第五章酶工程制藥

第五章酶工程制藥編輯課件提酶及電泳編輯課件酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用〔1〕1、在疾病診斷方面的應(yīng)用包括兩個(gè)方面：一是根據(jù)體內(nèi)原有酶活力的變化來診斷某些疾病，如利用谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力升高來診斷肝炎；二是用酶測定體液中某些物質(zhì)的量診斷疾病，如利用葡萄糖氧化酶測定血糖含量，診斷糖尿病等。2、在疾病治療方面的應(yīng)用種類很多，主要有：①蛋白酶，主要用于消化不良和食欲不振等；②溶菌酶，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等作用；③超氧化物歧化酶，具有抗輻射、抗氧化作用；④L-天冬酰胺酶，用于治療白血病；⑤尿激酶，具有溶血栓的作用；⑥其他相關(guān)酶制劑，如細(xì)胞色素c等。編輯課件酶在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用〔2〕3、在藥物生產(chǎn)方面的應(yīng)用酶在藥物制造方面的應(yīng)用是利用酶的催化作用將前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為藥物。這方面的應(yīng)用日益增多。如：利用青霉素?；钢圃彀牒铣汕嗝顾睾皖^孢霉素、利用β-酪氨酸酶制造多巴、利用核苷磷酸化酶生產(chǎn)阿糖腺苷、利用蛋白酶和羧肽酶將豬胰島素轉(zhuǎn)化為人胰島素等。4、在分析檢測方面的應(yīng)用用酶進(jìn)行物質(zhì)分析檢測的方法統(tǒng)稱為酶法檢測或酶法分析。酶法檢測是以酶的專一性為根底、以酶作用后物質(zhì)的變化為依據(jù)來進(jìn)行的。根據(jù)酶反響的不同，酶法檢測可以分成單酶反響、多酶偶聯(lián)反響和酶標(biāo)免疫反響等。編輯課件第一節(jié)概述一、酶的特性酶(enzyme)是由活細(xì)胞產(chǎn)生的具有特殊催化功能的一類蛋白質(zhì)。也稱為生物催化劑。酶促反響：指反響物〔或稱底物〕在酶的催化作用下所進(jìn)行的反響。編輯課件酶的一般特性：參與化學(xué)反響過程時(shí)能加快反響速度；降低反響的活化能；不改變反響性質(zhì)即不改變反響的平衡點(diǎn)；反響前后其數(shù)量和性質(zhì)不變。編輯課件酶單獨(dú)的特點(diǎn)：①催化效率高②專一性強(qiáng)③反響條件溫和④催化活性受到調(diào)節(jié)和控制編輯課件酶的分類：1961年國際生物化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué)委員會(huì)按酶所催化的反響類型將酶分成6大類：①氧化復(fù)原酶類；②轉(zhuǎn)移酶類；③水解酶類；④裂合酶類；⑤異構(gòu)酶類；⑥合成酶(或稱連接酶)類。編輯課件二、酶工程簡介酶工程〔Enzymeengineering〕是酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透結(jié)合、開展而形成的一門新的技術(shù)學(xué)科。它是從應(yīng)用的目的出發(fā)研究酶、應(yīng)用酶的特異性催化功能，并通過工程化將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成有用物質(zhì)的技術(shù)。編輯課件酶工程的歷史在20世紀(jì)20年代初就出現(xiàn)了酶工程，在當(dāng)時(shí)，主要是指自然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用。酶的固定化技術(shù)誕生：1953年，Grubhoger和Schleith首先將羧肽酶、淀粉糖化酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等，用重氮化聚氨基聚苯乙烯樹脂進(jìn)行固定，提出了酶的固定化技術(shù)。1969年，日本學(xué)者首先應(yīng)用固定化酶技術(shù)成功地拆分了DL-氨基酸。編輯課件1971年，第一屆國際酶工程會(huì)議提出的酶工程的內(nèi)容主要是：酶的生產(chǎn)、別離純化、酶的固定化、酶及固定化酶的反響器、酶與固定化酶的應(yīng)用等。隨著科學(xué)的開展和酶技術(shù)研究的深入，酶的應(yīng)用所涉及的面越來越廣，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域中應(yīng)用都有廣泛的應(yīng)用。