第八章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

第八章蛋白質(zhì)及氨基酸的測定編輯課件第一節(jié)概述

1.蛋白質(zhì)的元素組成〔Theelementsofprotein〕C：50-55%N：15-18%O：20-23%H：6-8%S：0-4%微量元素：P、Fe、Zn、Cu2、根本結(jié)構(gòu)單位：氨基酸3、蛋白質(zhì)的變性作用。編輯課件4、蛋白質(zhì)分析的重要性生物活性測定功能性質(zhì)調(diào)查營養(yǎng)標(biāo)簽總蛋白質(zhì)含量氨基酸組成蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值編輯課件5、蛋白質(zhì)的測定方法利用蛋白質(zhì)共性的方法利用特定氨基酸殘基法凱氏定氮法杜馬斯法福林酚法染色法編輯課件第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定一、蛋白質(zhì)的一般顯色反響電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。書中列舉了5種染料。二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反響〔一〕糖蛋白的顯色〔3種方法〕〔二〕脂蛋白的顯色〔2種方法〕編輯課件蛋白質(zhì)的測定方法

1凱氏定氮法〔1833年Kieldahl,常量法、微量法、自動定氮儀、半微量法、改進(jìn)凱氏定氮法〕2雙縮脲法3福林酚〔Lowry〕法4BicinchoninicAcid法5280nm紫外吸收法6染色法6.1陰離子染色法6.2布蘭德福特〔Bradford〕法7茚三酮法8比濁法9杜馬斯法〔燃燒法〕10紅外光譜法編輯課件一、凱氏定氮法〔常量〕

凱氏定氮法通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)含量的，由于樣品中常含有少量非蛋白質(zhì)含氮化合物，故此法的結(jié)果稱為粗蛋白含量。此外，雙縮脲法、染料結(jié)合法、酚試劑法等也常用于蛋白質(zhì)含量測定，由于方法簡便快速，故多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析。編輯課件原理樣品與濃硫酸〔氧化、脫水〕和催化劑〔硫酸銅〕一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中C,H氧化為CO2和H2O，有機(jī)N轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。加堿蒸餾時(shí)氨蒸出，用硼酸吸收后，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。編輯課件樣品制備消化中和、蒸餾滴定計(jì)算利用換算系數(shù)可以把氮的百分含量轉(zhuǎn)化成樣品粗蛋白質(zhì)含量。由于大局部蛋白質(zhì)含有16%的氮，所以其換算系數(shù)一般為6.25〔100/16=6.25〕。即：%N×6.25=%蛋白質(zhì)編輯課件

蛋白質(zhì)含量換算系數(shù)蛋或肉16.06.25牛奶15.76.38小麥18.765.33玉米17.705.56燕麥18.665.36大豆18.125.52大米19.345.17局部食品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)*編輯課件在消化反響中,為了加速蛋白質(zhì)的分解,縮短消化時(shí)間,常參加以下物質(zhì)1〕硫酸鉀:提高溶液的沸點(diǎn)，加快有機(jī)物分解。它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反響溫度，一般純硫酸的沸點(diǎn)在340℃左右,而添加硫酸鉀后,可使溫度提高至400℃以上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解,水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大,故沸點(diǎn)升高,其反響式如下：K2SO4+H2SO4→2KHSO42KHSO4→K2SO4+H2O↑+SO2編輯課件硫酸鉀參加量不能太大，否那么消化體系溫度過高，又會引起引起生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失。除硫酸鉀外，也可以參加硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。編輯課件〔2〕〔催化劑、指示劑〕硫酸銅起催化劑的作用。使用時(shí)常參加少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物氧化。指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，為清澈的藍(lán)綠色。指示蒸餾時(shí)的堿參加量是否足夠。除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、二氧化鈦等也可用的催化劑。編輯課件裝置編輯課件操作步驟消化準(zhǔn)確稱取固體樣品0.2～2g〔半固體樣品2～5g，液體樣品10～20ml〕→移入凱氏燒瓶→參加研細(xì)的硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20ml→搖勻→安裝消化裝置→于凱氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上→用電爐先以小火加熱至內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后→加大火力保持瓶內(nèi)液體微沸→至液體變藍(lán)綠色透明→繼續(xù)加熱微沸30分鐘→冷卻→定容。參加玻璃珠數(shù)粒以防蒸餾時(shí)暴沸。編輯課件蒸餾吸取5mL稀釋后的消化液→參加凱氏定氮儀內(nèi)→加10mL40%的氫氧化鈉→夾好漏斗夾→冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶內(nèi)預(yù)先裝入10ml4%硼酸溶液及混合指示劑)→加熱蒸餾至氨全部蒸出(由紅變藍(lán)后約10分鐘)→將冷凝管下端提離液面→用蒸餾水沖洗管口→繼續(xù)蒸餾1分鐘→加熱。編輯課件滴定將上述吸收液用0.1000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定至由藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色〔用甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑〕即為終點(diǎn)，同時(shí)作一試劑空白。編輯課件計(jì)算Page158公式編輯課件當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，參加30%過氧化氫2～3ml后再繼續(xù)消化。一般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾前假設(shè)加堿量缺乏，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。編輯課件硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40℃，否那么對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時(shí)可置于冷水浴中使用。蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源，否那么可能造成吸收液倒吸。編輯課件二、自動凱氏定氮法

