(shù)次數(shù)123平均總細(xì)胞數(shù)量（顯微鏡下）/個(gè)164194182180死細(xì)胞數(shù)量（顯微鏡下）/個(gè)61468.7總細(xì)胞數(shù)量（實(shí)際）單位：個(gè)/ml4.1X1054.85X1054.55X1054.5X105死細(xì)胞數(shù)量（實(shí)際）單位：個(gè)/ml1.5X1043.5X1041.5X1042.2X1043.2細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果

圖1Hela細(xì)胞在復(fù)蘇16h后在顯微鏡下的狀態(tài)（放大倍數(shù)：7*10）圖注：細(xì)胞為人宮頸癌Hela細(xì)胞，在復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)，圖為細(xì)胞在復(fù)蘇16h后的狀態(tài)，該視野下大約有64個(gè)細(xì)胞。結(jié)果分析：如表1所示，細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果是細(xì)胞數(shù)目在4.5X105個(gè)/mL左右，細(xì)胞數(shù)量適中，死細(xì)胞數(shù)目在2.2X104個(gè)/mL左右，在可接受的范圍內(nèi)。如圖2所示，細(xì)胞在復(fù)蘇后16h后，大部分細(xì)胞貼壁生長，生長情況較好，少部分細(xì)胞死亡，懸浮在培養(yǎng)基中。4思考題細(xì)胞傳代的步驟和注意事項(xiàng)？細(xì)胞傳代步驟在實(shí)驗(yàn)一內(nèi)容中，細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng)有：1）把握好傳代時(shí)機(jī)，80%~90%的細(xì)胞融合最佳，過早傳代時(shí)細(xì)胞量少，過晚時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)不佳。2）消化時(shí)間要適度，過短時(shí)細(xì)胞不易脫落，過長時(shí)細(xì)胞易脫落流失并造成細(xì)胞損傷。3）消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失；過低時(shí)細(xì)胞則不易消化。不同細(xì)胞對消化液反應(yīng)不同。4）細(xì)胞傳代后，應(yīng)每日對細(xì)胞