編輯課件酶工程的內(nèi)容①酶的別離、提純、大批量生產(chǎn)及新酶和酶的應(yīng)用開發(fā)；②酶和細(xì)胞的固定化及酶反響器的研究(包括酶傳感器、反響檢測等)；③酶生產(chǎn)中基因工程技術(shù)的應(yīng)用及遺傳修飾酶(突變酶)的研究；④酶的分子改造與化學(xué)修飾、以及酶的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的研究；⑤有機(jī)相中酶反響的研究；⑥酶的抑制劑、激活劑的開發(fā)及應(yīng)用研究；⑦抗體酶、核酸酶的研究；⑧模擬酶、合成酶及酶分子的人工設(shè)計(jì)、合成的研究。編輯課件第二節(jié)酶的來源和生產(chǎn)一、酶的來源早期酶的生產(chǎn)是以動(dòng)物、植物為主要原料，如從豬頜下腺中提取激肽釋放酶，從菠蘿中制取菠蘿蛋白酶，從木瓜汁液中制取木瓜蛋白酶等。但隨著酶制劑應(yīng)用范圍的日益擴(kuò)大，單純依賴動(dòng)植物來源的酶已不能滿足要求，而且動(dòng)、植物原料的生長周期長、來源有限、受地理、氣候、季節(jié)等因素的影響，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。動(dòng)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)；微生物編輯課件利用微生物生產(chǎn)酶制劑，突出的優(yōu)點(diǎn)是：①微生物種類繁多，但凡動(dòng)植物體內(nèi)存在的酶，幾乎都可以從微生物中得到。②微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便，并可以通過控制培養(yǎng)條件來提高酶的產(chǎn)量。③微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，通過各種遺傳變異的手段，能培育出高產(chǎn)菌株。編輯課件二、酶的生產(chǎn)菌〔1〕⒈對菌種的要求作為酶制劑的生產(chǎn)菌應(yīng)有特定的要求：①產(chǎn)酶量高，酶的性質(zhì)應(yīng)符合要求，而且是產(chǎn)生胞外酶的菌；②不是致病菌、系統(tǒng)發(fā)育上與病源體無關(guān)、不產(chǎn)生毒素；③穩(wěn)定性好，不易變異、退化、感染噬菌體；④能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短，易于培養(yǎng)。編輯課件二、酶的生產(chǎn)菌〔2〕⒉生產(chǎn)菌的來源生產(chǎn)菌種可以從菌種保藏機(jī)構(gòu)和有關(guān)研究部門獲得，但大量的工作應(yīng)該是從自然界中別離篩選。自然界是產(chǎn)酶菌種的主要來源，土壤、深海、溫泉、火山、森林等都是菌種采集地。篩選產(chǎn)酶菌的方法與其他發(fā)酵微生物的篩選方法根本一致?；蚬こ滩粩喔倪M(jìn)生產(chǎn)菌獲得菌種編輯課件二、酶的生產(chǎn)菌〔3〕⒊目前常用的產(chǎn)酶微生物大腸桿菌(E．coli)是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶菌，一般分泌胞內(nèi)酶，需經(jīng)細(xì)胞破碎才能別離得到。用于生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天門冬氨酸酶、青霉素?；?、β—半乳糖苷酶等。編輯課件二、酶的生產(chǎn)菌〔4〕枯草桿菌：主要用于發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶、β—葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酯酶等。啤酒酵母：主要用于釀造啤酒、酒精、飲料和面包，生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶等。曲霉(黑曲霉和黃曲霉)：用于生產(chǎn)糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、氨基?；负椭久傅取Ｇ嗝咕?、木霉菌、根霉菌、鏈霉菌等用于生產(chǎn)相應(yīng)的酶。編輯課件第三節(jié)酶和細(xì)胞固定化酶反響幾乎都是在水溶液中進(jìn)行的，居于均相反響。均相酶反響系統(tǒng)中的游離酶只能一次性使用，不僅造成酶的浪費(fèi)，而且會(huì)增加產(chǎn)品別離的難度和費(fèi)用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量，另外溶液酶很不穩(wěn)定，容易變性和失活。如果能將酶制劑制成既能保持其原有的催化活性、性能穩(wěn)定、又不隨水流動(dòng)的固定化狀態(tài)，即固定化酶(Immobilizedenzyme)，可大大提高酶的利用率。編輯課件一、固定化酶的制備⒈固定化酶的定義：

