輔助保護胃粘膜檢驗方法

輔助保護胃粘膜檢驗方法1動物實驗1.1原理在一定時間內(nèi)給予一定量的受試樣品，用對胃粘膜有損傷作用的物質(zhì)造成急性胃粘膜損傷模型，觀察各劑量組胃粘膜的損傷程度；或用對胃粘膜有損傷作用的物質(zhì)造成慢性胃潰瘍模型，在一定時間內(nèi)給予一定量的受試樣品，觀察各劑量組胃潰瘍的面積和體積，反映受試樣品對胃粘膜的輔助保護作用。1.2實驗動物選用SD或Wistar健康大鼠，單一性別，180－220克，每組8－12只。1.3實驗設(shè)計及劑量分組受試物設(shè)三個劑量組，其中一個應(yīng)為人體推薦量的5倍劑量組，并同時設(shè)置正常對照組。不同的損傷模型，還應(yīng)設(shè)置相應(yīng)的模型對照組。慢性潰瘍模型應(yīng)先造模，手術(shù)次日再分組。受試樣品給予時間一般為14—30天，必要時可以延長至45天。1.4胃粘膜損傷模型1.4.1急性胃粘膜損傷無水乙醇模型1.4.1.1實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.1.2實驗試劑及器材：無水乙醇、甲醛、解剖器械、游標(biāo)卡尺、病理制片系統(tǒng)、顯微鏡等。1.4.1.3實驗方法：動物隨機分空白對照組、模型組和受試樣品三個劑量組。各劑量組灌胃樣品30天后，全部動物嚴(yán)格禁食24小時（不禁水此期間亦禁止給予受試物。除空白對照外，所有試驗組動物給予無水乙醇1.0mL/只，1小時后處死動物，暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10%福爾馬林溶液，固定20min，然后沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，展開胃粘膜，在體視解剖顯微鏡下或肉眼下用游標(biāo)卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度。因?qū)挾人頁p傷的嚴(yán)重性遠較長度大，故雙倍積分。其評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。表1急性無水乙醇損傷大體觀察評分標(biāo)準(zhǔn)損傷程度2分4分出血點---出血帶長度1－5mm6－10mm10－15mm>15mm出血帶寬度1－2mm>2mm--總積分=出血點分值+長度分值+（寬度分值根2）觀察指標(biāo)：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷積分指數(shù)和損傷抑制率（%）表示。損傷發(fā)生率（%）=某組出現(xiàn)出血或潰瘍的大鼠數(shù)量／該組大鼠數(shù)量×100%；損傷積分指數(shù)=組損傷評分總和/組動物數(shù)量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A根100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）。組織病理學(xué)觀察及評分：大體檢查完畢，將每只動物胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位切下，固定于10%甲醛溶液，常規(guī)制片，HE染色，鏡下觀察。注意選擇胃粘膜正橫切面，包括粘膜全層的區(qū)域觀察。評分方法：以充血、出血、粘膜細胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分為5級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細胞變性壞死權(quán)重為3，評分標(biāo)準(zhǔn)及病變總積分公式見表2。表2急性胃粘膜損傷組織病理學(xué)檢查評分標(biāo)準(zhǔn)病變2分4分充血1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層上皮細胞變性壞死1/5－2/52/5－3/53/5－4/5上皮全層病變總積分=充血積分+出血積分根2+上皮細胞變性壞死積分根31.4.2急性胃粘膜損傷消炎痛模型1.4.2.1實驗動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.2.2實驗試劑及器械：消炎痛、甲醛、解剖器械、游標(biāo)卡尺、病理制片系統(tǒng)、顯微鏡等。