將凱氏定氮裝置組裝成具有自動操作功能的一套裝置，原理與試劑同前。自動凱氏定氮儀：該裝置內(nèi)具有自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數(shù)字顯示裝置。消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外線加熱裝置組合而成的消化爐。編輯課件方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍靈敏準(zhǔn)確快速樣品用量少編輯課件三、微量凱氏定氮法原理及適用范圍同常量凱氏定氮法主要儀器：凱氏燒瓶〔100mL〕；微量凱氏定氮儀試劑：0.01000mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)液，其余同常量法Page160編輯課件蛋白質(zhì)的快速測定－雙縮脲法原理編輯課件方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍靈敏度較低，但操作簡單快速，在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品的測定。也可定量測定別離純化后的蛋白質(zhì)。編輯課件步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣。按蛋白質(zhì)含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg分別稱取混合均勻的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣于8支50ml納氏比色管中，然后各參加1ml四氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液〔①或②〕準(zhǔn)確稀釋至50ml，振搖10分鐘，靜置1小時(shí)，取上層清夜離心5分鐘，取離心別離后的透明液于比色皿中，在560nm波長下以蒸餾水作參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)并測定各溶液的吸光度A，以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。編輯課件樣品的測定：準(zhǔn)確稱取用品適量〔使得蛋白質(zhì)含量在40～110mg之間〕于50mL納氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步驟顯色后，在相同條件下測其吸光度A。用測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得蛋白質(zhì)mg數(shù)，進(jìn)而由此求得蛋白質(zhì)含量。編輯課件優(yōu)點(diǎn)：該方法比凱氏定氮法費(fèi)用低，速度快〔可在不到30min的時(shí)間內(nèi)完成〕，是分析蛋白質(zhì)最簡單的方法。比福林酚法、紫外吸收法或比濁法更少發(fā)生顏色偏離。幾乎沒有物質(zhì)干擾食品中蛋白質(zhì)的雙縮脲反響。不包含非多肽或非蛋白質(zhì)來源的氮。

編輯課件缺點(diǎn)：不如福林酚法靈敏，分析時(shí)至少需要2~4mg蛋白質(zhì)。如果存在膽汁素，那么吸光度會虛假增加。高濃度的胺鹽會干擾反響。不同蛋白質(zhì)其最終反響產(chǎn)物的顏色不同，例如明膠的雙縮脲反響產(chǎn)生紅紫色。如果有高濃度的脂〔用醚抽出〕或碳水化合物存在時(shí)，最終的反響溶液中可能會呈乳白色。此方法不是一個(gè)測量絕對值的方法，必須用濃度的蛋白質(zhì)〔如BSA〕或經(jīng)凱氏定氮法校正。編輯課件三、福林酚〔Lowry〕法原理蛋白質(zhì)與福林酚試劑反響，生成的藍(lán)色復(fù)合物。其中蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅離子反響形成雙縮脲反響，同時(shí)蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸和色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反響產(chǎn)生顏色，蛋白質(zhì)濃度與吸光度有較好的線性關(guān)系。編輯課件優(yōu)點(diǎn)因?yàn)楦Ａ址臃ê唵?、靈敏，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的生物化學(xué)中。然而，一般不用于測定未從食品混合物中純化的蛋白質(zhì)。

