小白鼠肝細胞線粒體的超活染色及觀察實驗報告

【實 驗 題 目 】小白鼠肝細胞線粒體的超活染色及觀察【實驗目的】1、 掌握線粒體的超活染色原理及方法。2、 觀察動物肝細胞內線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布?！緦嶒灢牧吓c用品】試劑：％的詹納綠B染液、Ringer試劑器具：解剖盤、鑷子、剪刀、雙凹片、小燒杯、載玻片、蓋玻片、膠頭滴管、顯微鏡等材料：小鼠【實驗原理】I?線粒體線粒體是一種存在于大多數(shù)細胞中的由兩層膜包裹的細胞器，直徑在微米左右；線粒體是細胞內氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要場所，為細胞的活動提供了能量，有“細胞動力工廠”之稱。線粒體在代謝活動旺盛的細胞，如肌肉細胞，肝細胞，神經細胞等中大量存在；線粒體的數(shù)量差異巨大，如在肝臟細胞中有1000-2000個線粒體，而有些細胞只有一個線粒體，如酵母菌細胞的大型分支線粒體，大多數(shù)哺乳動物成熟紅細胞不具有線粒體。線粒體分布方向與微管一致，通常分布在細胞功能旺盛的區(qū)域：如在腎臟細胞中靠近微血管，呈平行或柵狀排列；在腸表皮細胞中呈兩極分布，集中在頂端和基端，在精子中分布在鞭毛中區(qū)。II超活染色實驗原理超活染色也稱活體染色，是指對生命有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法；超活染色的目的是顯示生活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞死亡。應用活體染色技術可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結構和生理病理狀態(tài)。

活體染色根據染色劑的性質和染色方法不同分為：體內活染（注入、固定、堆積）、體外活染（分離、浸染、固定）1） 體內活染：是以膠體狀的染料溶液注入動植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的作用。2） 體外活染：又稱超活染色，它是由活的動植物分離出的細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，燃料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色?；铙w染色之所以能固定，堆積在細胞內某些特殊部分，主要是染料的“電化學”特性起到重要作用；堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染液的膠粒表面帶陰離子，被染的部分本身也是具有陽離子或陰離子，這樣它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用，從而使樣品著色。不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料?；铙w染色劑的選擇原則：1、 對細胞無毒性或毒性極小的染劑2、 具有電化學特性3、 配成稀淡的溶液來使用4、 具有專一性（特異性）5、 一般是以堿性染料最為適用，可能因為它具有溶解在類脂質（如卵磷脂、膽固醇等）的特性，易于被細胞吸收。本實驗采用的活體染色劑…詹納斯綠B詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性的對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)--藍綠色）；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原呈無色的色基（即無色狀態(tài)）。另外，中性紅也屬于堿性染料，對植物液泡系的染色有專一性?！緦嶒灢襟E】一、大體流程f斷頭法處死小白鼠取肝組織f斷頭法處死小白鼠取肝組織剪下合適大小的肝組織小 —用詹納斯綠B染色20-30min制片，高信鏡觀察取著色制片，高信鏡觀察Ringer溶液制成懸液二、具體操作1、 用斷頭法處死小白鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，取出小白鼠肝組織，選取邊緣較薄的肝組織，放入小燒杯中，用Ringer液沖洗去血污。2、 在干凈的凹面載玻片的凹穴中，滴加1/5000詹納斯綠B溶液，再將上述洗凈的肝組織移入染液中（注意：不可將組織塊完全浸沒，要是組織塊至少三分之一的部分露在染液外，這樣細胞內的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色）進行染色，一般染色20—30min，以組織塊邊緣被染成藍綠色為準。3、 吸去染液，用剪刀將組織塊著色部分剪下重置小燒杯中，滴加Ringer溶液，用剪刀將組織充分剪碎制成懸液。4、 取上述細胞懸液滴片，加上蓋玻片，在高倍鏡下觀察?！緦嶒灲Y果與分析 】實驗結果理想狀態(tài)下小鼠肝細胞細胞質中的線粒體應被染成藍綠色，在高倍鏡（10*40）下觀察到的結果如下：圖1:10*40倍顯微鏡下觀察小鼠肝細胞 圖2:10*40倍顯微鏡下觀察圖實驗分析在打開小鼠腹腔后，可找到呈淡紅褐色的肝臟，其邊緣很薄，呈小三角形狀；在取下肝臟的操作中，發(fā)現(xiàn)其比較柔軟，易被鑷子的尖端挑破。所以剪的時候要注意，既要是所得的組織塊體積較小，又不要讓其破碎。在將肝細胞進行染色的過程中，大約20min左右可看到半浸在染液中的肝組織的邊緣部分出現(xiàn)藍綠色；取著色部分制成細胞懸液后在40倍顯微鏡下觀察，可以看到小鼠肝細胞細胞質中的線粒體被詹納斯綠B染液著色，不過著色程度很淺，為淺綠色，可能是染色時間不夠，染色不夠充分導致的，也有可能是因為所選用的詹納斯綠B染劑的濃度極稀（％），使得染色過程有一定難度。在顯微鏡下觀察時，可以看到肝細胞的周圍有紅細胞出現(xiàn)，但是數(shù)量并不是很多，不影響觀察。若是在觀察中發(fā)現(xiàn)有大量的紅細胞，可能是在處死小鼠時，放血不夠充分，導致大量血液淤留在了肝臟中，使最終視野中紅細胞過多；也有可能是取出肝組織塊后，沒有用Ringer溶液將血污沖洗干凈，使部分血液殘留在肝組織塊表面，并最終混在了細胞懸液內。m,實驗討論使用肝細胞的緣由：線粒體含量較多，每個肝細胞有1000-2000個線粒體；長度適合觀察，約5um；肝臟較軟，易于破碎，并且適于快速提取，因而利于保持線粒體活性；【注意事項】1、 用斷頭法處死小白鼠后，要將血放干凈，可以剪開小鼠兩側頸動脈，使血液盡量流出，防止肝臟中儲存過多血液，影響觀察。2、 打開腹腔后，可以看到肝臟位于左手邊，呈紅色，但顏色有一些偏淡，不要與右手邊血紅色的脾臟混淆，切下小鼠的肝臟，備用，剪的時候要注意避開各種血管，防止出血量過多凝結。3、 在從小鼠體內取肝組織塊時要盡快，從而保證它具有更高的活性。4、 剪下來的組織塊要立即放到Ringer緩沖液中去洗去其上的血液，因為如果組織塊長時間暴露在空氣中的話，其上的血液會凝固，使得染色操作變得困難，洗的時候用鑷子輕輕的夾住涮洗，這樣可使血液快速的被洗脫，但不要太用力，這樣會將組織塊弄碎。5、 從小鼠肝臟上取組織塊的時候，要選取薄邊的一端，從此處取2小塊，這一部分血少，易取（另一端太厚，不易取也不易染色，而且剪的時候出血量比較多）。在選取肝組織片時要在處于邊緣，且為由薄到厚的地方選取。6、 染色時要使組織塊上面部分（至少三分之一）露在染液外，不可完全浸沒在染液中，以便