1.4.2.3實驗方法：動物隨機分空白對照組、模型組和受試樣品三個劑量組，灌胃給予動物受試物30天后，禁食不禁水24小時，模型組和劑量組給予消炎痛40mg/kg一次性腹腔注射。5小時后處死動物，剖腹將胃取出，結(jié)扎幽門和賁門，從十二指腸與幽門部結(jié)合處注入10%甲醛溶液5mL，固定20分鐘后，沿胃大彎剪開，洗凈胃內(nèi)容物，展開胃粘膜，用紙吸干，觀察胃粘膜損傷程度。用游標(biāo)卡尺測量胃出血或潰瘍的最大長度及寬度，以出血或潰瘍的最大長寬徑作為損傷指標(biāo)評分。消炎痛所致胃粘膜損傷的潰瘍一般較小，肉眼觀查以點狀多見，其評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。表3急性胃粘膜損傷消炎痛模型大體觀察評分標(biāo)準(zhǔn)損傷形態(tài)2分4分出血點---出血帶長度1－2mm2－4mm4－6mm>6mm出血帶寬度1－2mm>2mm--總積分=出血點分值+長度分值+（寬度分值根2）注：長度和寬度均以最大徑計。觀察指標(biāo)：各實驗組胃粘膜損傷程度以損傷發(fā)生率（%）、損傷指數(shù)和損傷抑制率（%）表示。損傷發(fā)生率（%）=某組出現(xiàn)出血或潰瘍的大鼠數(shù)量／該組大鼠數(shù)量×100%；損傷指數(shù)=組損傷評分總和／組動物數(shù)量；損傷抑制率（%）=(A-B)/A根100%（A、B分別為模型組與試驗組的損傷積分）組織病理學(xué)觀察及評分：同急性胃粘膜損傷無水乙醇模型。1.4.3慢性胃潰瘍模型1.4.3.1動物：選用Wistar或SD健康大鼠，單一性別。1.4.3.2實驗試劑及器材：冰醋酸、解剖鏡、微量注射器等。1.4.3.3實驗方法：1.4.3.3.1醋酸注射法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚或水合氯醛或戊巴比妥鈉麻醉后，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將胃輕拉出腹腔外，用微量注射器于胃幽門處漿膜下注射20－30μL的30%冰醋酸，縫合切口，術(shù)后正常喂食和水。第二天將手術(shù)后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分為模型組和受試樣品三個劑量組。各劑量組按相應(yīng)劑量灌胃，連續(xù)14天。模型組灌胃蒸餾水或溶劑。禁食24小時后處死，取出整個胃浸泡于10%的福爾馬林溶液內(nèi)，浸泡20分鐘后沿胃大彎剪開，洗凈內(nèi)容物，取腺胃區(qū)展開平鋪于玻璃板上，用紙吸干潰瘍內(nèi)的水分，測量其面積和體積。潰瘍面積和體積測量法：于帶標(biāo)尺的解剖顯微鏡下計數(shù)潰瘍所占的方格數(shù)，換算成面積。然后用微量注射器將有色墨水注入潰瘍內(nèi)，將潰瘍填滿與周邊平齊，讀取微量注射器上刻度即為潰瘍的體積。1.4.3.3.2冰醋酸浸漬法：將動物禁食不禁水24小時，乙醚、異氟烷、巴比妥鈉或水合氯醛麻醉后實施剖腹手術(shù)，消毒腹部，于劍突下切開腹腔，將牛津杯（內(nèi)徑5mm、長10mm）垂直放置胃體部粘膜上，向管腔加入冰醋酸0.2mL，1.5分鐘后用棉簽蘸出冰醋酸，縫合手術(shù)切口，術(shù)后正常喂食和水，第二天將手術(shù)后狀態(tài)良好的動物按體重隨機分組、給藥，動物處置和測量等操作同上。1.5數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性。F值≥F0.05，即P≤0.05，用多個實驗組和對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試物一個或一個以上劑量組與模型對照組比較，急性胃粘膜損傷模型大體觀察評分或大體觀察評分與病理組織學(xué)檢查評分顯著降低，慢性胃潰瘍模型的潰瘍面積和/或體積顯著減小，表明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結(jié)果為陽性。1.6注意事項動物禁食應(yīng)完全，應(yīng)嚴(yán)格控制動物禁食期間食糞便、皮毛、墊料等。