1．非常靈敏：A:較雙縮脲法靈敏50~100倍。B：較280nm紫外吸收法靈敏10~20倍。C：較茚三酮法靈敏好幾倍。D：與奈斯勒方法的靈敏度相似，但操作比其方便。2．測定結(jié)果較少受到樣品混濁度的影響。3．特異性要高于其他大多數(shù)方法。4．操作相對簡單，可以在1~1.5小時(shí)內(nèi)完成。

編輯課件缺點(diǎn)由于以下因素，福林酚法在某些應(yīng)用中需采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正。1．反響產(chǎn)生的顏色比雙縮脲法更易因蛋白質(zhì)的種類不同而發(fā)生變化。2．反響最終的顏色深淺并不直接與蛋白質(zhì)濃度成正比。3．蔗糖、脂類、磷酸鹽緩沖液、單糖和己胺會不同程度的干擾反響。4.高濃度的復(fù)原糖、硫酸銨和巰基化合物會干擾反響。編輯課件

四、紫外吸收法原理蛋白質(zhì)在UV280nm處有強(qiáng)烈吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有色氨酸和酪氨酸等芳香環(huán)殘基存在。由于存在于每一種食品的蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸的含量相當(dāng)恒定，所以可用比色法，即在280nm處比色測定蛋白質(zhì)的濃度。編輯課件適用范圍應(yīng)用簡便迅速，常用于生物化學(xué)研究工作，但由于許多非蛋白成分在紫外光區(qū)也有吸收作用，故還沒有廣泛應(yīng)用于食品體系。已經(jīng)用于測定牛奶和肉制品中蛋白質(zhì)的含量，但此法更適用于純化的蛋白質(zhì)體系、已經(jīng)抽提在堿液或變性劑〔如8M尿素〕中的蛋白質(zhì)測定。盡管蛋白質(zhì)中的肽鍵在190nm~220nm處的紫外吸收比在280nm更強(qiáng)，但在低紫外區(qū)域的測定更困難。編輯課件優(yōu)點(diǎn)快速，相對較靈敏〔在280nm處需要100ug或更多的蛋白質(zhì)，比雙縮脲法靈敏數(shù)倍〕。反響不受硫酸銨和其它緩沖液的干擾。不破壞樣品原有的性質(zhì)，在測定完蛋白質(zhì)含量后仍然可用于其它分析。廣泛用于層析柱別離后的蛋白質(zhì)測定。編輯課件缺點(diǎn)核酸在280nm處也有紫外吸收，純蛋白質(zhì)和純核酸的280nm/260nm紫外吸收比分別為1.75和0.5。如果知道280nm/260nm的值，就能校正核酸在280nm處的吸收值。不同種類食品的蛋白質(zhì)中，芳香族氨基酸的含量明顯不同。樣品溶液必須純潔無色。此法適用于相對純潔的體系。編輯課件BicinchoninicAcid(BCA)法原理Smith等人提出,在堿性條件下蛋白質(zhì)將銅離子復(fù)原成亞銅離子，亞銅離子-蛋白質(zhì)復(fù)合物和蘋果綠的BCA試劑反響形成淺紫色。反響形成顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。編輯課件BicinchoninicAcid(BCA)法方法1．蛋白質(zhì)溶液和含有BCA鈉鹽、Na2CO3、NaOH、CuSO4、pH11.25的BCA試劑一步混合。2．在37℃保溫30min或室溫下放置2hr,或60℃保溫30min。溫度的選擇取決于靈敏度的要求。較高的溫度導(dǎo)致較深的顏色反響。3．在562nm處比色讀數(shù)，并做空白比較。4.用BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線。編輯課件BicinchoninicAcid(BCA)法優(yōu)點(diǎn)BCA法已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的別離和純化中。此法對測定復(fù)雜食品體系中蛋白質(zhì)的適用性還未見報(bào)道。1．靈敏度與福林酚法相似。微量BCA法的靈敏度〔0.5~10ug〕稍高于福林酚法。