園藝植物栽培課件組織培養(yǎng)技術(shù)

植物細胞培養(yǎng)（plantcellculture）：指對植物器官或愈傷組織上分離出來的單細胞(或小細胞團)進行培養(yǎng)，形成單細無性系或再生植物的技術(shù)。10植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)的意義：（1）研究細胞生理代謝過程及各種影響因子；（2）用于植物品種的改良；（3）用于植物次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。10.1.1單細胞的分離由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織（如愈傷組織）中分離單細胞10.1單細胞培養(yǎng)一、由完整的植物器官分離單細胞

機械法葉組織是分離單細胞的最好材料。酶解法

先撕去葉表皮，使葉肉細胞暴露，然后再用小解剖刀把細胞刮下來。

機械法第一種方法：用刀片刮葉片具體方法:撕去下表皮露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞1．把葉片進行表面消毒，方法是短暫地浸于95％酒精之后，再以經(jīng)過過濾滅菌的7％次氯酸鈣溶液消毒15min，用無菌蒸餾水洗凈。2．把葉片切成小塊（小于1cm2).3．在玻璃勻漿管中用10ml培養(yǎng)基把1.5g葉片材料制成勻漿。4．把勻漿通過2個無菌的金屬過濾器過濾，上層濾器的網(wǎng)孔直徑為61μm，下層為38μm。第二種方法：葉片研碎、離心5．通過低速離心將濾液中細微的碎屑除掉。在離心時游離細胞將會沉降在底層，棄去上清液，把細胞懸浮在一定容積的培養(yǎng)基中，使達到所要求的細胞密度。6．將細胞植板于一薄層瓊脂培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中。研碎成粉加研磨介質(zhì)過濾、離心和酶解法相比，用機械法分離細胞至少有兩個明顯的優(yōu)點：①細胞不至受到酶的傷害作用；②無須質(zhì)壁分離，這點對生理和生化研究來說是很理想的。

但這種機械分離細胞的方法并不普遍適用。Rossini(1972)指出，只有在薄壁組織排列松散，細胞間接觸點很少時，用機械法分離葉肉細胞才能取得成功。（二）酶解法

利用果膠酶、纖維素酶等離析酶溶解細胞間物質(zhì)，從而獲得單細胞。酶解法分離煙草葉肉細胞的程序

2．把葉片用無菌蒸餾水洗凈，用消過毒的細鑷子撕去下表皮。1．由60-80日齡的煙草植株上取充分展開的葉片進行表面消毒，方法是先浸于70％酒精30s，再以含有0.05％表面活化劑的3％次氯酸鈉溶液消毒30min。3．用消過毒的解剖刀片將撕去下表皮的葉片切成4cm見方的小塊。4．取2g切好的葉片置于一個100ml三角瓶中，瓶中裝有20ml經(jīng)過過濾滅菌的酶溶液，內(nèi)含0.5％離析酶,0.8％甘露醇和1％硫酸葡聚糖鉀。5．用真空泵抽氣，使酶滲人葉組織。6．將三角瓶置于一個往復(fù)式搖床上，搖動速度120次／min，沖程4～5cm，溫度25℃，時間2h。7．其間每30min更換酶溶液一次。將第1個30min后換出的酶溶液棄掉；第2個30min后的酶溶液主要含有海綿薄壁細胞；第3和第4個30min后的酶溶液主要應(yīng)當含有柵欄細胞。8．用培養(yǎng)基將細胞洗2次后進行培養(yǎng)。

用酶解法分離細胞的特點是，在某些情況下，有可能得到海綿薄壁細胞或柵欄薄壁細胞的純材料。不過，在有些物種中，特別是在大麥、小麥和玉米中，很難通過酶解法使細胞分離。二由培養(yǎng)組織中分離單細胞

用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的單細胞系統(tǒng)，在傳統(tǒng)上常常是由離體培養(yǎng)的組織分離得到的，因為這個途徑不但方便，而且廣泛適用。

由愈傷組織獲得游離細胞的具體做法是，把未分化的和易散碎的愈傷組織約2g轉(zhuǎn)移到裝有30～50ml液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25C士1℃，弱光或黑暗中，將三角瓶置于搖床上不斷振蕩（120r/min）。

初期每10d左右用新鮮培養(yǎng)液更換掉三角瓶中大約4/5的舊液，同時將飄浮在原培養(yǎng)液上層的細胞碎片和長彎形衰敗細胞淘汰。

幾個周期之后，培養(yǎng)液由濁變清，開始出現(xiàn)胞質(zhì)濃密的單細胞和小細胞團。

此后按下節(jié)所介紹的方法繼續(xù)繼代培養(yǎng)，直至建成良好的懸浮培養(yǎng)物。10.1.2單細胞培養(yǎng) 對分離得到的單個細胞進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分裂增殖，形成細胞團，再通過細胞分化形成芽、根等器官或胚狀體，直到長成完整植株的技術(shù)。 培養(yǎng)方法：平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)法。1、細胞平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)(plateculture)：將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。單細胞的分離：用于平板培養(yǎng)的小細胞團不能超過6個細胞，所以過濾時篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小要合適?；痉椒ǎ簡渭毎麘腋∫旱闹苽洌悍蛛x的單細胞經(jīng)低速離心，培養(yǎng)液洗滌2次后，調(diào)整密度為5×105／ml。植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，厚度約1~2mm。植板密度：單位體積內(nèi)細胞的數(shù)量。封口：用石蠟?zāi)し馀囵B(yǎng)皿。鏡檢：用倒置顯微鏡觀察將單細胞做標記，已獲得真正的單細胞系。培養(yǎng)：25℃黑暗培養(yǎng)。