2人體試食試驗2.1受試者的選擇標(biāo)準(zhǔn)2.1.1納入受試者標(biāo)準(zhǔn)：符合慢性淺表性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)且經(jīng)胃鏡篩選確診為胃粘膜損傷的自愿受試者。2.1.2慢性淺表性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：病程遷延，有不同程度的消化不良、上腹痛、燒心、噯氣、反酸、腹脹等臨床癥狀，可有上腹部輕度壓痛。符合慢性淺表性胃炎纖維胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)及活體組織檢查診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除胃潰瘍患者。2.1.3排除受試者標(biāo)準(zhǔn)：2.1.3.1年齡在18歲以下或65歲以上，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)及對本樣品過敏者。2.1.3.2繼發(fā)性慢性胃炎。2.1.3.3合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，精神病患者。2.1.3.4經(jīng)常用藥、嗜酒、吸煙，4周內(nèi)參加過其它實驗。2.1.3.53個月內(nèi)用過已知對胃腸功能有損害的藥物。2.1.3.6癥狀、體征分級為重癥者。2.1.3.7有嚴(yán)重消化系統(tǒng)潰瘍的病人。2.1.3.8正在服用其它治療藥物或接受其它治療者。2.1.3.9未按規(guī)定服用樣品，無法判斷功效，或資料不全等影響功效或安全性判斷者。2.2試驗設(shè)計及服樣期限采用組間和自身兩種對照設(shè)計。按受試者的癥狀輕重隨機分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡、性別、病程等，進行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。2.3受試樣品的劑量和使用方法試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品，在試驗期間停用其它用于慢性胃病的物品，對照組服用安慰劑。按雙盲法進行試食試驗。觀察時間不少于30天，必要時可延長至45天。試驗期間不改變原來的飲食習(xí)慣，正常飲食。2.4觀察指標(biāo)2.4.1安全性指標(biāo)2.4.1.1一般狀況：包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等2.4.1.2血、尿、便常規(guī)檢查2.4.1.3肝、腎功能檢查2.4.1.4胸片、心電圖、腹部B超檢查（僅在試驗開始前檢查一次）2.4.2功效指標(biāo)2.4.2.1癥狀觀察胃痛、噯氣、反酸、腹脹、食欲不振、少食等臨床癥狀。體征觀察劍突下壓痛程度。按癥狀輕重統(tǒng)計積分（重癥3分，中度2分，輕度1分見表4。表4人體試食試驗癥狀輕重分級表癥狀輕（1分）中（2分）重（3分）輕微，持續(xù)時間短，不影響工作及休息疼痛時間較長，每日超4小時，尚能忍受，但對工作及休息有一定影響疼痛較重，持續(xù)難忍，需服藥才能減輕偶有發(fā)作經(jīng)常發(fā)作，引及兩脅不適頻繁發(fā)作，引及兩脅疼痛反酸偶有吐酸飲食不適即吐酸頻繁吐酸腹脹腹脹輕微，時作時止，在短時間內(nèi)可較甚腹脹較甚或發(fā)作頻繁，在較長時間內(nèi)不緩解，影響工作及休息腹脹難忍，持續(xù)時間長，需服藥才能減輕少食食欲較差，飯量減少飯量減少1/2－2/3無食欲，飯量減少2/3以上2.4.2.2胃鏡檢查與體征觀察劍突下壓痛程度檢查，根據(jù)疼痛程度分為輕（1分）、中（2分）、重（3分）。輕度：用力時才出現(xiàn)疼痛，壓痛輕微1分中度：用力即出現(xiàn)疼痛，但疼痛尚能忍受，壓痛明顯2分重癥：稍微用力即出現(xiàn)疼痛，疼痛不能忍受，壓痛劇烈3分隨機選擇試食組和對照組各15例受試者進行胃鏡檢查，比較試食試驗前后的改變。2.5數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定統(tǒng)計癥狀和體征積分值。試驗數(shù)據(jù)為計量資料，可用t檢驗進行分析。凡自身對