2．一步混合的操作比福林酚法更簡單。3．所用試劑比福林酚法簡單。4．非離子型外表活性劑和緩沖液不對反響產(chǎn)生干擾。5．中等濃度的變性劑〔4M鹽酸胍或3M尿素〕不對反響產(chǎn)生干擾。編輯課件BicinchoninicAcid(BCA)法缺點(diǎn)：1．反響產(chǎn)生的顏色不穩(wěn)定，需要仔細(xì)地控制比色時(shí)間。2．復(fù)原糖會對此反響產(chǎn)生的干擾比對福林酚法更大。3．不同蛋白質(zhì)反響引起的顏色變化與福林酚法相似。4．比色的吸光度與蛋白質(zhì)濃度不成線性關(guān)系。編輯課件陰離子染色法原理含蛋白質(zhì)的樣品溶于緩沖液中和的過量陰離子染色劑混和，蛋白質(zhì)與染色劑形成不溶性復(fù)合物。反響平衡后，離心或過濾除去不溶性的復(fù)合物，再測定溶液中未結(jié)合的可溶性染色劑。編輯課件蛋白質(zhì)+過量染色劑蛋白質(zhì)-染色劑復(fù)合不溶物+未結(jié)合可溶性染色劑陰離子磺酸基染色劑，包括酸性十二號橙，橙G和酰黑10B，都可以和根本氨基酸殘基中的陽性基團(tuán)〔組氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和賴氨酸中的ε-氨基等〕，以及蛋白質(zhì)中游離的氨基酸終端基團(tuán)結(jié)合.未結(jié)合的染色劑與樣品中蛋白質(zhì)的含量成反比,可用分光光度計(jì)法測定。編輯課件方法1．樣品粉碎〔60目或更小〕，參加過量的染色劑。2．劇烈搖晃內(nèi)容物加速染色反響至平衡，過濾或離心去除不溶物。3．測定濾液中未結(jié)合染色劑溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算染色劑濃度。4．通過對未結(jié)合染色劑濃度與樣品的蛋白質(zhì)總氮含量作圖，得到一條線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5．與樣品同類的未知樣品的蛋白質(zhì)含量可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，或通過最小二乘法得到的回歸方程計(jì)算。編輯課件應(yīng)用陰離子染色法已經(jīng)用來測定牛奶及乳制品、小麥面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白質(zhì)。AOAC中共有二種染色方法〔使用酸性12號橙的方法967.12和使用酰胺黑10B的方法975.17〕分析牛奶中的蛋白質(zhì)。編輯課件優(yōu)點(diǎn)快速〔10min或更短〕，費(fèi)用廉價(jià)，結(jié)果相比照較準(zhǔn)確。因?yàn)槿旧珓┎慌c不可利用的賴氨酸結(jié)合，因此可用于測定谷物產(chǎn)品在加工過程可利用賴氨酸的含量，〔而賴氨酸是谷物產(chǎn)品中的限制氨基酸，所以可利用賴氨酸含量代表谷物產(chǎn)品的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值。〕不用腐蝕性試劑。不需測定非蛋白氮。編輯課件缺點(diǎn)靈敏度低，需要毫克級的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)因根本氨基酸不同而具有不同的染色容量，因此，對于待測食品需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。因一些非蛋白組份結(jié)合染色劑〔如淀粉〕或蛋白質(zhì)〔如鈣或磷〕而造成最后結(jié)果的偏差。鈣和重金屬離子引起的問題可用含有草酸的緩沖試劑來解決。編輯課件考馬斯亮蘭染料比色法原理

當(dāng)考馬斯亮蘭G-250與蛋白質(zhì)相結(jié)合時(shí)，染色劑會從紅色變成藍(lán)色，其最大吸收波長從465nm變化至620nm，在620nm處的吸光度與樣品中蛋白質(zhì)的濃度成正比。

