第八章青霉素的生產工藝

青霉素的生產工藝湖南科技學院生化系編輯課件第一節(jié)背景知識1.1青霉素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國細菌學家Fleming發(fā)現(xiàn)污染在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上的一株霉菌能殺死周圍的葡萄球菌。他將此霉菌別離純化后得到的菌株經鑒定為點青霉，并將這菌所產生的抗生物質命名為青霉素。編輯課件1940年，英國Florey和Chain進一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了枯燥的青霉素制品。經實驗和臨床試驗證明，它毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌所引起的許多疾病有卓越的療效。編輯課件1.2青霉素分類及分子結構青霉素是6－氨基青霉烷酸〔6-APA〕苯乙酰衍生物。側鏈基團不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工業(yè)上應用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。青霉素發(fā)酵液中含有5種以上天然青霉素〔如青霉素F、G、X、K、F和V等〕，它們的差異僅在于側鏈R基團的結構不同，其中青霉素G在醫(yī)療中用得最多，它的鈉或鉀鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對革蘭氏陰性菌也有強大的抑制作用。編輯課件青霉素的結構通式編輯課件1.3青霉素的單位目前國際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位〔unit〕；二是活性質量〔μg〕，最早為青霉素規(guī)定的指定單位是：50mL肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標準金葡萄菌生長的青霉素量為一個青霉素單位。在以后，證明了一個青霉素單位相當于0.6μg青霉素鈉。因此青霉素的質量單位為:0.6μg青霉素鈉等于1個青霉素單位。由此，1mg青霉素鈉等于1670個青霉素單位(unit)。編輯課件1.4作用機理已有的研究認為，青霉素的抗菌作用與抑制細胞壁的合成有關。細菌的細胞壁是一層堅韌的厚膜，用以抵抗外界的壓力，維持細胞的形狀。細胞壁的里面是細胞膜，膜內裹著細胞質。編輯課件1.4作用機理細菌的細胞壁主要由多糖組成，也含有蛋白質和脂質。革蘭氏陽性菌細胞壁的組成是肽聚糖占細胞壁干重的50％～80％〔革蘭氏陰性菌為1％～10％〕、磷壁酸質、脂蛋白、多糖和蛋白質。其中肽聚糖是一種含有乙?；咸烟前泛投屉膯卧木W狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關鍵的酶即轉肽酶。青霉素作用的部位就是這個轉肽酶。編輯課件1.4作用機理現(xiàn)已證明青霉素內酞胺環(huán)上的高反響性肽鍵受到轉肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進攻形成了共價鍵，生成青霉噻唑?；?酶復合物，從而不可逆的抑制了該酶的催化活性。通過抑制轉肽酶，青霉素使細胞壁的合成受到抑制，細菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。編輯課件1.5青霉素的應用臨床應用：40多年來，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌〔如金黃色葡萄球菌〕和某些革蘭氏陰性細菌及螺旋體有抗菌作用。優(yōu)點：毒性小，但由于難以別離除去青霉噻唑酸蛋白〔微量可能引起過敏反響〕，需要皮試。編輯課件編輯課件2.1菌種介紹青霉是產生青霉素的重要菌種。廣泛分布于空氣、土壤和各種物上，常生長在腐爛的柑桔皮上呈青綠色。目前已發(fā)現(xiàn)幾百種，其中產黃青霉(Penicillumchrysogenum)、點青霉(Penicillumnototum)等都能大量產生青霉素。編輯課件編輯課件2.2菌種的保藏菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷凍枯燥法。編輯課件2.3孢子的制備這是發(fā)酵工序的開端，是一個重要環(huán)節(jié)。抗生素產量和成品質量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關系。生產用的孢子需經過純種和生產能力的檢驗，符合規(guī)定的才能用來制備種子。編輯課件2.3孢子的制備保藏在砂土管或冷凍枯燥管中的菌種經無菌操作接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長的斜面培養(yǎng)基中，經培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面。對于產孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基孢子，孢子可直接作為中子罐的種子。編輯課件編輯課件2.4種子制備種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。編輯課件2.4種子制備種子罐級數(shù)是在指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素種子制備一般為二級種子罐擴大培養(yǎng)。編輯課件編輯課件2.5發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產和工藝選擇、產品質量和產量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五局部組成。編輯課件碳源青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為廉價，但因貨源較少，很多國家采用葡萄糖代替。但當葡萄糖濃度超過一定限度時，會過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。編輯課件編輯課件氮源氮源供給菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進一步合成青霉素。主要有機氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。固體有機氮源原料一般需粉碎至200目以下的細度。有機氮源還可以提供一局部有機磷，供菌體生長。無機氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。編輯課件無機鹽及金屬離子碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值，為菌體提供營養(yǎng)的無機磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外參加硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。編輯課件無機鹽及金屬離子由于現(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進入發(fā)酵液。發(fā)酵時間愈長，那么鐵離子愈多。鐵離子在50μg/ml以上便會影響青霉素的合成。采用鐵絡合劑以抑制鐵離子的影響，但實際對青霉素產量并無改進。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反響。編輯課件前體添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基轉移的作用，將苯乙酸轉入青霉素分子，提高青霉素G的生產強度，添加苯氧乙酸那么產生青霉素V。因此前體的參加成為青霉素發(fā)酵的關鍵問題之一。編輯課件前體但苯乙酸對發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結合進青霉素成品。而月桂酸作為細菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價格較貴。前體要在發(fā)酵開始20h后參加，并在整個發(fā)酵過程中控制在50μg/ml左右。編輯課件消沫劑由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產生，加上培養(yǎng)基中有很多有機氮源含有蛋白質，因此在發(fā)酵罐內會產生大量泡沫，如不嚴加控制，就會產生發(fā)酵液逃液，導致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑〔如聚酯、聚醇類消沫劑〕代替豆油。編輯課件2.6滅菌工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學藥劑滅菌、射線滅菌和介質過濾除菌等幾種。