平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率：能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比例。平板培養(yǎng)中細胞密度和培養(yǎng)基成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，而細胞密度和培養(yǎng)基成分互相依賴（負相關(guān)）。毫米2、看護培養(yǎng)看護培養(yǎng)（nurseculture）：是由Muir1954年設(shè)計的。操作方法：在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長的愈組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤后將細胞接種于濾紙上。當培養(yǎng)細胞長出微小細胞團以后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其迅速生長3、雙層濾紙培養(yǎng)

Horsch等（1980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。4、微室培養(yǎng)法：懸浮單細胞接種于凹玻片或玻璃環(huán)與蓋玻片組成的微室內(nèi)的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)方法。

是指將游離的單細胞或細胞團按照一定的細胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的方法。

這種培養(yǎng)方法能提供同步分裂的、增殖迅速的大量細胞，可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。10.2細胞懸浮培養(yǎng)（cellsuspensionculture）10.2.1懸浮培養(yǎng)的類型分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)

是指將一定量的細胞或細胞團分散在一定容積的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，目的是建立單細胞培養(yǎng)物。（一）分批培養(yǎng)(batchculture)

在培養(yǎng)過程中除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的，當培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物質(zhì)耗盡時，細胞的分裂和生長即行停止。

分批培養(yǎng)的特點一般是100～250ml三角瓶，每瓶中裝有20～75ml培養(yǎng)基。分批培養(yǎng)所用的容器

為了使分批培養(yǎng)的細胞能不斷增殖，必須進行繼代，方法是取出培養(yǎng)瓶中一小部分懸浮液，轉(zhuǎn)移到成分相同的新鮮培養(yǎng)基中（大約稀釋5倍）。在分批培養(yǎng)中，細胞數(shù)目增長的變化情況表現(xiàn)為一條S形曲線細胞生長曲線

滯后期的長短主要取決于在繼代時原種培養(yǎng)細胞所處的生長期和轉(zhuǎn)入細胞數(shù)量的多少。

當轉(zhuǎn)入的細胞數(shù)量較少時，不但滯后期較長，而且在一個培養(yǎng)周期中細胞增殖的數(shù)量也少。

如果轉(zhuǎn)入的細胞密度很低，則在加入培養(yǎng)單細胞或小群體細胞所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之前，細胞將不能生長。

另外，如果縮短兩次繼代的時間間隔，例如，每2～3d即繼代一次，則可使懸浮培養(yǎng)的細胞一直保持對數(shù)生長。據(jù)報道，加入條件培養(yǎng)基（即在其中曾培養(yǎng)過一段時間植物組織的培養(yǎng)基）可以顯著縮短滯后期的長度。

如果使處在靜止期的細胞懸浮液保存時間太長，則會引起細胞的大量死亡和解體。因此十分重要的一點是，當細胞懸浮液達到最大干重產(chǎn)量之后，即在剛進人靜止期的時候，須盡快進行繼代。

即在對數(shù)生長期中細胞數(shù)目加倍所需的時間，因物種的不同而異：煙草，48h；假挪威槭，40h;薔薇，36h；菜豆，24h。

一般講，這些時間都長于在整體植株上分生組織中細胞數(shù)目加倍所需的時間。在分批培養(yǎng)中細胞繁殖一代所需的最短時間：提高細胞的分散程度的方法1.盡可能使用易散碎的愈傷組織

愈傷組織的結(jié)構(gòu)是受遺傳因子控制的，因而有時無論采用什么辦法也難于使細胞充分分散。不過，一般來說，如果培養(yǎng)基的成分和繼代方法選用得當，總有可能提高細胞的分散程度。如果把愈傷組織在半固體培養(yǎng)基上保存2-3個繼代周期，其松散性常會增加。

已知加人2,4-D，少量水解酶（如纖維素酶和果膠酶），或加入酵母浸出液一類的物質(zhì)，都能促進細胞的分散。2.加入特殊物質(zhì)

如果每隔1d加一次新鮮培養(yǎng)基，使生物量與培養(yǎng)基容積之比保持為2，這樣，懸浮培養(yǎng)細胞即可長期保持在對數(shù)生長晚期，于是就有可能使細胞最大程度分散。

3.加新鮮培養(yǎng)基

在對懸浮培養(yǎng)細胞進行繼代時可使用吸管或注射器，但其進液口的孔徑必須小到只能通過單細胞和小細胞團（2-4個細胞），而不能通過大的細胞聚集體。繼代前應(yīng)先使三角瓶靜置數(shù)秒，以便讓大的細胞團沉降下去，然后再由上層吸取懸浮液。4.選擇單細胞和小細胞團進行繼代但是必須記住，即使在分散程度最好的懸浮液中也存在著細胞團，每個細胞團由幾個或幾十個細胞組成，只含有游離細胞的懸浮液是沒有的。這是因為植物細胞具有集聚在一起的特性，由一個初始細胞經(jīng)過分裂產(chǎn)生的若干個子細胞，不能像子代細菌那樣各自分散在培養(yǎng)液中。（二）連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）

