園藝植物栽培課件組織培養(yǎng)技術(shù)

脫分化細胞器官成熟細胞再分化胚狀體愈傷組織4愈傷組織的形成和植株再生

植物的再分化形式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細胞中，無須經(jīng)歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細胞中發(fā)生的。麻瘋樹插條產(chǎn)生愈傷組織由菊花葉片的愈傷組織分化出的小植株4.1.1愈傷組織形成的條件4.1

愈傷組織的形成離體:與植株分離，從其它組織與器官的抑制中解脫出來。合適的培養(yǎng)條件：大量研究表明，幾乎所有高等植物的各種器官，如根、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和形成層等，離體后在適當(dāng)條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。

愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當(dāng)然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置（反映了內(nèi)源激素水平）對愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。

外植體中已分化的活細胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個時期誘導(dǎo)期分裂期形成期4.1.2愈傷組織形成的過程誘導(dǎo)期：細胞分裂的準(zhǔn)備期☆誘導(dǎo)期是細胞準(zhǔn)備進行分裂的時期。接種的外植體材料的細胞通常都是成熟細胞，處于靜止?fàn)顟B(tài)，細胞大小沒有多大變化，外觀無明顯特征，但細胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等（1981）在研究離體培養(yǎng)的油橄欖莖段時發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大?！钫T導(dǎo)期的長短，因植物種類和外植體的生理狀況和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長到40h以上。分裂期：細胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時期分裂期是指細胞通過一分為二的分裂，不斷增生子細胞的過程。外植體的細胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細胞開始迅速分裂，分裂期主要表現(xiàn)如下：1.細胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細胞數(shù)可增加10倍。2.每個細胞平均鮮重下降。這是由于細胞鮮重的增加不如細胞數(shù)目的增加快的緣故。3.細胞體積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生組織細胞特性。4．細胞的核和核仁增大到最大。5.隨著細胞不斷分裂和組織生長，細胞的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細胞壁的合成極快。

總之，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時期。進入形成期后，細胞的平均大小相對穩(wěn)定，不再減少，細胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細胞的分裂，結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（meristemoid），稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長中心，或者進一步分化為維管組織結(jié)節(jié)——由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細胞作平周分裂成為形成層狀細胞，并形成了部分維管組織如管胞、纖維細胞等，但不形成維管系統(tǒng)。此期細胞分裂已基本停止，細胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細胞，因此有人又將此期稱為分化期。以上對愈傷組織形成過程的時期的劃分并不具有嚴(yán)格的意義，實際上，特別是分裂期和形成期往往可以出現(xiàn)在同一塊組織上。另外，有一些研究者曾反復(fù)指出的，雖然細胞脫分化的結(jié)果在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但這絕不意味著所有的細胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織。相反，脫分化后可直接分化為胚性細胞而形成體細胞胚。1

愈傷組織的生長

一般來說，愈傷組織的增殖生長只發(fā)生在不與瓊脂接觸的表面，而與瓊脂接觸的一面極少細胞增殖，只是細胞分化形成緊密的組織塊。4.1.3愈傷組織增殖的方式

外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀況而有很大差別，如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易，而莖葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。煙草愈傷組織在8周培養(yǎng)期間形態(tài)的變化A是與瓊脂培養(yǎng)基垂直方向的切面B是與瓊脂培養(yǎng)基平行方向的切面

一個多細胞外植體通常包含著各種不同類型的細胞，因此，由它所形成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。2愈傷組織的繼代培養(yǎng)

脫分化細胞不斷進行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個過程叫做繼代。

通過繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織無限期地保持在不分化的增殖狀態(tài)。然而，如果讓愈傷組織留在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)而不繼代，它們則不可避免地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。4.1.4愈傷組織的狀態(tài)及其調(diào)控

來源于不同植物或同一植物不同部位的愈傷組織,在顏色、結(jié)構(gòu)和生長習(xí)性上都可能存在差異，如顏色黃或白；外觀光滑或粗糙；結(jié)構(gòu)致密或松脆；遺傳生理功能有胚性或無胚性。1優(yōu)良愈傷組織的特性（優(yōu)良的愈傷組織通常應(yīng)具備以下4個特性中的2-3個特性）①旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。②高度的胚性或再分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植物。③容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。④經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，有便有可能對它們進行各種遺傳操作。2.愈傷組織的類型

主要根據(jù)對小麥、高粱和玉米等禾谷類植物體細胞愈傷組織的研究，王海波將愈傷組織分為3種主要類型：類型Ⅰ：保守分裂型，結(jié)構(gòu)致密，生長較慢，容易分化成苗類型Ⅱ：亢進分裂型，結(jié)構(gòu)松脆，生長旺盛，色澤鮮艷，增殖很快類型Ⅲ：衰敗型，結(jié)構(gòu)疏松，生長緩慢，色澤暗淡注意：1.在這3種類型之間還存在許多過渡類型。

