儀器分析十二章分子發(fā)光課件

第十二章分子發(fā)光分析法12.2熒光和磷光分析基本原理12.3熒光和磷光分析儀12.1分子發(fā)光分析概述12.4熒光和磷光分析法的特點(diǎn)和應(yīng)用12.5化學(xué)發(fā)光分析本章學(xué)習(xí)要求12.1分子發(fā)光分析概述物質(zhì)分子吸收能量躍遷到電子激發(fā)態(tài)后，在返回基態(tài)的過程中伴隨有光輻射，這種現(xiàn)象稱為分子發(fā)光，以此建立起來的分析方法稱為分子發(fā)光分析法。一、熒光和磷光的產(chǎn)生分子能級與躍遷基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率

的輻射；是量子化的；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見圖12-1)；速度最快、激

發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；12.2熒光和磷光分析基本原理S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)移l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)移振動弛豫2.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重態(tài)：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1

為禁阻躍遷；必須通過其他途徑進(jìn)入，進(jìn)入的幾率??；根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋比成對自旋穩(wěn)定；而三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低，所以平均壽命長。非輻射能量傳遞過程振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時(shí)間10-12

s。內(nèi)轉(zhuǎn)移：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。外轉(zhuǎn)移：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)移使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間竄躍：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程

熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長為

’2的熒光；10-7～10-9

s。

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)（T1→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動弛豫→T1發(fā)光速度很慢：10-4～10s。

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線

固定待觀測的發(fā)射波長(一般選最大發(fā)射波長),改變激發(fā)光波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與激發(fā)光波長的關(guān)系得激發(fā)光譜曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大；2.熒光發(fā)射光譜(或磷光光譜)

固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),掃描發(fā)射光波長，根據(jù)化合物發(fā)射的熒光(或磷光)強(qiáng)度與發(fā)射光波長關(guān)系得到的曲線(圖中曲線II或III)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。

發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，是振動弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)的各振動能級，產(chǎn)生波長一定的熒光(如

’2)。c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關(guān)系。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜4.熒光效率熒光效率（

）：分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光效率（熒光量子產(chǎn)率）。

≤1。

熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關(guān)。如果外轉(zhuǎn)換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；5.熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上的不同取代基對該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有很大影響。給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)；吸電子基團(tuán)使熒光減弱甚至猝滅。參看P349表12-1。5.熒光定量分析原理(1)熒光定量關(guān)系式

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If＝

Ia由比耳定律：Ia＝I0-It＝I0(1-10-

bc)If＝

I0(1-10-

bc)＝

I0(1-e-2.3bc)濃度很低時(shí)，將括號項(xiàng)近似處理后：（參看P.349）

If＝

2.3

I0bc

＝

Kc熒光定量關(guān)系式（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度。比較法：在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較。（3）影響熒光強(qiáng)度的因素1）溶劑的影響除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。2）溫度的影響熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3）溶液pH的影響

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制。4）各種散射光的影響5）激發(fā)光照射的影響由溶劑產(chǎn)生的散射光（瑞利或拉曼散射）有可能產(chǎn)生較嚴(yán)重的干擾。消除方法：通過選擇合適的激發(fā)波長來消除。有些熒光物質(zhì)會發(fā)生光分解，使熒光強(qiáng)度降低。消除方法：采用低強(qiáng)度激發(fā)光、縮短測定時(shí)間。6）熒光猝滅熒光物質(zhì)與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用，引起熒光強(qiáng)度下降或消失的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。

碰撞猝滅：M＊+

Q(熄滅劑)

→

M

+

Q

+熱（熄滅）

或M＊+

Q(熄滅劑)

→

M

+

Q＊

氧的熄滅作用：溶液中溶解氧分子可加速系間竄躍。

自熄滅和自吸收：熒光物質(zhì)濃度大時(shí)產(chǎn)生。

自熄滅——激發(fā)態(tài)之間碰撞引起能量損失形成。

自吸收——當(dāng)熒光光譜與吸收光譜重疊時(shí)，熒光被溶液中基態(tài)分子吸收。

7）內(nèi)濾光作用溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀等。6.熒光定性分析根據(jù)熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以鑒別化合物。常用比較法：在相同的分析條件下，將待測物的熒光發(fā)射光譜與預(yù)期化合物的熒光光譜比較，若特征峰波長及形態(tài)一致，則可能為該物質(zhì)。也可采用預(yù)期化合物的激發(fā)光譜進(jìn)行比較亦可。若使用兩者結(jié)合，則結(jié)果可信度大大提高。參看P.351圖12-312.3熒光和磷光的分析儀器四部分組成：激發(fā)光源、試樣池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測器通常成直角?；玖鞒倘鐖D：光源：高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))。單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器；檢測器：光電倍增管。同步掃描技術(shù)

同步掃描技術(shù)可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。

合適的可減少光譜重疊；酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時(shí)，只顯示色氨酸的特征光譜，實(shí)現(xiàn)分別測定。磷光檢測熒光計(jì)上配上磷光測量附件即可對磷光進(jìn)行測量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測量磷光。

測量方法：（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。（2）采用脈沖光源和可控檢測及時(shí)間分辨技術(shù)。室溫測量時(shí)，不需要杜瓦瓶。12.4熒光和磷光分析法的特點(diǎn)與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級；

（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。2.熒光分析法的應(yīng)用1)無機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。2)生物與有機(jī)化合物的分析見下表2007-11-8主要用于痕量物質(zhì)分析，也可用于分子結(jié)構(gòu)性能測定。三、磷光分析法的應(yīng)用1.稠環(huán)芳烴分析

采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見下表2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析煙堿、降煙堿、新煙堿，2，4-D等分析檢測限0.01

g/cm-3

3.藥物分析和臨床分析見下表2007-11-812.5化學(xué)發(fā)光分析化學(xué)發(fā)光機(jī)理：一些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)時(shí)，吸收了的化學(xué)能，使產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出光子。能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)的基本要求：化學(xué)反應(yīng)能提供足夠的能量；吸收化學(xué)能后的分子必須能釋放出光子或轉(zhuǎn)移給另一分子放出光子。1.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的光。

A+B=C+D*D*→D+h

（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)

E=170～300kJ/mol；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光。2.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測物濃度成線性：3.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)a.一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

發(fā)射的光譜范圍：600～875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)氧原子與SO2的發(fā)光反應(yīng)：

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

SO2+O+O→SO2*+O2

SO2*→SO2*+h

最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；

O3

→O2+O（1000C石英管中進(jìn)行）

NO+O→NO2*

NO2*→NO2+h

發(fā)射光譜范圍：400～1400nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：

CO+O→CO2*

CO2*→CO2+h

發(fā)射光譜范圍：300～500nm；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：c.乙烯與O3的發(fā)光反應(yīng)

乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：

CH2O*→CH2O+h

最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍1ng/cm-3～1g/cm-3；（2）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；a.一氧化氮

NO+H→HNO*

HNO

*→HNO+h

發(fā)射光譜范圍：660～770nm；