指在培養(yǎng)過程中，不斷注人新鮮培養(yǎng)基，排掉用過的培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)物的容積恒定，使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)得到不斷補充。加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)圖示：連續(xù)培養(yǎng)的類型封閉型開放型

排出的舊培養(yǎng)基由加人的新培養(yǎng)基進行補充，進出數(shù)量保持平衡。封閉型連續(xù)培養(yǎng)的特點

懸浮在排出液中的細胞經(jīng)機械方法收集起來之后，又被放回到培養(yǎng)系統(tǒng)中。

隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)目不斷增加。

注入的新鮮培養(yǎng)液的體積與流出的原有培養(yǎng)液及其中細胞的容積相等。開放型連續(xù)培養(yǎng)的特點

培養(yǎng)物的生長速度永遠保持在一個接近最高值的恒定水平上（通過調(diào)節(jié)流入和流出的速度）。

10.2.2細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基

能用來建立生長快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般來說也同樣適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)，只是瓊脂當然要從中去掉。

為了提高細胞的分散程度，對于生長素和細胞分裂素的比例需要進行一些調(diào)節(jié)。以煙草為例，根據(jù)Murashige的建議，2,4-D的濃度應(yīng)由0.3mg/L提高到2mg/L，此外還須補加上另外幾種維生素和水解酪蛋白。

在實踐中發(fā)現(xiàn)：

在活躍生長的懸浮培養(yǎng)物中，無機磷酸鹽的消耗很快，不久就變成了一個限制因子。如把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標準的MS無機鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)起始后的3d之內(nèi)磷酸鹽的濃度就幾乎下降到零。即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來水平的3倍，5d之內(nèi)也會被細胞全部用光。因此，為了進行高等植物的細胞懸浮培養(yǎng)，特別設(shè)計了B5和ER兩種培養(yǎng)基，但一般來說，這兩種培養(yǎng)基，以及其他一些合成培養(yǎng)基，也只有當細胞的初始群體密度約為5×104細胞／ml或更高時才是適用的。當細胞密度較低時，在培養(yǎng)基中還須加人各種其他成分，或是使用條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基的使用方法

簡便方法是把在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了4～6周的高密度細胞濾掉，而用它的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來培養(yǎng)單細胞或低密度細胞群體。

條件培養(yǎng)基是在其中曾培養(yǎng)過一段時間植物組織的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的振蕩

首先，它可對細胞團施加一種緩和的壓力使它們破碎成小細胞團和單細胞；

其次，振蕩可以使細胞和小細胞團在培養(yǎng)基中保持均勻的分布。

此外，培養(yǎng)基的運動還會促進培養(yǎng)基和容器內(nèi)空氣之間的氣體交換。

在懸浮培養(yǎng)中，為了使培養(yǎng)基能不停地運動，可以使用各種類型的設(shè)計。

(1)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(2)往返震蕩培養(yǎng)(3)旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)(4)攪動培養(yǎng)10.2.3懸浮培養(yǎng)細胞的同步化

同步培養(yǎng)是指在培養(yǎng)中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段(G1，S，G2和M)。同步性程度以同步百分數(shù)表示。

細胞周期指由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，所需的時間叫細胞周期時間?？煞譃樗膫€階段（圖13-1）：①G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時間；②S期(synthesisphase)，指DNA復(fù)制的時期，只有在這一時期H3-TDR才能摻入新合成的DNA中；③G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之前的一段時間；④M期又稱D期(mitosisordivision)，細胞分裂開始到結(jié)束。確定同步性的參數(shù)①在某一時刻處于細胞周期某一點上的細胞的百分數(shù)；②在一個短暫的具體時間內(nèi)通過細胞周期中某一點的細胞的百分數(shù)；③全部細胞通過細胞周期中某一點所需的總時間占細胞周期時間長度的百分數(shù)。

物理方法和化學(xué)方法。物理方法主要是通過對細胞物理特性（細胞或小細胞團的大小）或生長環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，實現(xiàn)高度同步化，其中包括按細胞團的大小進行選擇的方法和低溫休克法等。懸浮培養(yǎng)細胞同步化的方法有兩類：

化學(xué)方法的原理是使細胞遭受某種營養(yǎng)饑餓，或是通過加人某種生化抑制劑阻止細胞完成其分裂周期?；瘜W(xué)方法中常用的有饑餓法和抑制法兩種。（一）饑餓法在這種方法中，先對細胞斷絕供應(yīng)一種進行細胞分裂所必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1期或G2期，經(jīng)過一段時間的饑餓之后，當重新在培養(yǎng)基中加人這種限制因子時，靜止細胞就會同步進人分裂。Komamine等（1978)在長春花懸浮培養(yǎng)中先使細胞受到磷酸鹽饑餓4d，然后再把它們轉(zhuǎn)人到含有磷酸鹽的培養(yǎng)基中，結(jié)果獲得了同步性。