固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶。是指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。酶的固定化：通過載體等將酶限制或固定于特定的空間位置，使酶變成不易隨水流失即運(yùn)動(dòng)受到限制，又能發(fā)揮催化作用的酶制劑的過程。編輯課件⒉固定化酶的特點(diǎn)酶類可大致分為天然酶和修飾酶，固定化酶屬于修飾酶。固定化酶與天然酶相比，有以下優(yōu)點(diǎn)：①可屢次使用，活性不變②反響后，酶與底物和產(chǎn)物易分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。③反響條件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反響。編輯課件⒊酶和細(xì)胞固定化方法

酶和細(xì)胞固定化方法

載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法

網(wǎng)格型微囊型物理吸附法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法熱處理〔細(xì)胞〕編輯課件⑴載體結(jié)合法載體結(jié)合法將酶結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法。①物理吸附法：用物理方法將酶吸附于不溶性載體上的一種固定化方法。無機(jī)栽體：活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化鋁、硅膠、膨潤土等；天然高分子載體：淀粉、谷蛋白等；大孔型合成樹脂、陶瓷等載體近來也已被應(yīng)用；此外具有疏水基的載體(丁基或己基-葡聚糖凝膠)，以及以單寧作為配基的纖維素衍生物等可作為載體。編輯課件物理吸附法的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)理吸附法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，可選用不同電荷和不同形狀的載體，固定化與純化可同時(shí)實(shí)現(xiàn)。酶失活后載體不變。缺點(diǎn)：最適吸附酶量無規(guī)律可循，不同載體和不同酶其吸附條件不同，吸附量與酶活力不一定呈平行關(guān)系，同時(shí)酶與載體之間結(jié)合力不強(qiáng)，易于脫落，導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。編輯課件②離子結(jié)合法：