編輯課件方法將考馬斯亮蘭G-250溶解于95%酒精中，并用85%磷酸酸化。含有蛋白質(zhì)〔1~100ug/ml〕的樣品和標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液分別與Bradford試劑混合。在595nm處讀取吸光度并扣空白。樣品中的蛋白質(zhì)濃度可通過BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。編輯課件應(yīng)用已經(jīng)成功用于測定麥芽汁、啤酒產(chǎn)品和馬鈴薯塊莖中的蛋白質(zhì)含量。此方法可改善測定微量蛋白質(zhì)的結(jié)果。該法快速、靈敏，且比福林酚法較少受其他因素干擾，已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化過程中的含量測定。

編輯課件優(yōu)點(diǎn)快速，反響可在2min內(nèi)完成。重現(xiàn)性好。靈敏度高。不受陽離子如K+、Na+和Mg+等的干擾。不受硫酸銨干擾。不受多酚和碳水化合物干擾，如蔗糖等。可測定分子量大約等于或高于4000道爾頓的蛋白質(zhì)。編輯課件缺點(diǎn)受非離子和離子型去垢劑的干擾，如三硝基甲苯和十二烷基硫酸鈉。而由于少量的〔0.1%〕去垢劑的存在而導(dǎo)致的結(jié)果偏差可用適當(dāng)?shù)目刂苼硇Ｕ５鞍踪|(zhì)-染色劑的復(fù)合物可與石英比色皿結(jié)合，分析人員必須使用玻璃比色皿。反響顏色隨不同種類的蛋白質(zhì)而變化，因此，必須仔細(xì)地選擇作為標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)。編輯課件比濁法原理低濃度〔3~10%〕的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白質(zhì)沉淀形成蛋白質(zhì)顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過程中的衰減而確定，輻射光傳送過程中的衰減是由于蛋白質(zhì)顆粒的散射造成的，輻射光衰減的程度與溶液中的蛋白質(zhì)濃度成正比。編輯課件比濁法方法測定小麥蛋白質(zhì)的常規(guī)方法為磺基水楊酸法，具體方法如下所述：1．小麥面粉用0.05N氫氧化鈉溶液萃取。2．溶于堿液的蛋白質(zhì)從不溶性原料中離心別離。3．磺基水楊酸和蛋白質(zhì)溶液混合。4．在540nm處測定其濁度，并扣去空白。5．蛋白質(zhì)的含量可根據(jù)經(jīng)凱氏定氮法校正過的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。編輯課件比濁法應(yīng)用

比濁法已經(jīng)用于測定小麥面粉和玉米的蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn)：1．快速，可在15min內(nèi)完成。2．測定結(jié)果不包括除了核酸外的非蛋白氮。缺點(diǎn)：1．不同的蛋白質(zhì)沉淀的速率不同。2．濁度隨酸試劑濃度的不同而變化。3.核酸也能被酸試劑沉淀。