另有作者通過使煙草品種Wisconsin-38的懸浮培養(yǎng)細胞受到細胞分裂素饑餓，使胡蘿卜細胞受到生長素饑餓，也取得了同步化的效果。

（二）抑制法使用DNA合成抑制劑如5-氨基尿嘧啶、羥基脲和胸腺嘧啶脫氧核苷等，也可使培養(yǎng)細胞同步化。當細胞受到這些化學(xué)藥物的處理之后，細胞周期只能進行到G1期為止，細胞都滯留在G1期和S期的邊界上。當把這些抑制劑去掉之后，細胞即進人同步分裂。應(yīng)用這種方法取得的細胞同步性只限于一個細胞周期。

另據(jù)報道，以氮或乙烯定期注人大豆的化學(xué)恒定式培養(yǎng)物中，也能誘導(dǎo)細胞的同步性。10.2.4由懸浮細胞再生植株

在所用培養(yǎng)基適當、繼代培養(yǎng)及時的情況下，懸浮培養(yǎng)細胞能保持相當長時間的植株再生能力。如水稻懸浮細胞每3d繼代一次，懸浮培養(yǎng)18個月后，其植株再生率仍高達90%。由懸浮培養(yǎng)細胞再生植株的途徑有兩種：

一種是由懸浮細胞直接形成體細胞胚，如在胡蘿卜的細胞懸浮培養(yǎng)中，在含有2,4-D的MS液體培養(yǎng)基中進行懸浮振蕩培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)細胞團能夠高頻率(80%）直接形成體細胞胚。另一種是先將懸浮培養(yǎng)細胞（團）轉(zhuǎn)移到半固體或固體培養(yǎng)基上，使其增殖形成愈傷組織，然后再由愈傷組織再生植株。

在后一種情況下，如果懸浮培養(yǎng)中的細胞較大，則可將培養(yǎng)瓶短時間靜置令細胞團自然沉降后，用吸管將細胞團轉(zhuǎn)到半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這種培養(yǎng)基的組成基本上與繼代培養(yǎng)基一致，但也須視情況做些調(diào)整，特別是在激素組成方面做些調(diào)整。

不過，對于單細胞、低密度懸浮細胞、或是過于細小的細胞團，則不宜直接把它們轉(zhuǎn)到半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而是要參照原生質(zhì)體或單細胞培養(yǎng)方法，先對它們進行液體淺層培養(yǎng)或看護培養(yǎng)，待形成較大的細胞團后，再轉(zhuǎn)到半固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。10.2.5影響細胞懸浮培養(yǎng)的因素

1.基本培養(yǎng)基的組成

(1)

氮源在具有功能NH4+和NO3-利用系統(tǒng)的培養(yǎng)中，氮吸收常取決于培養(yǎng)基的pH值和培養(yǎng)物的年齡。例如，矮牽牛懸浮細胞在pH4.8~5.6下培養(yǎng)起始吸收的NO3-比NH4+

多，可是在許多情況下，NH4+

只能在低pH值的培養(yǎng)基中被利用。低濃度的總氮通過刺激細胞分裂導(dǎo)致大量小細胞的形成，而高濃度的總氮往往利于細胞生長。

（2)磷植物細胞以各種方式吸收磷，其濃度常常是細胞分裂和生長的限制因子，它與由核苷酸庫（ATP,ADP,AMP)所引起的能量水平以及RNA和DNA合成直接相關(guān)。磷通常抑制游離氨基酸的積累。

(3)硫

硫的缺失使所有蛋白質(zhì)的合成自動停止。如果含硫氨基酸不能繼續(xù)產(chǎn)生，它們便不能參加蛋白質(zhì)的合成。用硫代硫酸鹽、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸和谷胱甘肽代替無機鹽，能使煙草懸浮細胞充分生長；而D-半胱氨酸、D-甲硫氨酸和DL-高半胱氨酸只能使煙草懸浮細胞的生長減少程度保持最低。

(4)鎂、鉀、鈣

到目前為止，幾個報道已經(jīng)表明，這些大量元素是絕對必要的。有關(guān)這些元素如K＋的最適濃度（胡蘿卜為lmmol/L,矮牽牛和煙草為20mmol/L)的研究認為，不同培養(yǎng)物在吸收能力方面的可能差異不必考慮。例如，在大豆等植物的培養(yǎng)中，在培養(yǎng)期間幾乎所有的K＋都被培養(yǎng)細胞所吸收；相反，在煙草的細胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)到了培養(yǎng)末期仍有最初濃度（20mmol/L）的一半的K＋留在培養(yǎng)基中未被利用（Kato等，,1977)。(5)氯Cl一通常影響光系統(tǒng)II的酶類及液泡形成體的ATP酶的活動，干擾細胞的滲透調(diào)節(jié)（osrnoregulation)。在許多情況下，C1一可由Br一和I一所代替。(6)微量元素

微量元素的影響與所用的材料密切相關(guān)。例如，錳對Rutagraveolens是必需的，而對水稻無影響，對胡蘿卜懸浮細胞的生長有促進作用。缺鐵常導(dǎo)致細胞生長的中途停止，而高濃度的鐵（1mmol/L）通常又有抑制作用(Mizukami等，1977)；在大多數(shù)情況下，鐵濃度以0.05-0.2mmol/L為宜。同時，我們應(yīng)該考慮各種元素之間對吸收的互作效應(yīng)。例如，極少量的鈦(Ti）有助于所有大量元素和微量營養(yǎng)成分的吸收。硼特別影響葡萄糖的吸收。2.有機成分(1)氨基酸類