離子結(jié)合法是酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體上的固定化方法。載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂，如DEAE-纖維素、AmberliteCG-50、XE-97、IR-45和Dowex-50等。編輯課件離子結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。缺點(diǎn)：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反響時(shí)，往往會(huì)發(fā)生酶從載體上脫落的現(xiàn)象。編輯課件③共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法是酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上的固定化方法，也就是將酶分子上非活性部位功能團(tuán)與載體外表反響基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的方法。目前研究最廣泛、內(nèi)容最豐富的固定化方法，其原理是酶分子上的功能團(tuán)，如氨基、羧基、羥基、咪唑基、巰基等和載體外表的反響基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，因而將酶固定在載體上。編輯課件共價(jià)結(jié)合法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，一般不會(huì)因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。缺點(diǎn)：與離子結(jié)合法和物理吸附法相比，反響條件苛刻，操作復(fù)雜，而且采用了比較強(qiáng)烈的反響條件，會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，破壞局部活性中心，因此往往不能得到比活高的固定化酶，甚至酶的底物專一性會(huì)發(fā)生變化。編輯課件⑵交聯(lián)法交聯(lián)法是用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物的細(xì)胞與細(xì)胞之間彼此連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而使酶固定化的技術(shù)。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯及己二酰亞胺二甲酯等。交聯(lián)法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的，所不同的是它可以不使用載體。編輯課件交聯(lián)法又可分為4種：交聯(lián)酶法、酶與輔助蛋白交聯(lián)法、吸附交聯(lián)法、載體交聯(lián)法。交聯(lián)酶法：向酶溶液中參加多功能試劑，在一定的條件下形成固定化酶的技術(shù)。反響速度與酶濃度、試劑濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度及反響時(shí)間有關(guān)。如0.2%木瓜蛋白酶和0.3%戊二醛在pH5.2~7.2，0℃，24h完成反響。酶與輔助蛋白交聯(lián)法：在酶溶液中參加輔助蛋白的交聯(lián)過程。輔助蛋白有：明膠、膠原、及動(dòng)物血清白蛋白等。編輯課件吸附交聯(lián)法：是吸附與交聯(lián)相結(jié)合的技術(shù)，其過程是先將酶吸附到載體上再與交聯(lián)劑反響的方法。所得的固定化酶稱為殼狀固定化酶。此法兼?zhèn)湮脚c交聯(lián)雙重優(yōu)點(diǎn)，即提高固定化酶機(jī)械強(qiáng)度又提高酶與載體結(jié)合能力，酶分布于載體外表與底物接觸良好。載體交聯(lián)法：同一多功能試劑分子局部化學(xué)集團(tuán)與載體偶聯(lián)而另一局部化學(xué)基團(tuán)與酶分子偶聯(lián)的方法。編輯課件交聯(lián)法的特點(diǎn)反響條件劇烈，酶活回收較低。由于酶的功能團(tuán)，如氨基、酚基、羧基、巰基等參與了反響，會(huì)引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致酶活性下降。改進(jìn)方法：在被交聯(lián)的酶溶液中添加一定量的輔助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的穩(wěn)定性。編輯課件最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它的二個(gè)醛基與酶分子的游離氨基反響形成schiff堿，彼此交聯(lián)，其方式如下：編輯課件⑶包埋法①網(wǎng)格型包埋法：將酶或細(xì)胞包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型；②微囊化包埋法：將酶或細(xì)胞包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。③纖維包埋法：將可形成纖維的高聚物溶于與水不混溶的有機(jī)溶劑中，再與酶溶液混合與乳化，然后將乳化液經(jīng)噴頭擠入促凝劑〔甲苯、石油醚〕中形成纖維，可將酶纖維裝成酶柱或織成酶布使用。編輯課件包埋法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：一般不需要酶蛋白的氨基酸殘基參與反響，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。缺點(diǎn)：化學(xué)聚合反響包埋酶容易失活，因此必須合理設(shè)計(jì)反響條件。適用范圍：小分子底物和產(chǎn)物的酶，不適合大分子底物和產(chǎn)物的酶。編輯課件酶和細(xì)胞固定化模式編輯課件⑷選擇性熱變性法此法專用于細(xì)胞固定化，是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下處理使細(xì)胞膜蛋白變性但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。編輯課件⒋酶和細(xì)胞的固定化載體對載體的要求:①固定化過程中不引起酶變性；②對酸堿有一定的耐受性；③有一定的機(jī)械強(qiáng)度；④有一定的親水性及良好的穩(wěn)定性；⑤有一定的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒均勻；⑥共價(jià)結(jié)合時(shí)具有可活化基團(tuán)；⑦有耐受酶和微生物細(xì)胞的能力；⑧廉價(jià)易得。編輯課件⑴吸附載體吸附法有物理吸附和離子吸附兩種：物理吸附所用的載體有無機(jī)物和有機(jī)物。編輯課件⑵包埋載體:目前，工業(yè)上應(yīng)用的包埋載體主要為卡拉膠、海藻膠等。⑶共價(jià)結(jié)合載體:

用共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶或細(xì)胞所用的載體有纖維素、SephadexA200、瓊脂、瓊脂糖、苯胺多孔玻璃等。編輯課件編輯課件⒌固定化酶制備技術(shù)⑴吸附法制備固定化酶技術(shù)離子交換吸附法是將解離狀態(tài)的酶溶液與離子交換劑混合后，洗去未吸附的酶和雜質(zhì)即得固定化酶。本方法中離子交換劑結(jié)合蛋白質(zhì)能力較強(qiáng)。