編輯課件杜馬斯法〔燃燒法〕原理樣品在高溫下〔700~800℃〕燃燒，釋放的氮?dú)庥蓭釋?dǎo)檢測器〔TCD〕的氣相色譜儀測定。測得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含量。編輯課件杜馬斯法〔燃燒法〕方法樣品〔大約100~500mg〕稱量后置于樣品盒中，放入具有自動裝置的燃燒反響器中，釋放的氮?dú)庥蓛?nèi)置的氣相色譜儀測定。編輯課件杜馬斯法〔燃燒法〕應(yīng)用燃燒法適用于所有種類的食品，AOAC方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品。優(yōu)點(diǎn)：1．燃燒法是凱氏定氮法的一個(gè)替代方法。2．不需要任何有害化合物。3．可在3min內(nèi)完成。4．最先進(jìn)的自動化儀器可在無人看管狀態(tài)下分析多達(dá)150個(gè)樣品。缺點(diǎn)：1．需要的儀器價(jià)格昂貴。2．非蛋白氮也包括在內(nèi)。編輯課件紅外光譜法原理紅外光譜法測定由食品或其他物質(zhì)中分子引起的輻射吸收〔近紅外、中紅外、遠(yuǎn)紅外區(qū)〕。食品中不同的功能基團(tuán)吸收不同頻率的輻射。對于蛋白質(zhì)和多肽，多肽鍵在中紅外波段〔6.47um〕和近紅外(NIR)波段(如3300~3500nm,2080~2220nm,1560~1670nm)的特征吸收可用于測定食品中的蛋白質(zhì)含量。針對所要測的成份，用紅外波長光輻射樣品，通過測定樣品反射或透射光的能量〔反比于能量的吸收〕可以預(yù)測其成份的濃度。編輯課件紅外光譜法應(yīng)用紅外牛奶分析儀采用中紅外光譜法測定牛奶蛋白質(zhì)含量，同時(shí)近紅外光譜儀也廣泛應(yīng)用于食品蛋白質(zhì)的分析中〔如谷物、谷類制品、肉類和乳制品中〕。這些儀器非常昂貴,且必須經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)試。但分析人員只需經(jīng)最低程度的培訓(xùn)就可以快速分析樣品(30sec~2min)。編輯課件氨基酸的測定方法編輯課件一、茚三酮比色法原理氨基酸〔酰氨鍵〕在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物〔除脯氨酸外均有此反響〕，可用吸光光度法測定。該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為570nm，故據(jù)可以測定樣品中氨基酸含量。編輯課件應(yīng)用常用來定性測定食品中蛋白質(zhì)和氨基酸的存在。茚三酮法還沒有廣泛應(yīng)用于食品中蛋白質(zhì)的定量，然而可用來測定食品加工中多肽鍵的水解和氨基酸的定量。比較快速，但準(zhǔn)確性較低，反響生成的顏色隨不同的氨基酸化合物而變化。標(biāo)準(zhǔn)曲線必須針對每一個(gè)具體情況而準(zhǔn)備。編輯課件二、甲醛滴定法原理氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)參加甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來滴定-COOH基，并用間接的方法測定氨基酸總量。編輯課件方法特點(diǎn)及應(yīng)用此法簡單易行、快速方便。在發(fā)酵工業(yè)中常用此法測定發(fā)酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，并以此作為控制發(fā)酵生產(chǎn)的指標(biāo)之一。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時(shí)也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中假設(shè)有銨存在也可與甲醛反響，往往使結(jié)果偏高。編輯課件操作方法吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加水60ml，開動磁力攪拌器，用0.05mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液ml數(shù)〔V10〕，供計(jì)算總含量。參加10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積〔V11〕。編輯課件同時(shí)取80ml蒸餾水置于另一200ml潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至PH8.2，〔此時(shí)不計(jì)堿消耗量〕，再參加10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，作為試劑空白試驗(yàn)。編輯課件結(jié)果計(jì)算氨基酸態(tài)氮〔%〕=式中：V1〔V11-V10〕——樣品稀釋液在參加甲醛后滴定至終點(diǎn)〔PH9.2〕所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；V2——空白試驗(yàn)參加甲醛后滴定至終點(diǎn)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/l；m——測定用樣品溶液相當(dāng)于樣品的質(zhì)量.g；0.014——氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol。編輯課件說明及本卷須知也可用雙指示劑法指示終點(diǎn)。此法準(zhǔn)確快速，適用于測定食品中游離氨基酸。固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測定。假設(shè)樣品顏色較深或渾濁需用電位滴定法進(jìn)行測定。