除精氨酸和賴氨酸外，添加作為氮源——NO3-的替代物的氨基酸，通常抑制細胞的生長。實際上，在某些情況下，精氨酸能夠補償其他氨基酸的抑制作用；相反，在顛茄的愈傷組織培養(yǎng)中，精氨酸又是一種抑制劑；但以NH4+作為氮源時卻沒有抑制作用。此外，不同氨基酸之間是相互影響的。在煙草細胞懸浮培養(yǎng)中，半胱氨酸的吸收受L-亮氨酸、L-精氨酸、L-酪氨酸和L-脯氨酸的抑制。

(2）維生素類

對維生素類的需求因植物而異。硫胺素通常是需要的（0.1～30mg/L）。在Convolvulusarvensis懸浮培養(yǎng)中，硫胺素缺乏能夠誘導(dǎo)細胞顯著分裂。在Acerpseudoplatanus懸浮培養(yǎng)中，如果硫胺素、吡哆酸、半胱氨酸、膽堿、肌醇都缺乏，則懸浮細胞的生長顯著下降；但如果僅缺乏其中的一種，則無影響。在少數(shù)情況下，發(fā)現(xiàn)添加煙酸和吡哆醇能刺激細胞生長。3.碳源(1)碳水化合物

培養(yǎng)物對各種碳水化合物的反應(yīng)取決于所培養(yǎng)的植物種類和碳水化合物濃度（表6-3、表6-4）。例如，有些培養(yǎng)物在僅加葡萄糖時便能正常生長，而有些培養(yǎng)物需要在培養(yǎng)基中加入果糖或蔗糖（2％～3%）才能正常生長。肌醇對各種培養(yǎng)物都是必需的。表6-3各種碳源對Morindacitrifolia懸浮細胞生長及蒽醌形成的影晌

表6-4蔗糖數(shù)量對Catharanthusrosehs懸浮細胞生長及產(chǎn)物形成的影晌

(2)CO2

通常，細胞生長隨著CO2

質(zhì)量分數(shù)的增加而增加，但也有例外。

為了維持細胞生長以及使光自養(yǎng)培養(yǎng)物完全綠化，需要連續(xù)提供2％-5％的CO2。4.植物激素(1)生長素類

生長素類的影響因所用植物種類及生長素種類不同而不同。

2,4-D特別有利于薄壁細胞的生長，所以在植物細胞懸浮培養(yǎng)中，常加人適宜濃度的2,4-D。(2)細胞分裂素

細胞分裂素的效果受多種因素的影響，因所選用的植物種類、激素種類及濃度不同而不同。

植物細胞中的細胞分裂素可被細胞分裂素氧化酶鈍化。在煙草中，細胞分裂素的降解似乎受到外源細胞分裂素的調(diào)控，后者導(dǎo)致細胞分裂素氧化酶的迅速增加。

細胞分裂素誘導(dǎo)細胞分裂。

有關(guān)細胞分裂素的作用位點及作用機理目前所知甚少。(3)乙烯

內(nèi)源乙烯生產(chǎn)是旺盛分裂細胞的特征，因此其生產(chǎn)受到生長素(IAA,NAA,2,4-D）的促進。在非光合培養(yǎng)物中，乙烯同其他激素協(xié)同作用。乙烯誘導(dǎo)細胞壁增厚。用2-氯-乙烯-磷酸處理釋放出乙烯，結(jié)果由于液泡體積減小，從而導(dǎo)致致密的細胞發(fā)育。pH值對鐵吸收以及懸浮細胞的生活力的影響很大。H＋濃度的變化常常影響特定酶反應(yīng)。在有些培養(yǎng)中，懸浮細胞生活力的下降可通過添加椰子汁

(10%）或聚乙烯吡咯烷酮(PVP，1%）來改善，這是因為它們具有緩沖作用。

5.培養(yǎng)基的pH值及滲透壓

長期以來，滲透壓對細胞生長的影響一直未引起重視。但是研究發(fā)現(xiàn)，在各種植物的懸浮培養(yǎng)中，增加葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇，特別是甘露醇的濃度（0.3-0.6mol/L)，能夠增加細胞干重和鮮重，同時使細胞體積變小。6.振蕩頻率（shakingfrequency,stirringfrequency）

振蕩頻率對懸浮培養(yǎng)中的細胞團大小、細胞生活力和生長均有影響。例如，玫瑰細胞在30r/min下能存活而且不被損傷，可是煙草細胞能耐受最大150r/min的振蕩。7.培養(yǎng)條件

光的波長及光照強度對懸浮培養(yǎng)細胞具有影響。據(jù)報道，高光照強度能夠提高煙草的綠色愈傷組織由來的單細胞植板效率，但抑制無葉綠素的培養(yǎng)物的細胞生長。