2.類型Ⅰ和類型Ⅱ之間在一定程度上可以相互轉(zhuǎn)變，衰變型細胞在一定程度上也可以得到控制。

能夠促進這種轉(zhuǎn)變和控制的因子有幾種，其中最主要的是植物激素和氮源形態(tài)。

氮源除了供給培養(yǎng)物氮素營養(yǎng)外，氨態(tài)氮還具有促進細胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細胞分裂的作用。當(dāng)增加生長素濃度促進細胞分裂的效果不明顯時，增加培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮可起到明顯的促進分裂的作用；當(dāng)使用細胞分裂素或降低生長素對細胞分裂的抑制效果不顯著時，增加培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮或減少氨態(tài)氮，可起到顯著的抑制分裂的作用。致密愈傷組織（A）與疏松愈傷組織（B）細胞結(jié)構(gòu)的比較1.巨大細胞；2.管狀細胞；3.細胞間隙3愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控（1）選擇適當(dāng)?shù)幕蛐秃瓦m當(dāng)?shù)耐庵搀w

雖然幾乎所有高等植物的器官和組織都有可能產(chǎn)生愈傷組織，但同一物種內(nèi)不同基因型在離體培養(yǎng)中的反應(yīng)可能不同，同一植株不同部位的細胞在離體培養(yǎng)中的反應(yīng)也可能不同?；蛐筒牧系幕蛐蛯τ鷤M織的器官分化有決定性的影響。不同植物種的器官分化明顯不同，如煙草、胡蘿卜和矮牽年等植物容易誘導(dǎo)器官形成，而禾谷類、豆類、棉花等就比較困難。器官和部位

通常同一種植物的不同器官或組織所形成的愈傷組織，無論在生理上或形態(tài)上，其差別均不大。但是對有些植物而言，確有明顯差異。如油菜的花器官比葉、根易于分化成苗，水稻和小麥幼穗的苗分化頻率也比其他器官為高。年齡年齡較幼的外植體，不僅易于誘導(dǎo)形成愈傷組織，而且也容易誘導(dǎo)分化成植株。如油菜植株的自下而上的莖段的培養(yǎng)結(jié)果表明，下部的器官形成頻率低，愈向上部，苗的分化頻率越高。因此在組織培養(yǎng)中，要及時轉(zhuǎn)移已形成的愈傷組織進行分化培養(yǎng)，可大大提高苗的分化頻率。2.選擇正確的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的各種成分和物理性質(zhì)，都對器官發(fā)生產(chǎn)生一定影響，但起決定作用的仍然是植物生長調(diào)節(jié)劑，特別是生長素和細胞分裂素的配比。3.采用某些特殊的理化因素改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

加入一些常規(guī)培養(yǎng)基中不用的物質(zhì)和條件。4.2器官分化

愈傷組織分生細胞團可進行再分化，即進行形態(tài)建成，可再產(chǎn)生完整的植株。形態(tài)建成：外植體在適宜的培養(yǎng)條件下經(jīng)脫分化、再分化或直接發(fā)育成各種形態(tài)完整的植物體的過程。

在愈傷組織培養(yǎng)物中，細胞分裂常以無規(guī)則方式發(fā)生，并產(chǎn)生無明顯形態(tài)或極性的無序結(jié)構(gòu)組織塊，這時雖然在愈傷組織中發(fā)生了細胞分化，形成維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)，但并無器官發(fā)生。只有滿足某些條件，才可從愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生苗或根的分生組織，甚至胚狀體，進而使它發(fā)育成苗或完整植株。4.2.1器官發(fā)生概念：離體培養(yǎng)的組織、細胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。

在組織培養(yǎng)中，從外植體形成器官或無性系的形態(tài)發(fā)生，有下面兩種途徑：1．器官發(fā)生途徑通過莖芽的分化形成不定芽實現(xiàn)，指細胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的基本方式有3種：（1）先形成芽，再在芽伸長后，在其莖的基部長出根而形成小植株，多數(shù)植物屬這種情況；（2）先產(chǎn)生根，再從根的基部分化出芽而形成小植株。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對于單子葉植物；（3）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株小植株。顛茄懸浮培養(yǎng)細胞先分化根后形成芽的過程2．胚狀體方式（somaticembryo）

指由培養(yǎng)細胞誘導(dǎo)分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進而長成完整植株。（后一節(jié)中介紹）4.2.2影響莖芽分化的因素1化學(xué)因素主要是激素的種類和濃度。

生長素與細胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長根還是長芽。如為了促進芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。

高有利于根的形成和愈傷組織的形成

生長素/細胞分裂素適中有利于根芽的分化低有利于芽的形成

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細胞分裂素0.05—10mg／L。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfacetissuecultureintheAfricanVioletNosucrose(0%)Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.tissuecultureintheAfricanViolettissuecultureintheAfricanVioletSucrosereducedto1%Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredtissuecultureintheAfricanVioletSucroseincreasedto5%Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAP

Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletBAPreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletNoNAAPoorshootdevelopmentandnorootstissuecultureintheAfricanVioletNAAreducedto0.1mg.l-1

Poorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationtissuecultureintheAfricanVioletProfusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNAAincreasedto5.0mg.l-1tissuecultureintheAfricanVioletNosignofregenerationfromexplantatall.

