基因文庫技術(shù)課件

Leptin基因Micewithouttheleptingenearemorbidlyobese(right)comparedtonormalmice(left).

1994年，美國Rockfeller大學(xué)研究開發(fā)的肥胖相關(guān)基因Leptin以2000萬美元轉(zhuǎn)讓給Amgen公司。

Effectsofrecombinanthumanleptintreatmentinachildwithleptindeficiency.第四章

目的基因的分離克隆

第一節(jié)

基因文庫技術(shù)分離目的基因

1基因文庫的含義

文庫（library）：是指一種全體的集合?；蛭膸欤╣enelibrary）：是指某一生物全部基因的集合。某生物基因組DNA片段(例如10n個(gè))與載體分子重組，重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上長出的單個(gè)菌落（或噬菌斑）即為一個(gè)DNA片段的克隆。全部片段克隆的集合即為該生物的基因文庫。噬菌斑菌落2基因文庫的分類

1）基因組文庫和cDNA文庫

基因組文庫（genomicDNAlibrary）：是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的片段，然后連接到某種載體上轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而形成的克隆的集合。cDNA文庫（cDNAlibrary）：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期、某一組織或某種環(huán)境條件下所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而形成的克隆的集合。2）克隆文庫和表達(dá)文庫

克隆文庫由克隆載體構(gòu)建。表達(dá)文庫由表達(dá)克隆載體構(gòu)建。3基因文庫的構(gòu)建

1）基因組文庫構(gòu)建的基本步驟（1）基因組DNA的提取及片段化（2）載體的選擇和制備（3）DNA片段與載體連接形成重組DNA（4）重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞基因組文庫（genomicDNAlibrary）：是指將某生物的全部基因組DNA切割成一定長度的片段，然后連接到某種載體上轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而形成的克隆的集合。cDNA文庫（cDNAlibrary）：是指某生物某一發(fā)育時(shí)期、某一組織或某種環(huán)境條件下所轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而形成的克隆的集合。基因文庫（genelibrary）：是指某一生物全部基因的集合。噬菌斑菌落cDNA（complementaryDNA，互補(bǔ)DNA）：以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的DNA。2）cDNA文庫構(gòu)建的基本步驟（1）細(xì)胞總RNA的提取并分離純化出mRNA（2）合成cDNA的第一條鏈（3）將mRNA-DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA（4）雙鏈cDNA與載體連接形成重組DNA（5）重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞5基因文庫的篩選

1）核酸雜交法復(fù)性DNA核酸分子雜交的原理：在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜交雙鏈。探針(probe)：一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在硝酸纖維素膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

探針的設(shè)計(jì)2）免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測法使用抗體探針，通過檢測重組克隆表達(dá)出的蛋白質(zhì)來篩選目的克隆?？贵w探針只適用于表達(dá)文庫的篩選，并只能篩選出表達(dá)了的克隆。3）PCR篩選法1基因文庫的含義是什么？2什么是基因組文庫和cDNA文庫？二者有哪兩點(diǎn)主要區(qū)別？3根據(jù)所使用的載體的不同類型，基因文庫分為哪四種？4舉例說明基因組文庫構(gòu)建的基本步驟。5核酸雜交的基本原理是什么？什么是探針？用核酸雜交法篩選基因文庫時(shí)，探針的序列是根據(jù)什么設(shè)計(jì)的？多克隆位點(diǎn)（MCS，multiplecl