編輯課件氨基酸的別離及測定薄層色譜法氨基酸自動分析儀法氣相色鐠法液相色譜法編輯課件薄層色譜法原理取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過屢次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分那么有不同的Rf值，因而各種氨基酸可到達(dá)彼此別離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行比照，即可鑒別樣品中所含氨基酸的種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可大致確定其含量。編輯課件氨基酸自動分析儀法氨基酸的組分分析，現(xiàn)代廣泛的采用離子交換法，并由自動化的儀器來完成。原理：利用各種氨基酸的酸堿性、極性和分子量大小不同等性質(zhì)，使用陽離子交換樹脂在色譜柱上進(jìn)行別離。當(dāng)樣液參加色譜柱頂端后，采用不同的peyaH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來，即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸，其次是非極性的芳香性氨基酸，最后是堿性氨基酸；分子量小的比分子量大的先被洗脫下來，洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯色，從而定量各種氨基酸。定量測定的依據(jù)：氨基酸和茚三酮反響生成藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸那么生成黃棕色化合物，故需在另外波長處定量測定。編輯課件氨基酸分析儀有兩種，一種是低速型，使用300～400目的離子交換樹脂；另一種是高速型，使用直徑4～6um的樹脂。不管哪一種，在分析組成蛋白質(zhì)的各種氨基酸時(shí)，都用檸檬酸緩沖液；完全別離和定量40～46種游離氨基酸時(shí)，那么使用檸檬酸鋰緩沖液。但分析后者時(shí)，由于所用緩沖液種類多，柱溫也要變?yōu)槿齻€(gè)梯度，因此一般不能用低速型。編輯課件氣相色譜法原理將本身沒有揮發(fā)性的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于氣相色鐠分析的衍生物——三氟?；□ァＫㄓ谜〈嫉孽セ嫌萌宜狒睺FFAA〕的?；瘍筛鞑襟E。將?；玫陌被嵫苌镞M(jìn)行氣相色鐠分析。編輯課件液相色譜法原理蛋白質(zhì)樣品經(jīng)酸或堿水解后再用丹磺酰氯進(jìn)行衍生化作用而溶解于流動相溶液中，采用C8反相柱的高壓液相色鐠儀別離并用熒光檢測器進(jìn)行測定，即可測定出各種氨基酸的含量。編輯課件方法的比較樣品的比較原理靈敏性速度編輯課件1．樣品的比較：采用凱氏定氮法和紅外光譜法那么樣品幾乎不需要多加處理，20目或更小的顆粒一般都可以滿足這些測定方法的要求，一些更新型的NIR儀能夠直接測定不經(jīng)磨碎或其他方法處理的完整的谷物，以及其他粗糙的顆粒產(chǎn)品。本章中介紹的其他方法那么要求原料必須是微小的顆粒，以便于從復(fù)雜的食品體系中抽提蛋白質(zhì)。編輯課件2．原理：杜馬斯法和凱氏定氮法直接測定食品中有機(jī)氮元素的總量。其他方法測定蛋白質(zhì)的各種性質(zhì)，例如，雙縮脲測定多肽鍵，福林酚法測定多肽鍵、酪氨酸和色氨酸，紅外光譜法利用樣品特別是多肽鍵經(jīng)紅外波長的光輻射時(shí)的能量吸收直接測定蛋白質(zhì)含量。編輯課件3．靈敏性：凱氏定氮法、杜馬斯法、雙縮脲法和陰離子染色法的靈敏度低于紫外測定法、福林酚法、BCA法或Bradford法。編輯課件4．速度：在儀器經(jīng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)試后，紅外光譜法可能是上述討論過的最為快速的方法。在涉及到比色測定的方法中，在和顯色試劑混合前，必須把蛋白質(zhì)從干擾實(shí)驗(yàn)的不溶性物質(zhì)中別離出來，或者在混和后從顯色的蛋白質(zhì)-試劑復(fù)合物中除去不溶性物質(zhì)，但是比色法的測定速度還是快于凱氏定氮法。編輯課件特殊的本卷須知1．針對具體的應(yīng)用、靈敏度、精確度、重現(xiàn)性以及食品的物化性質(zhì)來考慮選擇適用的測定方法。2．食品加工方法，如加熱可能會減弱分析時(shí)蛋白質(zhì)萃取的能力，從而在涉及萃取的步驟時(shí)會導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的測定偏低。3.除了凱氏定氮法和紫外測定法，其他所有方法對純化蛋白質(zhì)的測定都需要使用標(biāo)準(zhǔn)或參比蛋白質(zhì)，樣品中的蛋白質(zhì)必須與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)編輯課件特殊的本卷須知4.非蛋白氮存在于所有食品中。要測定蛋白氮，樣品通常先要在堿性條件下萃取蛋白質(zhì)，然后用三氯醋酸或磺基水楊酸沉淀。酸的使用濃度影響沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量隨所用試劑的種類和濃度而變化。加熱能夠幫助酸、乙醇或其他有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)。除了酸沉淀法用于非蛋白質(zhì)的測定外，其他較少數(shù)方法如透析、超濾和柱色譜法也能從含少量非蛋白組分的物質(zhì)中別離得到蛋白質(zhì)。編輯課件特殊的本卷須知5.在測定食品蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值如蛋白質(zhì)消化率和蛋白質(zhì)成效比〔PER〕時(shí)，凱氏定氮法采用6.25的換算系數(shù)來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。如果相當(dāng)數(shù)量的非蛋白氮存在于食品中,測得的PER值就可能會偏低。如果食物樣品中的非蛋白氮含量較高〔特別是如果非蛋白氮不含許多氨基酸或者小肽〕，所得到的PER值可能會低于含有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成份，但非蛋白氮含量較低的樣品的PER值。編輯課件總結(jié)

