激發(fā)光譜與熒光光譜課件

熒光光度計環(huán)境科學與工程研究中心掌握分子熒光產生的過程及其影響因素熟悉熒光光度計的基本構件及操作程序了解熒光分析法的特點與應用【實驗目的】【實驗原理】一、分子熒光產生過程二、激發(fā)光譜與熒光光譜三、熒光的產生與分子結構關系四、影響熒光強度的因素1.分子能級與躍遷分子能級比原子能級復雜；在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級；基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…；一、分子熒光的產生過程2.電子激發(fā)態(tài)的多重度

電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低；大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)；

S0→T1禁阻躍遷；通過其他途徑進入(見能級圖)；進入的幾率??；

（S0：單線基態(tài)；S1：最低激發(fā)單線態(tài)；T1：最低激發(fā)三線態(tài)；A：

吸收；F：

熒光；P：磷光；v：振動馳豫；ISC：系間竄躍）

熒光、磷光光物理過程示意圖2.熒光光譜(或磷光光譜)固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長),

化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產生波長一定的熒光。

c.鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光的產生與分子結構的關系

1.分子產生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構。（2）具有一定的熒光量子產率。熒光量子產率（

）：熒光量子產率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關，如外轉換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射。2.化合物的結構與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產生；（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。（4）取代基效應：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。四、影響熒光強度的因素

影響熒光強度的外部因素1.溶劑的影響

除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.溫度的影響

熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾率增加。3.溶液pH

對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；4.內濾光作用和自吸現(xiàn)象內濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀。自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。5.溶液熒光的猝滅碰撞猝滅；氧的熄滅作用等。二、儀器結構流程熒光儀主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。

特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。

基本流程如圖：單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光波長的第二單色器；光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管。儀

器

光

路

圖同步掃描技術

根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種。

同步掃描技術可簡化光譜：譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率；如圖。

合適的可減少光譜重疊：

酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴重重疊，但<15nm的同步光譜只顯示酪氨酸特征光譜；>60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現(xiàn)分別測定?？色@得三維光譜圖的儀器可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖日立F-4500熒光儀熒光儀主機電源開關光源開關主機開關開機順序：開機前首先確認主機兩個開關：POWER/MAIN均處于關閉狀態(tài)（搬向O處）。先接通電源開關（POWER），5秒鐘后再按下氙燈點燈按鈕，當氙燈點燃后，再接通主開關（MAIN）。此時主開關上方綠色指示燈連續(xù)閃動三下。接通電腦及打印機電源，Win98開始建立，隨后F-4500操作界面自動進入。按界面提示選擇操作方式。關機順序：逆開機順序實施操作。當電源開關關閉后5秒鐘，再次接通10分鐘。（目的是僅讓風扇工作，使燈室散熱）最后關閉電源開關。日立F-4500熒光分光光度計簡易操作方法三、熒光分析方法與應用1.特點（1）靈敏度高比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；為什么？檢測下限：0.1～0.1g/cm-3相對靈敏度：0.05mol/L奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。（2）選擇性強既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸收光譜；（3）試樣量少

缺點：應用范圍小。2.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率

：

If=

Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-

lc)If=

I0(1-10-

lc)=

I0(1-e-2.3

lc)濃度很低時，將括號項近似處理后：If=2.3

I0

lc

=Kc（2）定量方法標準曲線法：

配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內，測定標樣和試樣的熒光強度，比較；3.熒光分析法的應用(1)無機化合物的分析

與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過