一般來說，(26士3)℃的溫度適合于植物生長。過高、過低的溫度均不利于懸浮細胞的增殖。11

原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)10.1

原生質(zhì)體的分離10.1.1

原生質(zhì)體的分離方法⑴機械法⑵酶解法⑴機械法完整細胞質(zhì)壁分離利刃切割原生質(zhì)體缺點：產(chǎn)量很低由分生細胞和其它液泡化程度不高的細胞中分離原生質(zhì)體時不適用。⑵酶解法（離析酶、纖維素酶）兩步法：先用離析酶處理產(chǎn)生單細胞，再用纖維素酶消化掉細胞壁，釋放出原生質(zhì)體。一步法：兩種酶同時使用。

用此法可從每種植物組織中分離出原生質(zhì)體，只要該組織的細胞還沒有木質(zhì)化即可?，F(xiàn)已從下列組織中獲得原生質(zhì)體：葉肉細胞、根組織、豆科植物的根瘤、莖尖、胚芽鞘、塊莖、花瓣、小孢子母細胞、果實組織、糊粉細胞、下胚軸和培養(yǎng)的細胞等。

有活力和適于培養(yǎng)的原生質(zhì)體的大量分離受到若干因素的影響，一個實驗體系所需的最適條件主要是靠經(jīng)驗確定的。在想用一個新的實驗系統(tǒng)分離原生質(zhì)體時，可以參考Uchimiya和Murashige(1974)在煙草培養(yǎng)細胞上所做的工作，和Scott等（1978）在禾谷類植物葉肉組織上所做的工作（見表11.2)。用一步法制備煙草葉肉細胞原生質(zhì)體

1．由種在溫室的7-8周齡的植株上選取充分展開的葉片。2．先將葉片浸于70％酒精中30s，再以0.4％-0.5％次氯酸鈉溶液漂洗約30min，以進行葉片的表面消毒。3．用無菌蒸餾水徹底洗凈殘存的次氯酸納。4·用尖鑷子撕掉葉片的下表皮，再用解剖刀將去掉了下表皮的葉片切成小塊。5．將剝?nèi)チ讼卤砥さ娜~段置于一薄層600mmol/L甘露醇-CPW溶液中，注意須使葉片無表皮的一面與溶液接觸。6．大約30min以后，用經(jīng)過過濾滅菌的含有4％纖維素酶SS,0.4％離析酶SS,600mmol/L甘露醇和CPW鹽的酶溶液取代甘露醇-CPW溶液。7．用封口膜將培養(yǎng)皿封嚴。置于暗處在24-26℃下保溫16-18h。8．用吸管輕輕壓擠葉段，以釋放出原生質(zhì)體。9．通過一個60-80μm的細胞篩過濾以除去較大的碎屑。10．將濾出液置于一個螺帽離心管中，在100g下離心3min，使原生質(zhì)體（和剩余的碎屑一起）沉降。11．棄去上清液，將沉降物置于裝在一個螺帽離心管中的、用CPW配制的860mmol/L蔗糖溶液的頂部，在100g下離心10min。12．由蔗糖溶液的頂部把綠色的原生質(zhì)體帶收集起來，并轉(zhuǎn)人到另一個離心管中。13．在離心管中加人原生質(zhì)體培養(yǎng)基以使原生質(zhì)體懸浮，在100g下離心3min，重復(fù)本項清洗過程至少3次。14．最末一次清洗之后，加入足量培養(yǎng)基，使原生質(zhì)體密度達到0.5×105/ml到1×105ml。15．將原生質(zhì)體植板于培養(yǎng)皿中，或成小滴（100-150μl）狀，或成一薄層。10.1.2

影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因子⑴材料來源葉片：

植株的年齡和生長條件十分重要離體培養(yǎng)的植株溫室或生長室栽種的植株：低光照強度（1000μW/cm2），短日照，溫度范圍20-25℃，相對濕度60-80％，充足的氮肥供應(yīng)。培養(yǎng)細胞：生長速度和生長時期

頻繁繼代（每3天一次）的懸浮培養(yǎng)物及處于對數(shù)生長期的細胞。⑵前處理消毒：芐烷銨（0.1％）－酒精（10％）溶液漂洗5分鐘，或用60-70％的酒精漂洗，再在超凈工作臺上使酒精蒸發(fā)。促酶液進入組織措施：撕去葉的下表皮切塊摩擦用246目金剛砂摩擦葉的下表面用真空處理。攪拌或震動⑶酶處理原生質(zhì)體分離的情況在很大程度上取決于所用酶的性質(zhì)和濃度。酶的種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、崩潰酶（同時具有纖維素酶、果膠酶、地衣多糖酶和木聚糖酶的酶解活性）粗制酶：可通過聚丙烯酰胺凝膠或葡聚糖凝膠G25進行過濾洗提。純化酶粗制酶的效果好于純化酶。影響酶活性的因素：pH值（按廠家說明）、溫度40-50/20-30℃、持續(xù)時間30min-20h、用量（酶溶液的體積／植物組織數(shù)量＝10ml／1g）⑷滲壓劑滲透破碎性非電解質(zhì)滲壓劑：山梨醇、甘露醇(450-800mmol/L);葡萄糖、果糖、半乳糖也有效。可加入一些鹽類如CaCl2以提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性電解質(zhì)滲壓劑：能提高原生質(zhì)體的活力，產(chǎn)生更為純凈的制品。但以鹽類調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓則是有害的。10.1.3