NoMSsaltstissuecultureintheAfricanVioletSomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsreducedto0.47g.l-1

tissuecultureintheAfricanVioletShootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.MSsaltsincreasedto9.52g.l-1

2物理因素培養(yǎng)基形式：在固體培養(yǎng)基上，粉藍煙草×郎氏煙草的組織培養(yǎng)物以一種完全無結(jié)構(gòu)的狀態(tài)生長，但在成分相同的液體培養(yǎng)基中，則能形成茂密的莖芽。滲透壓：在一個雙單倍體馬鈴薯品種葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，只有在培養(yǎng)基里加入0.2-0.3mol/L甘露醇以使?jié)B透壓保持在200-400毫滲透壓摩爾時，才可能出現(xiàn)莖芽的分化。否則，愈傷組織不能變綠，而愈傷組織變綠是芽分化的前提。光強和光質(zhì)：高強度的光照對煙草莖芽的形成有抑制作用，天竺葵愈傷組織只有在光照和黑暗交替條件下才能分化莖芽，培養(yǎng)在連續(xù)光照下無器官分化。溫度：Skoog在5-33℃的范圍內(nèi)研究了溫度對煙草愈傷組織分化和生長的影響，發(fā)現(xiàn)直到33℃時愈傷組織的生長都隨溫度的上升而增加，但只有在18℃時最適合莖芽的分化，在33℃時不能形成莖芽。3其它因素培養(yǎng)材料的染色體組供提植株和外植體的生理狀態(tài)外植體的細胞發(fā)育狀態(tài)培養(yǎng)物的歷史和內(nèi)生激素水平。4.3體細胞胚胎發(fā)生4.3.1體細胞胚胎發(fā)生的方式有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：從培養(yǎng)的器官、組織、細胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段。（2）間接發(fā)生：外植體先愈傷化，然后由愈傷組織再分化成胚。A.由外植體外層細胞直接產(chǎn)生體細胞胚B.由外植體組織內(nèi)的細胞產(chǎn)生體細胞胚C.愈傷組織表層細胞分化為體細胞胚4.3.2影響體細胞胚胎發(fā)生的因素

1．生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（1）生長素類：

我們以離體培養(yǎng)條件下胡蘿卜的體細胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過程來進行分析：

在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程，每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。

愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基），通常所用的生長素是2，4-D，濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上，愈傷組織的若干部位分化形成分生細胞團，稱作“胚性細胞團”（CE)。在增殖培養(yǎng)基上反復(fù)繼代，胚性細胞團的數(shù)量不斷增加，但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而，如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)（成胚培養(yǎng)基）上，它們就能發(fā)育為成熟的胚?？磥?，在增殖培養(yǎng)基中生長素的存在，對于胚性細胞團后來在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。連續(xù)保存在無生長素培養(yǎng)基中的愈傷組織不能形成胚。在這個意義上，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細胞胚胎發(fā)生的“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”，而把每個胚性細胞團看成是一個無結(jié)構(gòu)的胚。野生胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中體細胞胚胎發(fā)生過程的模式圖（2）細胞分裂素類：

細胞分裂素對于體細胞胚胎發(fā)生的作用有相反的結(jié)論，既可促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生，這主要取決于植物的種類及其基因型。

一般而言，細胞分裂素對于促進體細胞胚的成熟有顯著作用，特別有利于子葉的發(fā)育。

另外有研究表明，不同的外植體對于細胞分裂素的需要可能具有不同的專一性，如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然BAP和激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用，但濃度為0.1μmol/L的玉米素卻能促進這個過程，而BA對胡蘿卜則是促進其愈傷組織的增殖，但不形成胚性愈傷組織。（3）赤霉素類：赤霉素類能抑制體細胞胚胎發(fā)生，但對于許多植物而言，赤霉素對于體細胞胚胎的成熟與萌發(fā)有促進作用。（4）脫落酸：抑制劑特別是ABA，在體細胞胚胎發(fā)生過程中的作用正逐漸被提示出來，ABA是一種天然產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)劑，當(dāng)把無抑制作用劑量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時，可以允許胚成熟過程進行。但是其抑制異常增殖，包括不定胚的啟動。另一方面抑制早熟萌發(fā)。2氮源