影響載體吸附的因素:溶液的pH、離子強(qiáng)度、溫度、蛋白質(zhì)濃度及載體的比外表積等。編輯課件⑵包埋法制備固定化酶技術(shù)凝膠包埋法是將酶或細(xì)胞限制于高聚物網(wǎng)格中的技術(shù)；微囊化法是將酶或細(xì)胞定位于不同構(gòu)型的膜外殼內(nèi)的技術(shù)。纖維包埋法編輯課件⑶交聯(lián)法制備固定化酶技術(shù)交聯(lián)酶法是向酶液中加人多功能試劑，在一定的條件下使酶分子內(nèi)或分子間彼此連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而形成固定化酶的技術(shù)。反響速度與酶的濃度、試劑的濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度和反響時(shí)間有關(guān)。交聯(lián)酶法酶—輔助蛋白交聯(lián)法吸附交聯(lián)法載體交聯(lián)法編輯課件⑷共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶技術(shù)共價(jià)結(jié)合法是通過酶分子的非活性基團(tuán)與載體外表的活潑基團(tuán)之間發(fā)生化學(xué)反響而形成共價(jià)鍵的連接法。共價(jià)結(jié)合法制備固定化酶的優(yōu)點(diǎn):酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好。缺點(diǎn):載體需要活化，固定化操作復(fù)雜，反響條件比較劇烈，酶容易失活和產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)。用于載體活化的方法有：日前用于載體活化的方法有?；?、芳基化、烷基化及氨甲?；?。編輯課件二、固定化細(xì)胞的制備⒈固定化細(xì)胞的定義將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。被限制或定位于特定空間位置的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。細(xì)胞固定化技術(shù)是酶固定化技術(shù)的開展，因此固定化細(xì)胞也稱為第二代固定化酶。固定化細(xì)胞主要是利用細(xì)胞內(nèi)酶和酶系，它的應(yīng)用比固定化酶更為普遍。已在醫(yī)藥、食品、化工、醫(yī)療診斷、農(nóng)業(yè)、分析、環(huán)保、能源開發(fā)及理論研究中廣泛應(yīng)用。編輯課件⒉固定化細(xì)胞的特點(diǎn)有細(xì)胞特性，生物催化劑功能和固相催化劑特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)：①無須進(jìn)行酶的別離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高③細(xì)胞內(nèi)酶比固定化酶穩(wěn)定性高④細(xì)胞內(nèi)酶的附因子可自主再生⑤細(xì)胞本身含多酶體系，可催化一系列的反響⑥抗污染能力強(qiáng)編輯課件⒊固定化細(xì)胞的制備技術(shù)固定化細(xì)胞的制備方法有載體結(jié)合法、包埋法、交聯(lián)法及無載體法等。⑴載體結(jié)合法是將細(xì)胞懸液直接與水不溶性的載體相結(jié)合的固定化方法。編輯課件

⑵包埋法將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)為包埋法。這是固定化細(xì)胞中應(yīng)用最多的方法。常用的載體有卡拉膠、聚乙烯醇、瓊脂、明膠及海藻膠等。

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⑶交聯(lián)法用多功能試劑對細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)的固定化方法。

⑷無載體法靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技術(shù)。編輯課件三、固定化方法與載體的選擇依據(jù)⒈固定化方法的選擇⑴固定化酶應(yīng)用的平安性盡管固定化生物催化劑比化學(xué)催化劑更為平安，但也需要按照藥物和食品領(lǐng)域的檢驗(yàn)標(biāo)推作出必要的檢查。⑵固定化酶在操作中的穩(wěn)定性在選擇固定化的方法時(shí)要求固定化酶在操作過程中十分穩(wěn)定，能長期反復(fù)使用，在經(jīng)濟(jì)上有極強(qiáng)的競爭力。⑶固定化的本錢固定化本錢包括酶、載體和試劑的費(fèi)用，也包括水、電、氣、設(shè)備及勞務(wù)投資。編輯課件⒉載體的選擇為了工業(yè)化應(yīng)用，最好選擇工業(yè)化生產(chǎn)中已大量應(yīng)用的廉價(jià)材料為載體，如聚乙烯醇、卡拉膠及海藻膠等。離子交換樹脂、金屬氧化物及不銹綱碎屑等，也都是有應(yīng)用前途的載體。載體的選擇還應(yīng)考慮底物的性質(zhì)等因素。編輯課件固定化方法及其特性的比較編輯課件四、固定化酶的形狀與性質(zhì)⒈固定化酶的形狀⑴顆粒狀固定化酶顆粒狀的固定化酶包括酶珠、酶塊、酶片和酶粉等。⑵纖維狀固定化酶某些材料，如三醋酸纖維素，用適當(dāng)?shù)娜軇┤芙夂笈c酶混合，再采用噴絲的方法就可制成酶纖維。編輯課件⑶膜狀固定化酶膜狀固定化酶也稱為酶膜，可以通過共價(jià)結(jié)合法將酶偶聯(lián)到濾膜上制備，也可以將酶和某些材料如火棉膠、硝酸纖維素、骨膠原和明膠等，用戊二醛交聯(lián)或其他方法處理后制成膜狀。⑷管狀固定化酶

