高效液相色譜HLPC課件

高效液相色譜

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系徐克前一基本原理

（一）定義HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，進(jìn)行連續(xù)的、無(wú)數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過(guò)程。

組成：固定相—柱內(nèi)填料流動(dòng)相—洗脫劑（二）固定相（stationaryphase)和流動(dòng)相（mobilephase）(1)化學(xué)鍵合相硅膠化學(xué)官能團(tuán)鍵合到硅膠表面

OHOH

||硅膠（SiO2?nH2O）––Si–O–Si––

||鍵合相反應(yīng)

R1||||–Si–OH+X–Si–R?–Si–O–Si–R+HX||||R2

硅膠有機(jī)硅烷鍵合相X:Cl、CH3O、C2H5O等R:烷C8(C8H17)、C10(C10H21)、C18(C18H37)等R1R2:Z、CH3等

(2)十八烷基硅烷鍵合硅膠填充料（octadecylsilyl,ODS）—萬(wàn)能柱即C18柱或ODS柱主要用于反相HPLC中，適用于各種類型的生物分子

2、流動(dòng)相

（mobile

phase）流動(dòng)相選擇原則：1.樣品易污，且溶解度盡可能大

2.化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱

3.不妨礙檢測(cè)器檢測(cè)分析

4.粘度低，流動(dòng)性好

5.易于從中回收樣品

6.無(wú)毒或低毒，易于操作

7.易于制成高純度，即色譜純

8.廢液易處理，不污染環(huán)境

反相色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃最常用組成：甲醇/H2O、乙腈/H2O洗脫順序：極性物先洗脫下來(lái)正相色譜常用流動(dòng)相及沖洗強(qiáng)度正乙烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇二、分離模式正相HPLC反相HPLC離子交換HPLC凝膠HPLC親和HPLC（一）正相HPLC

（normalphaseHPLC,NP-HPLC）固定相：極性吸附劑（或極性鍵合 相），如硅膠、Al3O2

流動(dòng)相：非極性或弱極性溶劑，如己烷、 庚烷等洗脫順序：非極性、弱極性、極性

應(yīng)用：石油化工產(chǎn)品、染料、農(nóng)藥、醫(yī) 藥、有機(jī)酸、有機(jī)堿等（二）反相HPLC

（reversephaseHPLC,RP-HPLC）固定相：非極性物質(zhì)，如C18(ODS)、

C10、C8、C6、C4、C2

流動(dòng)相：極性溶劑，如甲醇/H2O、乙腈/H2O等洗脫順序：極性、弱極性、非極性

應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽等（三）離子交換HPLC

（ion-exchangeHPLC,IE-HPLC）原理：用離子交換劑作固定相，根據(jù)不同組分在一定pH下，組分電荷性質(zhì)和數(shù)量不同而分離的技術(shù)分類：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：含酸性基團(tuán)：

陰離子交換樹(shù)脂：磺酸基、磷酸基等合堿性基團(tuán)：季胺基、叔胺基等應(yīng)用：核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等（四）凝膠HPLC

（gelHPLC,G-HPLC）原理：基于分子大小和形狀的差異進(jìn)行分析的技術(shù)固定相：交聯(lián)葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠流動(dòng)相：水、乙醇、丙酮等應(yīng)用：核酸、蛋白質(zhì)、酶、多糖等（五）親和HPLC

（affinityHPLC,AF-HPLC）原理：利用生物大分子間專一的親和力 進(jìn)行分離的技術(shù)固定相：基質(zhì)（瓊脂糖凝膠等）交聯(lián)配 基（親和性）應(yīng)用：酶、抗體、抗原、受體等三、HPLC儀器

HPLC儀一般由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、記錄和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)等幾部分組成（一）輸液系統(tǒng)：貯液及脫氣裝置梯度洗脫裝置高壓輸液泵梯度洗脫裝置高壓輸液泵（二）進(jìn)樣系統(tǒng)：（三）柱系統(tǒng)：（四）檢測(cè)器：

與泵、柱組成HPLC的三大關(guān)鍵部件1.紫外吸收檢測(cè)器2.熒光檢測(cè)器4.示差折光檢測(cè)器表.HLPC常用檢測(cè)器檢測(cè)器原理檢測(cè)下限（g/ml）檢測(cè)范圍紫外檢測(cè)器具有紫外吸收性質(zhì)10-7熒光檢測(cè)器具有熒光物質(zhì)10-14電化學(xué)檢測(cè)器具有電解活性物質(zhì)10-12示差折光檢測(cè)器與流動(dòng)相折光率不同10-7糖類等蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多肽、激素等多環(huán)芳烴、氨基酸、維生素等食品、環(huán)境、生化、醫(yī)學(xué)等（五）不同HPLC產(chǎn)品介紹：

高效液相色譜儀器（１）高效液相色譜儀器（2）高效液相色譜儀器（3）高效液相色譜儀器（4）四、定性和定量定性分析１．保留值定性：比較未知峰與標(biāo)準(zhǔn)物的保留 值２．收集未知峰洗脫液定性：物理分析，化學(xué) 分析，生物學(xué) 分析３．聯(lián)機(jī)定性：液質(zhì)聯(lián)用（ＨＣＬＣ－ＭＳ）液紅聯(lián)用（ＨＣＬＣ－ＩＲ）定量分析分析檢測(cè)物質(zhì)的量（或濃度）與檢測(cè)器的響應(yīng)值（峰面積或峰高）呈正比1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：也稱外標(biāo)法或直接比較法。用標(biāo)準(zhǔn)