原生質(zhì)體的凈化酶解后的混合物中有完整的原生質(zhì)體、亞細胞碎屑如葉綠體、微管成分、未被消化的細胞和破碎的原生質(zhì)體，因此必須凈化。先粗過濾：用孔徑為50-70μm的鎳絲網(wǎng)過濾。純化：用沉降法漂浮法界面法⑴沉降法將鎳絲網(wǎng)濾出液置于離心管中，在75-100g下離心2-3min后，原生質(zhì)體沉于離心管底部，殘渣碎屑懸浮于上清液中。棄去上清液，再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中，在50g離心3-5min后再懸浮，如此重復(fù)3次。常用的原生質(zhì)體清洗液培養(yǎng)基為CPW鹽溶液，成分為（mg/L）:KH2PO427.2KI0.16KNO3101.0CuSO4·5H2O0.025CaCl2·2H2O1480.0pH5.8MgSO4·7H2O246.0⑵漂浮法根據(jù)原生質(zhì)體來源不同，利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。將懸浮在少量酶混合液或清洗培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體沉淀和碎屑置于離心管內(nèi)蔗糖溶液（21％）的頂部，在100g下離心10min。碎屑下沉到管底后，一個純凈的原生質(zhì)體帶出現(xiàn)在蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)基的界面上，用移液管小心的將原生質(zhì)體吸出，轉(zhuǎn)入到另一個離心管中。如此重復(fù)3次。⑶界面法利用兩種密度不同的溶液，離心后使完整的原生質(zhì)體處在兩液相的界面。在離心管中依次加入一層溶于培養(yǎng)基中500mmol/L蔗糖，一層溶于培養(yǎng)基中的140mmol/L蔗糖和360mmol/L山梨醇，最后是一層懸浮于酶溶液中的原生質(zhì)體，其中含有300mmol/L山梨醇和100mmol/LCaCl2。經(jīng)400g5min離心之后，原生質(zhì)體層出現(xiàn)在中間，碎屑移動到管底。10.1.4

原生質(zhì)體活力的測定相差顯微術(shù)法在顯微鏡下，根據(jù)細胞質(zhì)環(huán)流和正常細胞核的存在與否，即可鑒別出細胞的死活。雖然利用相差顯微鏡可以得到更明顯的圖像，但在亮視野顯微鏡下常常也不難進行這樣的觀察。四唑鹽還原法在這個檢驗方法中，通過2,3,5-氯化三苯基四唑(TTC)還原成紅色染料甲-----可以測定細胞的呼吸效率。甲臘可以提取出來用分光光度計進行測定。這個方法雖然可使觀察結(jié)果定量化，但單獨使用時在有些情況下不能得到可靠的結(jié)果。熒光素雙醋酸酯(FDA)法首先用丙酮制備0.5％的FDA貯備液，置0℃下保存。當要測定細胞活力時，將貯備液加到原生質(zhì)體懸浮液中（注意須在FDA溶液中加人一種適當?shù)臐B透壓穩(wěn)定劑），加人的數(shù)量以使最終濃度為0.01％為準。保溫5min后，用一臺帶有適當?shù)募ぐl(fā)片和吸收片的水銀蒸氣燈對細胞進行檢查。FDA既不發(fā)熒光也不具極性，能自由地穿越細胞質(zhì)膜。在活細胞內(nèi)FDA被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分（熒光素）釋放出來。由于熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，因而就在完整的活細胞的細胞質(zhì)中積累起來，但在死細胞和破損細胞中則不能積累。當以紫外光照射時，熒光素產(chǎn)生綠色熒光，據(jù)此可以鑒別細胞的死活。

伊凡藍染色法這種方法可用做FDA的互補法。當以伊凡藍的稀薄溶液（0.025％）對細胞進行處理時，只有活力已受損傷的細胞能夠攝取這種染料，而完整的活細胞不能攝取這種染料。因此，凡不染色的細胞皆為活細胞。

氧電極法光合法10.2

原生質(zhì)體培養(yǎng)10.2.1

供體植物的選擇供體組織的生理狀態(tài)和原生質(zhì)體的質(zhì)量的重要性與培養(yǎng)條件同樣重要。據(jù)Schenck和Hoffmann（1979）報道，由種在溫室或生長箱中的植株制備的油菜和甘藍的原生質(zhì)體不能進行分裂，而由無菌條件下生長的幼苗制備的原生質(zhì)體則能形成愈傷組織。Shepard等建議，用于制備原生質(zhì)體的馬鈴薯植株應(yīng)種在營養(yǎng)、溫度、光強和光周期等可嚴格控制的條件下，否則否則無論采用什么培養(yǎng)基原生質(zhì)體也不能進行分裂。在若干物種（如甘藍、甘薯、大豆和陸地棉等）中，由新采集的葉片制備的原生質(zhì)體不能進行持續(xù)的分裂，在這種情況下，若先把葉片在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3-7d，則有可能獲得可分裂的原生質(zhì)體。10.2.2