氮源的形態(tài)有還原態(tài)氮（NH4+）和氧化態(tài)氮（NO3－）兩種。

在以KNO3為唯一氮源（如White培養(yǎng)基）的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織，去掉生長素以后不能形成胚。然而是，若在培養(yǎng)基中加入少量NH4Cl即可明顯促進胚狀體的發(fā)育，上述結(jié)論是否說明，胚胎發(fā)生過程中還原態(tài)氮是必需的？我們可以對以下的實驗進行分析。Reinert及其合作者在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中(培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到以下結(jié)果：

[NH4+—氮]（M）[NO3——氮]（M）體胚發(fā)生數(shù)（個/2ml）

10401131±2190550.9±0.309511.3±4.1

從上表可以分析得出，盡管高濃度的氧化態(tài)氮同樣可以誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，但是其誘導(dǎo)率遠遠低于還原態(tài)氮和氧化態(tài)氮配合使用時的誘導(dǎo)率。

與KNO3不同，當(dāng)以NH4Cl為唯一氮源時，只要經(jīng)常調(diào)節(jié)pH值使其保持在5.4，胚胎發(fā)生率可與在NH4Cl和KNO3

最適配比的情況下相當(dāng)。當(dāng)只有NH4Cl時，培養(yǎng)基的pH值在4d之內(nèi)將有5.4降到4～3.5，這對胚胎發(fā)生是有抑制作用的。由此看來，還是搭配使用NH4＋和NO3－較為方便。3其它因子鉀離子的濃度:高濃度的鉀(20mmol／L)是胚胎發(fā)生所必須的。培養(yǎng)基中溶解氧的含量：應(yīng)低于一個臨界值（1.5mg／L），否則有利于生根，而不利于成胚。低溶解氧、高ATP活性炭:由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個不同發(fā)育階段：4.3.3體細胞胚胎的成熟過程1)外植體細胞脫分化。外植體發(fā)生細胞分裂，或進而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成細胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進而成為成熟的有機體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。在活體和離體條件下胚和莖芽的下端在解剖學(xué)上的差別A、D、F是胚B、C、E是莖芽胚狀體與不定芽的區(qū)別胚狀體在組織學(xué)上具備以下和不定芽不同的三個特征：①最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。③胚狀體的維管組織的分布是獨立的“v”字形，而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見而重要的方式，它較不定芽方式有更多的優(yōu)點：如胚狀體產(chǎn)生數(shù)量比不定芽多；胚狀體可制成人工種子，便于運輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。這些對組織培養(yǎng)應(yīng)用于育種是十分有利而重要的。合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差來源受精卵體細胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態(tài)固定，體積相對較小復(fù)雜，常有兩個以上的子葉體積相對較大變異率低高胚狀體與合子胚的比較體細胞胚常常能在原來的培養(yǎng)基上成熟和萌發(fā)。注意：在不經(jīng)冷處理種子就不能萌發(fā)的物種中，幼齡或成熟的胚可能必須先經(jīng)歷一段低溫之后才能正常的長成小植株。葡萄體細胞胚：低溫處理時期球形期～成熟期均可低溫處理溫度4℃2周花菱草體細胞胚低溫處理后才能萌發(fā)。柑橘屬植物草體細胞胚萌發(fā)期間，需要使用GA3以促進根和莖的發(fā)育。4.3.4長期培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力的喪失

有些愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物起初具有器官發(fā)生或胚胎發(fā)生的潛力，但經(jīng)過反復(fù)繼代保存之后，這種形態(tài)發(fā)生能力常常逐漸下降，有些甚至完全損失。為了解釋這種現(xiàn)象，現(xiàn)在有三種假說。1遺傳說該假說認(rèn)為，形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是由于在培養(yǎng)細胞中的核的特性發(fā)生了改變，即細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變。因此，由這種原因所造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。2生理說隨著不斷的培養(yǎng)繼代的進行，培養(yǎng)組織或細胞中的內(nèi)源激素平衡關(guān)系可能會發(fā)生改變或是由于對外源生長物質(zhì)的敏感性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致不能形態(tài)發(fā)生。在這種情況下，細胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理條件，應(yīng)該有可能使細胞的這種內(nèi)在潛力得到恢復(fù)。

如Fridborg和Eriksson(1975)發(fā)現(xiàn)，在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周之后，本來具有全能性的胡羅卜培養(yǎng)物完全停止了胚胎發(fā)生的過程，然而，向這種培養(yǎng)基中加入1％～4％的活性炭之后，喪失了的全能性又可以得以恢復(fù)。在這個培養(yǎng)系統(tǒng)中，胚性潛力的喪失可能是由于內(nèi)源生長素水平提高所致。3競爭說這個假說本質(zhì)上是前兩個假說的結(jié)合。按照這個假說的倡議者Smith和Street（1974）的看法，在胡蘿卜細胞長期連續(xù)繼代培養(yǎng)基間，有兩個過程可能與胚胎發(fā)生能力的下降以至最終的喪失有關(guān)。首先，細胞對于生長素（2，4-D）抑制全能性表達的作用變得比較敏感；其次，隨著時間的推移，由于培養(yǎng)細胞在細胞學(xué)上的不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了缺乏胚性潛力的新的細胞系，這些細胞學(xué)上的變化不一定是染色體數(shù)目的變化，而可能只是遺傳信息的小的突變、丟失或易位，實際上，Jones（1974）已經(jīng)證實，在胡蘿卜培養(yǎng)物中，細胞群體在成胚能力上的不穩(wěn)定性，可能是由用于建立該培養(yǎng)物的組織帶來的。