本章介紹了基于蛋白質(zhì)和氨基酸的特性來測定蛋白質(zhì)的方法，其中杜馬斯法和凱氏定氮法測定氮含量，雙縮脲法和福林酚法利用銅-肽鍵的反響來分析，紫外280nm比色法、染色法、茚三酮法和福林酚法涉及到了氨基酸性質(zhì)。BCA法利用蛋白質(zhì)在堿性溶液中的復(fù)原性，紅外光譜法那么基于多肽對紅外波長光輻射的吸收性質(zhì)。不同方法的分析速度和靈敏度各不相同。不同食品體系的復(fù)雜性導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)分析方法都會有一些問題。通常都要使用經(jīng)選擇的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)〔如凱氏定氮〕方法校正。編輯課件第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定關(guān)于氮-蛋白質(zhì)換算等數(shù)

6.25=6.25=6.38=5.95編輯課件一、 凱氏定氮法常量凱氏定氮法1.原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。編輯課件整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定①消化2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)

2SO4+6CO2+12SO2+16H2O<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)<2>加硫酸銅作為催化劑、消化終點(diǎn)指示劑<3>加氧化劑加速有機(jī)物氧化速度編輯課件編輯課件②蒸餾NH4++OH-==NH3+H2O編輯課件影響氨化完全和速度的因素〔1〕K氏燒瓶和取樣量〔2〕分解劑1g樣品

K2SO4：

H2SO4=7g:12ml還有一種比例：

K2SO4：H2SO4=10g:20ml編輯課件<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定指示劑：混合指示劑〔甲基紅—溴甲基酚綠〕指示劑紅色綠色紅色〔酸〕〔堿〕〔酸〕③吸收與滴定反響式為：NH3+H3BO3==NH4++H2BO3-H2BO3-+H+==H3BO3<2>用過量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液。編輯課件現(xiàn)測定某一種食品的蛋白質(zhì)的含量，這種樣品含有大量的脂肪，樣品經(jīng)過處理后參加濃硫酸，為了使?jié)饬蛩崤c樣品充分結(jié)合，經(jīng)振搖后大火加熱進(jìn)行消化；消化2h后，估計(jì)消化完全，取出消化液參加少量NaOH進(jìn)行蒸餾，硼酸〔參加了指示劑甲基紅-溴甲基酚綠〕作為吸收液，最后對吸收液進(jìn)行滴定。討論大量的脂肪振搖大火加熱消化2h后，估計(jì)消化完全量NaOH少編輯課件計(jì)算X=X為樣品中蛋白質(zhì)的含量V1為樣品消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度MN為氮的摩爾質(zhì)量W為樣品的質(zhì)量K為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)編輯課件二、雙縮脲法NH2—CO—NH—CO—NH2

+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2△150~160℃雙縮脲雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物。紫色絡(luò)和物。編輯課件操作方法1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取10支干試管分成兩組，按下表平行操作012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml

0.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml)

2.04.06.08.010.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/ml4.04.04.04.04.04.0A540

取兩組測定的A540值的平均值，即A540為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。編輯課件2、樣品測定取4支試管分成兩組，按下表平行操作：

01樣品稀釋液/ml

0.5蒸餾水/ml1.00.5雙縮脲試劑/ml4.04.0A540

編輯課件取兩組測定的平均值計(jì)算：Y為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)得濃度〔mg/ml〕N為