管狀固定化酶稱為酶管，某些管狀載體如尼龍、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺等，經(jīng)活化后與酶偶聯(lián)即得固定化酶管。編輯課件⒉固定化酶的性質(zhì)天然酶經(jīng)過固定化后即成為固定化酶，可能會(huì)導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)和酶活力的變化。⑴酶活力的變化酶經(jīng)過固定化后活力大都下降，其原因主要是酶的活性中心的重要氨基酸與載體發(fā)生了結(jié)合，酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化或酶與底物結(jié)合時(shí)存在空間位阻效應(yīng)。編輯課件⑵酶穩(wěn)定性的變化固定化酶的穩(wěn)定性包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。蛋白酶經(jīng)過固定化后，限制了酶分子之間的相互作用，阻止了其自溶，穩(wěn)定性明顯增加。①操作穩(wěn)定性②貯藏穩(wěn)定性③熱穩(wěn)定性④對蛋白酶的穩(wěn)定性編輯課件①操作穩(wěn)定性操作穩(wěn)定性是能否實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵因素。操作穩(wěn)定性通常用半衰期表示，固定化酶的活力下降為初活力一半時(shí)所經(jīng)歷的連續(xù)操作時(shí)間稱為半衰期。固定化酶穩(wěn)定性的測定過程必須注明測定和處理?xiàng)l件，通常半哀期到達(dá)1個(gè)月以上時(shí)，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。編輯課件②貯藏穩(wěn)定性酶經(jīng)過固定化后最好立即投入使用，否那么活力會(huì)逐漸降低。假設(shè)需長期貯存，可在貯存液中添加底物、產(chǎn)物、抑制劑和防腐劑等，并于低溫下放置。③熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性高可以提高反響溫度和反響速度，提高效率。許多酶如乳酸脫氫酶和脲酶等，固定化后的熱穩(wěn)定性均比游離酶高。編輯課件④對蛋白酶的穩(wěn)定性大多數(shù)天然酶經(jīng)固定化后對蛋白酶的耐受力提高，可能由于空間位阻效應(yīng)使蛋白酶不能進(jìn)入固定化酶顆粒的內(nèi)部。如用尼龍、聚丙烯酰胺凝膠包埋的固定化天門冬酰胺酶對蛋白酶極為穩(wěn)定，而在同樣條件下的游離酶幾乎完全失活。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用固定化酶是極為有利的。編輯課件⑶酶學(xué)特性的變化①底物專一性：酶經(jīng)過固定化后，由于位阻效應(yīng)，對高分子底物的活性明顯下降。②最適pH：酶經(jīng)固定化后，其反響的最適pH可能發(fā)生改變，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質(zhì)有關(guān)。需要調(diào)整料液的pH使固定化酶到達(dá)最大的催化速度。編輯課件③最適溫度：酶經(jīng)過固定化后可能導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，大多數(shù)酶經(jīng)固定化后，最適溫度升高。④米氏常數(shù)〔Km)：Km值是表示酶和底物親和力大小的客觀指標(biāo)。天然酶經(jīng)固定化后，其Km值均發(fā)生變化，底物不同增加的幅度不同。⑤最大反響速度〔Vm)：大多數(shù)的天然酶經(jīng)固定化后，其Vm與天然酶相同或接近，但固定化的方法不同也有差異，如多孔玻璃共價(jià)結(jié)合的轉(zhuǎn)化酶，其Vm與天然酶相同，但用聚丙烯酰胺包埋的轉(zhuǎn)化酶，Vm比天然酶小10％。編輯課件五、固定化細(xì)胞的形狀與性質(zhì)⒈固定化細(xì)胞的形狀由于細(xì)胞的固定化技術(shù)是酶的固定化技術(shù)的延伸，許多方法都相同，因此許多固定化細(xì)胞的形狀與固定化酶的形狀相同，如珠狀、塊狀、片狀或纖維狀等編輯課件⒉固定化細(xì)胞的性質(zhì)細(xì)胞被固定化后，其中酶的性質(zhì)、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度和Km值的變化根本上與固定化酶相仿。細(xì)胞的固定化主要是利用胞內(nèi)酶，因此固定化的細(xì)胞主要用于催化小分子底物的反響，而不適于大分子底物。編輯課件六、評價(jià)固定化酶〔細(xì)胞〕的指標(biāo)1、固定化酶活力的測定方法酶活力:在單位時(shí)間內(nèi)單位體積中的底物減少量或產(chǎn)物增加量來表示。⒈分批測定法⒉連續(xù)測定法影響酶活力測定的因素較多，如測定環(huán)境、pH、溫度、離子強(qiáng)度、酶濃度、激活劑、振蕩和攪拌速度以及固定化酶的顆粒大小的變化等均影響酶活力的測定。編輯課件2、偶聯(lián)率及相對活力的測定方法影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活可用偶聯(lián)率或相對活力來表示。固定化酶的活力回收率是指固定化后固定化酶〔細(xì)胞〕所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶〔細(xì)胞〕總活力的百分?jǐn)?shù)。偶聯(lián)率=〔參加酶活力-上清液酶活力〕/參加蛋白活力×100%活力回收率=固定化酶總活力/參加酶的總活力×100%相對活力=固定化酶總活力/〔參加酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力〕×100%偶聯(lián)率=1時(shí)，表示反響控制好，固定化或擴(kuò)散限制引起的酶失活不明顯；偶聯(lián)率＜1時(shí)，擴(kuò)散限制對酶活力有影響；偶聯(lián)率＞1時(shí)，有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。編輯課件第四節(jié)固定化酶和固定化