在復(fù)雜的多細胞外植體中，只有少數(shù)細胞能夠產(chǎn)生胚性細胞團，其余細胞都是無法表達其全能性的。即存在胚性的細胞類型和非胚性的細胞類型按照這種假說，如果非胚性的細胞類型在所用的培養(yǎng)基中具有生長上的選擇優(yōu)勢，在反復(fù)的繼代培養(yǎng)中，非胚性細胞的群體將會愛步增加，而胚性成分則逐漸減少。到了一定時期之后，在培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細胞，這時若想再恢復(fù)它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。然而，如果在培養(yǎng)物中存在少量胚性細胞，只是由于處在支配地位的非胚性細胞的抑制作用，這些胚性細胞的全能性無法表達，在這種情況下，通過改變培養(yǎng)基成分，使之有選擇地促進全能細胞的增殖，就應(yīng)當(dāng)有可能恢復(fù)該培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生潛力。4.5人工種子

人工種子（artificial

seed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，外面還被有特定物質(zhì)，在適宜條件下可以發(fā)芽成苗的植物幼體。

最早提出人工種子概念的是著名植物組織培養(yǎng)學(xué)家Murashige。他于1978年在加拿大召開的第四屆國際植物組織細胞培養(yǎng)會議上，首次提出利用植物組織培養(yǎng)中具有體細胞胚胎發(fā)生的特點，把胚狀體等組織包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有種子的機能并可直接播種于田間的設(shè)想。

按照他的設(shè)想，“人工種子’，最外面為一層有機的薄膜包裹，起防止水分散失及保護作用。其中含有培養(yǎng)物所需的營養(yǎng)成分和某些植物激素，以作為植物材料萌發(fā)時的刺激因素并提供能量，最里面就是被包埋的胚狀體或芽體等植物材料。通過這幾部分的組合，人為地創(chuàng)造出一種與天然種子相類似的人工合成種子（syntheticseed)，因此又叫人造種子（manmadeseed.）或無性種子（somaticseed)。

人工種子制作程序：1.高質(zhì)量體細胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)的建立2.體細胞胚胎發(fā)生的同步化控制3.人造種皮及人造胚乳研制與包埋4.人工種子的轉(zhuǎn)換（體細胞胚胎發(fā)育成據(jù)正常表現(xiàn)型的綠色植株的能力）5.1快速繁殖的操作程序階段Ⅰ:無菌培養(yǎng)物的建立;階段Ⅱ:莖芽的增殖;階段Ⅲ:離體形成的枝條的生根;階段Ⅳ:植株的移栽.5園藝植物快速繁殖技術(shù)和無病毒良種的繁育5.1.1無菌培養(yǎng)物的建立⑴外植體:最適用的是帶芽的莖段；莖尖;花序（花椰菜）其它組織、器官由植物種類和莖芽增殖方法而定①有些植物的特殊園藝性狀是由病毒造成的。如天竺葵品種“鱷魚”的透明葉脈，脫毒后消失。如天竺葵品種”鱷魚”的莖尖培養(yǎng)（上）和葉柄培養(yǎng)（下）注意：②通過形成不定芽進行快繁時，可用根段、莖段或珠心做外植體，由天然形成不定芽的能力決定③一般不通過愈傷組織進行快繁。⑵消毒：無菌外植體；溫室栽培；套袋；水培5.1.2

莖芽增殖的4種途徑

莖芽的離體增殖，除了蘭花所特有的原球莖途徑之外，有以下4個途徑：通過愈傷組織通過不定芽形成單芽莖段扦插增強腋芽生枝注意愈傷組織培養(yǎng)的缺點：（1）通過愈傷組織是進行植物繁殖最快的方法。①細胞在遺傳上的不穩(wěn)定性；②隨著繼代保存時間的增加，愈傷組織最初表現(xiàn)的植株再生能力可能逐漸下降，最后甚至完全消失。原理：無限增殖的可能性；細胞的全能型

Ⅰ愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)

小紅楓的組織培養(yǎng)