原生質(zhì)體培養(yǎng)10.2.2.1

成分基礎(chǔ)培養(yǎng)基:MS、B5、或它們衍生培養(yǎng)基的鹽類。據(jù)Kao等報道，在Viciahajastanah和無芒雀麥的原生質(zhì)體培養(yǎng)中，若在B5培養(yǎng)基中加入1mmol/LCaCl2，能提高分裂細胞百分數(shù)。但若加入20mmol/LNH4NO3則會降低分裂細胞的頻率。維生素：和標準組織培養(yǎng)基中的相同。激素：特別是生長素和細胞分裂素幾乎總是必不可少的，但加入的生長素和細胞分裂素的種類和之間的配比因植物材料而不同。生長素中常用的是2,4-D，IAA，NAA，細胞分裂素中最常用的是BAP、激動素、2-ip。注意：認為原生質(zhì)體在培養(yǎng)中的表現(xiàn)與無壁細胞相當?shù)倪@樣一種簡單概念并非總是正確的。如當去掉細胞壁后，培養(yǎng)的冠癭瘤細胞就會失去其生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的自主性，而在多細胞階段，這種自主性又得到了恢復(fù)。10.2.2.2

滲壓劑

在還沒有再生出一個堅韌的細胞壁之前，原生質(zhì)體必須有培養(yǎng)基滲透壓的保護。像在酶溶液中一樣，培養(yǎng)基中的滲透壓一般是以500~600mmol/L甘露醇或山梨醇調(diào)節(jié)的。據(jù)Scott報道，對豌豆等植物的葉肉原生質(zhì)體來說，蔗糖或葡萄糖不能取代甘露醇或山梨醇用做培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑。但有些作者發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的作用優(yōu)于其他的滲壓劑。Shepard等在馬鈴薯、甘薯和木薯原生質(zhì)體培養(yǎng)中則經(jīng)常用蔗糖作為滲透壓穩(wěn)定劑。在培養(yǎng)基中使用電解質(zhì)滲壓劑會抑制壁的再生，導(dǎo)致不能進行正常的有絲分裂。

培養(yǎng)開始后7~10d，大部分有活力的原生質(zhì)體已經(jīng)再生出細胞壁并進行了幾次分裂，此后通過定期加入幾滴不含滲壓劑或滲壓劑水平很低的新鮮培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)基的滲透壓逐漸下降。若還把滲壓劑保持在原來的高水平上，若干時間以后細胞就會停止分裂。最后將肉眼可見的細胞團轉(zhuǎn)入到不含滲壓劑的新鮮培養(yǎng)基中。10.2.3

培養(yǎng)條件光照：新分離出來的原生質(zhì)體應(yīng)在散射光或黑暗中培養(yǎng)。在某些物種中原生質(zhì)體對光非常敏感，最初的5~7d應(yīng)置于完全黑暗中培養(yǎng)。在顯微鏡臺上以加綠色濾光片的白只燈照射5min，豌豆根原生質(zhì)體的有絲分裂活動就會受到完全的抑制。經(jīng)過5~7d，當完整的細胞壁形成以后，細胞就具備了耐光的特性，這時才可把培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到光下。因此，在原生質(zhì)體對光敏感的情況下，應(yīng)當盡量少做觀察，凡經(jīng)觀察過的原生質(zhì)體不應(yīng)包括在以后的實驗結(jié)果中。溫度：原生質(zhì)體培養(yǎng)一般是在25~30℃下進行的。但對此研究較少。當培養(yǎng)在25℃溫度下時，番茄和秘魯番茄的葉肉原生質(zhì)體，或是不能分裂，或是分裂的頻率很低；但在27~29℃下，這些原生質(zhì)體發(fā)生分裂，植板效率很高。據(jù)認為，較高的溫度不僅能影響分裂的速率，而且在迄今不能分裂的原生質(zhì)體系統(tǒng)中，還可能是啟動和維持分裂的一個前提。10.2.4

培養(yǎng)方法11.2.4.1固體培養(yǎng)——瓊脂糖包埋原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法和對培養(yǎng)條件的要求常與單細胞培養(yǎng)相似。故原生質(zhì)體可按Bergmann的細胞植板法用瓊脂平板進行培養(yǎng)。但近年來發(fā)現(xiàn)，用瓊脂糖代替瓊脂可以提高植板效率。特別是那些在瓊脂培養(yǎng)基上不易發(fā)生分裂的原生質(zhì)體，使用瓊脂糖可能會取得比較好的效果。低融點瓊脂糖可在30℃左右融化，與原生質(zhì)體混合不影響原生質(zhì)體的生活力。原生質(zhì)體培養(yǎng)的技術(shù)流程10.2.4.2

液體培養(yǎng)使用液體培養(yǎng)基的優(yōu)點:①經(jīng)過幾天培養(yǎng)之后，可用有效的方法把培養(yǎng)基的滲透壓降低；②如果原生質(zhì)體中蛻變組分發(fā)生了某些能殺死健康細胞的有毒物質(zhì)，可以更換培養(yǎng)基；③經(jīng)過幾天高密度培養(yǎng)之后，可以把細胞密度降低，或把特別感興趣的細胞分離出來．液體培養(yǎng)常采用的方式：⑴液體淺層培養(yǎng)⑵微滴培養(yǎng)⑴液體淺層培養(yǎng)

將含有一定密度原生質(zhì)體的液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)皿底部鋪成一薄層,厚1mm左右，用封口膜封口后進行培養(yǎng)。注意：應(yīng)用此法時原生質(zhì)體間容易發(fā)生粘連，影響它們的生長發(fā)育。⑵微滴培