細(xì)胞的反響器一、反響器的類型和特點(diǎn)⒈間歇式攪拌罐反響器用于游離酶反響后隨即放料。⒉連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反響器連續(xù)進(jìn)料、連續(xù)出料編輯課件⒊填充床反響器固定化酶填充于床層內(nèi)。反響器內(nèi)的流體的流動(dòng)形態(tài)為平推流形。底物以恒定流速通過反響床。⒋流化床反響器底物以足夠大的流速向上通過固定化酶床層，使固體顆粒處于流化狀態(tài)，到達(dá)混合的目的。編輯課件⒌循環(huán)反響器局部反響液流出和新參加底物流入液混合，在進(jìn)入反響床進(jìn)行循環(huán)。⒍連續(xù)流動(dòng)攪拌罐-超濾膜反響器這是由連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反響器和超濾裝置組合而成的反響器。⒎其它反響器編輯課件各種反響器的示意圖a、間歇式攪拌罐；b、連續(xù)流動(dòng)攪拌罐；c、b+超濾膜；d、填充床；e、循環(huán)；f、流化床編輯課件二、反響器的選擇依據(jù)⒈根據(jù)固定化酶的形狀⒉根據(jù)底物的物理性質(zhì)⒊根據(jù)反響的動(dòng)力學(xué)特性⒋根據(jù)外界環(huán)境對酶的穩(wěn)定性的影響⒌根據(jù)操作要求及反響器費(fèi)用編輯課件第五節(jié)酶工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用酶促反響的專一性強(qiáng),反響條件溫和。酶工程優(yōu)點(diǎn)：工藝簡單、效率高、生產(chǎn)本錢低、環(huán)境污染小、產(chǎn)品收率高、純度好。還可制造出化學(xué)法無法生產(chǎn)的產(chǎn)品。編輯課件1、固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-APA)技術(shù)路線