Ⅱ

愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的再生Ⅲ

生根Ⅳ

煉苗移栽（2）不定芽形成：根、鱗莖和葉都能形成不定芽。有350個物種，他們的葉都能形成不定芽。

在培養(yǎng)條件下，植物產(chǎn)生不定芽的頻率可以顯著提高。

如在秋海棠中，一般情況下芽只是沿著切口形成，但在含有BAP的培養(yǎng)基中，可在整個外植體的表面形成。

據(jù)Takayama等報道有一種秋海棠幼葉的7mm×7mm的切段在1年中產(chǎn)生了1014個植株?；ò咛祗每贩NMmeSalleron莖尖培養(yǎng)（上）和葉柄節(jié)段培養(yǎng)（下）不定芽培養(yǎng)會招致嵌合體裂解。（3）增強腋芽生枝能力原理：雛梢（4）單芽莖段扦插11.2.3影響莖芽增殖的因素⑴培養(yǎng)基無機鹽激素⑵光照和溫度：光強：光的作用只是滿足某些形態(tài)發(fā)育過程的需要，因此1000~5000lx的光強即已足夠。光周期嚴(yán)格的說也不重要。每天16h光照/8h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人滿意的效果。光照:溫度：25℃（1）試管內(nèi)生根：當(dāng)小枝條長1cm左右時，轉(zhuǎn)插到生根培養(yǎng)基中。

若莖芽增殖是在全強度MS培養(yǎng)基上進行的，生根培養(yǎng)基中鹽的濃度應(yīng)減少到1/2或1/4。5.1.4離體形成的枝條的生根

對于大多數(shù)物種來說，誘導(dǎo)生根需要有適當(dāng)?shù)纳L素，其中最常用的是NAA和IBA，濃度一般為0.1~10.0mg/L，但唐菖蒲、水仙和草莓等例外，它們的枝條很容易在無激素培養(yǎng)基上生根

也可將枝條下端浸在高濃度生長素溶液中若干時間（由幾秒到幾個小時）后，再插于無激素培養(yǎng)基中生根所需時間由10d到15d不等。根長5mm時移栽最為方便。（2）試管外生根：

先用激素處理，再插于基質(zhì)中，或先誘導(dǎo)出根原基，再扦插。

試管內(nèi)嫁接:有叫微體嫁接，即以試管苗的0.1~0.2mm長的莖尖為接穗，以在試管內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)出來的帶根無菌苗為砧木，在無菌條件下借助顯微鏡進行嫁接，之后繼續(xù)在試管內(nèi)培養(yǎng)，愈合后成為完整植株再移入土中。5.1.5無根苗的嫁接試管外嫁接：砧木可大可小。微嫁接技術(shù)在一些園藝植物上都有成功的報道,如柑桔、櫻桃、阿月渾果子樹、核果、蘋果、葡萄等果樹。5.1.6壯苗、煉苗和移栽

試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌和有完全營養(yǎng)供應(yīng)的特殊條件下，雖有葉綠素，但營異養(yǎng)生活，因此在形態(tài)解剖和生理特性上都有很大脆弱性，例如水分輸導(dǎo)系統(tǒng)存在障礙，葉面無角質(zhì)層和蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關(guān)閉功能等。

壯苗：

是移栽成活的首要條件，但培育壯苗的方法則因材料和情況的不同而異。如在培養(yǎng)基中加入一定數(shù)量的生長延緩劑如pp333、B9、CCC等，在許多植物上都可獲得壯苗。

煉苗：

開瓶煉苗降低瓶中濕度，增強光合強度，以便促使葉表面逐漸形成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機制，促使葉片逐漸啟動光合功能等。煉苗的具體措施：

則因苗的種類不同而異。

有些單子葉草本植物，只要壯苗，煉苗方法十分簡單：拿掉封口塑料膜，在培養(yǎng)基表面加上薄薄一層自來水，置于散射光下3~5d即可。

有些植物如霞草和刺槐試管苗極易萎蔫，封口膜在煉苗開始時只能半開，且要求煉苗環(huán)境有較高的空氣濕度。

喜光植物如棗和刺槐可在全光下煉苗，耐蔭植物如玉簪和白鶴芋等則須在較蔭蔽的地方煉苗，萱草、月季、福祿考、油茶等可在50%~70%的遮蔭網(wǎng)下煉苗。移栽：

移栽時先要輕輕地但徹底地洗掉沾在根上的瓊脂培養(yǎng)基，以免栽后發(fā)霉。

要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，如蛭石、河沙、珍珠巖、草炭和腐質(zhì)土等，栽苗之前須用0.3%~0.5%的高錳酸鉀消毒。

移栽后，最初10~15d要通過噴霧或罩上透明塑料以保持很高的濕度（90%~100%），在塑料罩上可打些小孔，以利氣體交換。在保濕數(shù)天之后，可把植株搬入溫室，但仍須遮蔭數(shù)日。移栽時把小植株上的一部分葉片剪掉也可能是有益的。移栽苗成活的必要條件是：

空氣濕度高，土壤通氣好，太陽勿直照。

移栽后完成上述各個步驟可能需花費4~6周的時間，此后即可讓這些植物在正常溫室或田間條件下生長。

熱處理是應(yīng)用最早的脫毒技術(shù)，具有操作簡單、見效快的特點。5.2培養(yǎng)脫毒苗的原理和方法5.2.1

通過熱處理消除病毒柑橘脫毒容器育苗

熱處理的理論依據(jù)是在高溫下病毒鈍化，復(fù)制明顯減弱或不再繁殖，而植物在高溫下生長較快，將植物在高溫下培養(yǎng)數(shù)周至數(shù)月，這個期間生長的嫩梢不帶病毒。

熱處理的關(guān)鍵問題是存活率和脫毒率，溫度和持續(xù)時間、熱處理方式等對存活率和脫毒率有影響。熱處理的方法：熱水處理：對休眠芽效果較好。熱空氣處理：對活躍生長的莖尖效果較好。

把旺盛生長的植株移入到一個熱療室中，在35~40℃下處理一定時間即可；處理時間的長短可由幾分鐘到數(shù)周不等。Baker和Kinnaman（1973）把麝香石竹植株在38℃下連續(xù)處理2個月，從而消除了莖尖內(nèi)的所有病毒。

馬鈴薯病毒X則要求在35℃下處理幾個月才能得到一些無病毒莖尖。

熱處理時，最初幾天空氣溫度應(yīng)逐步增高，直到達到要求的溫度為止。若鈍化病毒所要求的連續(xù)高溫處理會傷害寄主組織，則應(yīng)當(dāng)試驗高低溫交替的效果。熱處理后要立即把莖尖切下來嫁接到無病的砧木上。在熱處理期間應(yīng)當(dāng)保持適當(dāng)?shù)臐穸群凸庹铡?/p>

根據(jù)Baker和Kinnaman（1973）的建議，在對麝香石竹進行脫毒熱處理時，相對濕度必須保持在85%~95%之間，準(zhǔn)備接受熱處理的植株必須具有豐富的碳水化合物儲備。并非所有的病毒都對熱處理敏感，如在馬鈴薯中，此法只能消除卷葉病毒。一般來說對于等徑的和線狀的病毒和已知的類菌原體引起的病害，熱處理有效。在用熱療法消除病毒時應(yīng)注意：延長寄主植株的熱處理時間，也可能會鈍化植物組織中的抗性因子，因而和對照相比會降低處理效果。熱處理之后只有一小部分植株能夠存活。

李屬植物病毒一般在38℃左右可被鈍化，通常采用38℃作為處理溫度。但李屬植物耐熱性差，38℃恒溫處理死亡率高。

采取一些改進措施可有效提高存活率，同時不影響脫毒率。這些措施包括晝夜變溫(38℃，16h，光照；25～30℃，8h，黑暗)；預(yù)先處理；降低土溫(29℃)，處理期間澆水；高CO2，降低根部溫度。

一般認(rèn)為高溫(38℃)長時間處理，脫毒率高，但有的病毒是讓寄主植物在低溫下生長一段時間來消除的，對于這些病毒侵染的植物變溫處理存活率和脫毒率均高于恒溫處理。

低溫處理結(jié)合微嫁接或莖尖培養(yǎng)，高濃度細胞分裂素、多次繼代結(jié)合低溫處理也是有效的脫毒途徑。5.2.2通過莖尖培養(yǎng)消除病毒W(wǎng)hite(1934)和Limasset等(1949)研究表明，病毒濃度呈梯度變化，病毒粒子隨植物組織的成熟而增加，旺盛生長的根尖、莖尖很少有病毒分布。Morel等(1952)首次通過莖尖培養(yǎng)成功獲得脫毒的大麗花，以后莖尖培養(yǎng)相繼用于桃、櫻桃、櫻花、豆櫻、山櫻花等植物脫毒。

莖尖的成活率和脫毒率是莖尖脫毒培養(yǎng)的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。褐化是降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要原因。

莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對莖尖褐化有影響。莖尖越小，褐化越嚴(yán)重。

同等大小莖尖休眠季節(jié)取材、液體培養(yǎng)、添加低濃度激素成活率高于休眠前期或生長期取材、固體培養(yǎng)、添加高濃度激素。莖尖和頂端分生組織的區(qū)別頂端分生組織（apicalmeristem，apicaldome）是指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約100μm，最大長度約為250μm。莖尖（shoottip，meristemtip，shootapex）是由頂端分生組織及其下方的1~3個幼葉原基一起構(gòu)成的。