E.Coli斜面細(xì)胞固定化細(xì)胞青霉素G轉(zhuǎn)化液濾液6-APA粗品2、固定化酶法生產(chǎn)5‘-復(fù)合單核苷酸3、固定化酶法生產(chǎn)L-氨基酸培養(yǎng)固定轉(zhuǎn)化過濾抽提編輯課件青霉素?；皋D(zhuǎn)化流程圖編輯課件第六節(jié)酶工程研究的進(jìn)展一、酶的化學(xué)修飾二、酶的人工模擬三、有機(jī)相的酶反響四、基因工程酶的構(gòu)建編輯課件一、酶的化學(xué)修飾⒈酶的化學(xué)修飾的目的和意義提高酶的穩(wěn)定性、消除酶的抗原性、改變酶學(xué)性質(zhì)(最適pH、最適溫度、KM值、催化活性和專一性等)、擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍等研究越來越引起人們的重視。編輯課件⒉常用的化學(xué)修飾劑⑴對化學(xué)修飾劑的要求一般情況下，要求修飾劑具有較大的相對分子質(zhì)量，良好的生物相容性和水溶性，分子外表有較多的反響活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長。⑵常用的化學(xué)修飾劑①糖及糖的衍生物：主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚搪凝膠、聚乳糖等。②高分子多聚物：主要是聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇〔PVA〕、聚N—乙烯吡咯烷酮(PVP〕等。③生物大分子：常用的有肝素、血漿蛋白質(zhì)、聚氨基酸類等。④雙功能試劑：主要有戊二醛、二異硫氰酸、二胺類等。⑤其他：常用的修飾劑還有某些固定化酶載體、糖基化試劑、甲基化試劑、乙基化試劑及某些小分子有機(jī)物等。編輯課件⒊化學(xué)修飾的措施酶的化學(xué)修飾方法有很多，但根本原那么都是充分利用修飾劑所具有的各類化學(xué)基團(tuán)的特性，直接或經(jīng)過一定的活化過程與酶分子中的某些基團(tuán)或輔因子產(chǎn)生化學(xué)反響．對酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。⑴修飾酶的功能基團(tuán)⑵酶分子內(nèi)或分子間進(jìn)行交聯(lián)⑶修飾酶的輔因子⑷酶與高分子化合物相結(jié)合編輯課件⒋修飾酶的特性酶分子經(jīng)過化學(xué)修飾后，其特性在一定程度上發(fā)生改變，天然酶的一些缺乏之處可以得到改善。⑴熱穩(wěn)定性提高⑵抗各類失活因子能力提高⑶抗原性消除編輯課件⑷體內(nèi)半衰期延長⑸最適pH改變⑹酶學(xué)性質(zhì)變化Km，底物專一性⑺對組織分布能力改變?chǔ)?葡萄糖苷酶經(jīng)白蛋白修飾后，有利于肝細(xì)胞對其攝入，使更多的酶到達(dá)靶器官發(fā)揮作用。辣根過氧化物酶用聚賴氨酸修飾后，細(xì)胞的攝入量增加，對細(xì)胞的穿透能力能增加100倍。編輯課件

⒌酶的化學(xué)修飾的前景

化學(xué)修飾可以改變天然酶各種活性，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍?；瘜W(xué)修飾法是改造酶分子的有效方法，而且已有了一定的規(guī)律性和普遍性，具有廣泛的應(yīng)用前景。編輯課件二、酶的人工模擬根據(jù)酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物叫人工模擬酶(Enzymeofartificialimitation)，簡稱人工酶或模擬酶。1．模擬酶的分類〔1〕根據(jù)Kirby分類法，模擬酶可分為：①單純酶模型，即以化學(xué)方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。②機(jī)制酶模型，即通過對酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過度態(tài)穩(wěn)定化認(rèn)識(shí)，來指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)。③單純合成的酶樣化合物，即一些化學(xué)合成的具有催化活性的簡單分子。編輯課件〔2〕按照模擬酶的屬性分類按照模擬酶的屬性可分為：①主-客體酶模型，包括環(huán)糊精、冠醚、穴醚、雜環(huán)大環(huán)化合物和卟啉類等。②膠束模擬酶〔模擬水解酶的膠束酶模型、輔酶的膠束酶模型、金屬膠束酶模型〕。③肽酶。模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。④半合成酶。以天然酶為母體，用化學(xué)方法或基因工程方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，從而形成一種新的人工酶。⑤分子印跡酶。編輯課件主要的人工模擬酶介紹1．模擬酶—環(huán)糊精模擬酶工作研究較多的是環(huán)糊精(cyclodextrin)。它是一種優(yōu)良的模擬酶，可提供一個(gè)疏水的結(jié)合部位并能與一些無機(jī)和有機(jī)分子形成包接絡(luò)合物，以此影響和催化一些反響。編輯課件α-環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)編輯課件2．分子印跡分子印跡(molecularimprinting)是指制備對某一特定分子具有選擇性的聚合物的過程，該特定分子稱為印跡分子或模板。制備過程：①選定印跡分子和功能單體，讓它們之間發(fā)生互補(bǔ)作用，形成印跡—功能單體復(fù)合物；②用交聯(lián)劑在印跡分子—功能單體復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反響，形成交聯(lián)的聚合物；③從聚合物中除去印跡分子，得到對印跡分子具有選擇性的聚合物(以下圖)。編輯課件分子印跡示意圖編輯課件分子印跡的應(yīng)用范圍①分子印跡聚合物可作為裁剪別離物質(zhì)的材料，也可以別離大分子物質(zhì)(生物印跡)。②在酶