雖然通過頂端分生組織培養(yǎng)獲得消除病毒的機會較高，但大多數(shù)無病毒植株都是通過培養(yǎng)100~1000μm長的外植體得到的，即通過莖尖培養(yǎng)得到的。獲得表面不帶病原菌外植體的方法培養(yǎng)無病植株：無菌土、內(nèi)吸殺菌劑、水培；表面消毒：葉片包被嚴(yán)緊的芽如菊花、菠蘿、姜、蘭花等只需在75%的酒精中浸蘸一下；葉片包被松散的芽如蒜、麝香石竹、馬鈴薯等則要用0.1%次氯酸鈉溶液表面消毒10min。對于這些消毒方法，在工作中應(yīng)靈活運用，以便適應(yīng)具體的實驗體系。防莖尖失水解剖鏡細鑷子解剖針長柄刀片閃亮半圓球的頂端分生組織或莖尖5.2.3熱處理+莖尖培養(yǎng)

頂端分生組織有時也帶有病毒，如麝香石竹莖尖100長的頂端部分，有33%帶有麝香石竹班駁病毒，菊花中，有300~600長莖尖的愈傷組織形成的全部植株都帶有病毒。

若把莖尖培養(yǎng)與熱療法結(jié)合起來，也有可能獲得脫毒植株。熱處理可在切取莖尖之前在母株上進行，也可在莖尖培養(yǎng)期間進行。用前一種方法可以切取較大的外植體進行培養(yǎng)。

若連續(xù)高溫處理會引起受處理植株的組織損傷，可以試用晝夜或隔日高低溫交替處理。如為消除馬鈴薯芽眼中的馬鈴薯卷葉病毒，使用40℃（4h）＋6~20℃（20h）兩種溫度的交替處理。40℃連續(xù)高溫處理會殺死芽眼。5.2.4化學(xué)處理

目前國際上常用的是兩種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì):2,4-二氧六氫三氮雜苯(DHT)和類似嘌呤堿基代謝物質(zhì)病毒唑。

作用機理為這兩種物質(zhì)可抑制病毒復(fù)制。Deogrativos等報道培養(yǎng)基中添加病毒唑，甜櫻桃可脫除ACLSV、PNRSV、PDV。對蘋果田間植株直接噴施該類物質(zhì)也可獲得脫毒苗。⑴物種的局限性⑵無性系變異：變異的累積；愈傷組織；克服辦法：限制一個外植體的繁殖株數(shù)；限制離體繁殖周期的數(shù)目。5.3園藝植物組織培養(yǎng)中存在的問題和對策5.3.1

微繁中存在的一些問題⑶培養(yǎng)物污染：⑷玻璃化：

某些慢速生長的病原菌（特別是內(nèi)生菌）可能依然存在。污染物的長期存在會引起試管苗生活力下降，葉片缺綠，甚至死亡。抗生素或殺菌劑有可能控制這些污染物進一步擴展，但不可能殺滅這些污染物。最好的辦法是無毒外植體。

與正常組培苗相比，玻璃化苗在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了顯著變化，其共同特點是呈半透明狀，并且可分為外觀形態(tài)明顯異常和基本無異常2種類型。此外，玻璃苗的莖尖頂端分生組織相對較?。磺o尖發(fā)育部分保持分生能力的時期也縮短；葉片表面縮小或增大，葉片皺縮并縱向卷曲，脆弱易破碎，顏色不正常；幼苗難以生根等。

5.3.2玻璃化現(xiàn)象

褐化是指在離體繁殖過程中，由培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，培養(yǎng)材料也隨之變褐死亡的現(xiàn)象。加以控制。5.3.3培養(yǎng)基的褐變5.3.4變異

離體快繁可獲得大量形態(tài)、生理特性不變的植株，也可能出現(xiàn)些變異，特別是通過愈傷組織形成的或懸浮培養(yǎng)繁殖的幼苗，更具有普遍性。5.3.5污染

在離體繁殖過程中，細菌和真菌侵染培養(yǎng)基產(chǎn)生菌斑使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育，以至死亡的現(xiàn)象稱為污染。細菌污染的特點是菌斑呈黏液狀，在接種1～3d后即可發(fā)現(xiàn)。真菌污染的特點是污染部分會有不同顏色的霉菌，接種后3～10d才發(fā)現(xiàn)。牡丹的器官培養(yǎng)與快速繁殖外植體部位目前已報道的牡丹器官培養(yǎng)中，多數(shù)以鱗芽為外植體進行研究，包括腋芽、土芽、花芽、頂芽,也有以其他部位如葉柄、葉片、上胚軸和萌生條等。在所有鱗芽中，以土芽的分化表現(xiàn)最好，分化率可達94%，花芽最差僅16%。

不同取材時期對芽培養(yǎng)也有影響：12月至次年2月取材，經(jīng)過低溫休眠，芽充分分化，營養(yǎng)物質(zhì)累積豐富，苞片緊密，污染率低，成活率高，萌發(fā)時間早，因此，此時期取材最好。嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)率、不定芽的分化率均高于葉柄。萌生條的表現(xiàn)最差，不僅污染和褐變死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，而且成活率很低，僅11.7%，難以分化。表面滅