在青霉素的生產中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。編輯課件編輯課件2.7發(fā)酵這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基必須先經過滅菌，后接入種子。接種量一般為5～20%。發(fā)酵周期一般為4～5天，但也有少于24小時，或長達二周以上的。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時間取樣進行生化分析和無菌試驗，觀察代謝變化、抗生素產生情況和有無雜菌污染。編輯課件編輯課件編輯課件2.7.1發(fā)酵的過程控制1、碳源控制：青霉菌能利用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比較好的碳源，但必須控制其參加的濃度，因為葡萄糖易被菌體氧化并產生抑制抗生素合成酶形成的物質，從而影響青霉素的合成，所以可以采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。編輯課件苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G的側鏈前體。編輯課件在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速率隨培養(yǎng)基pH上升而增加。年幼的菌絲不氧化前體，而僅利用它來構成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力逐漸增加。培養(yǎng)基成分對前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。編輯課件為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供給速率略大于生物合成的需要。前體用量大于0.1%時，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。編輯課件2、pH控制在青霉素發(fā)酵過程中，pH是通過以下手段控制的：如pH過高，那么添加糖、硫酸或無機氮源；假設pH過低，那么參加碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。另外，也可利用自動參加酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在6.8～7.2，以提高青霉素產量。編輯課件3、溫度控制青霉菌生長的適宜溫度為30℃，而分泌青霉素的適宜溫度是20℃左右，因此生產上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級種子的培養(yǎng)溫度控制在27±1℃左右；二級種子的培養(yǎng)溫度控制在25±1℃左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在26℃左右；發(fā)酵后期的溫度控制在24℃左右。編輯課件4、補料控制發(fā)酵過程中除以中間補糖控制糖濃度及pH外，補加氮源也可提高發(fā)酵單位。為了延長發(fā)酵周期，提高青霉素產量，發(fā)酵過程分次補加氮源也是有效的措施。編輯課件5、鐵離子的影響三價鐵離子對青霉素生物合成有顯著影響，一般假設發(fā)酵液中鐵離子含量超過30～40μg/ml，那么發(fā)酵單位增長緩慢。鐵離子對產黃青霉綠色孢子合成青霉素的影響見下表。因此鐵罐在使用前必須進行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護層，使鐵離子含量控制在30μg/ml以下。編輯課件2.7.2防止染菌的要點染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實現(xiàn)優(yōu)質高產。影響染菌的因素很多，而且?guī)щS機性質，但只要認真對待，過細地工作，染菌是可以防止的。編輯課件2.7.3空氣系統(tǒng)的要求防止空氣帶菌主要是提高空壓機進口空氣的潔凈度，防止空氣夾帶油和水及空氣過濾器失效。提高空壓機進口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強空氣的壓縮前過濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進入空氣系統(tǒng)。編輯課件2.7.4蒸汽系統(tǒng)的要求重視飽和蒸汽的質量，要嚴防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產時所用的蒸汽壓力在30～35千帕以上。編輯課件1、連續(xù)滅菌設備：連消塔結構要求簡單，易于拆裝和清理，操作時蒸汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。2、發(fā)酵罐：發(fā)酵罐及其附屬設備應注意嚴密和防止泄漏，防止形成“死角〞。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門都必須保證嚴密度。3、無菌室：用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。編輯課件第三節(jié)提煉工藝過程編輯課件3.1發(fā)酵液預處理發(fā)酵液中的雜質如高價無機離子和蛋白質在離子交換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提煉時，蛋白質的存在會產生乳化，使溶媒合水相別離困難。編輯課件編輯課件對高價離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸那么它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質凝固以提高發(fā)酵濾液的質量。如加磷酸〔或磷酸鹽〕，既能降低鈣離子濃度，也利于去除鎂離子。編輯課件加黃血鹽及硫酸鋅，那么前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質。此外，兩者還有協(xié)同作用。他們所產生的復鹽對蛋白質有吸附作用。編輯課件為了有效的去除發(fā)酵液中的蛋白質，需參加絮凝劑。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。含有很多離子化基團。編輯課件3.2提取化學提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、符合藥典的抗生素成品。由于發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1～4.5%左右，而雜質濃度比青霉素的高幾十倍甚至幾千倍，并且某些雜質的性質與抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。發(fā)酵液中常見的雜質有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產生菌的代謝產物、預處理需要參加的雜質等。編輯課件編輯課件編輯課件在提煉過程中要遵循下面四個原那么：1、時間短2、溫度低3、pH適中4、勤清洗消毒編輯課件常用的提取方法有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。編輯課件青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質，在酸性條件下青霉素轉入有機溶媒中，調節(jié)pH，再轉入中性水相，反復幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2－3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時，pH選擇2.8-3.0，從乙酸丁酯反萃到水相時，pH選擇6.8-7.2。為了防止pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進行反萃。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調pH2.8~3.0，參加醋酸丁酯。在一次丁酯萃取時，由于濾液含有大量蛋白，通常參加破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質，加0.05-0.1%乳化劑PPB。編輯課件3.3精制這是青霉素生產的最后工序。對產品進行精制、烘干和包裝的階段要符合“藥品生產管理標準〞的規(guī)定。編輯課件編輯課件3.3.1脫色和去熱原質脫色和去熱原質是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。色素是在發(fā)酵過程中所產生的代謝產物，它與菌種和發(fā)酵條件有關。熱原質是在生產過程中由于被污染后雜菌所產生的一種內毒素。生產中一般用活性炭脫色去熱原質，但需注意脫色時pH、溫度、活性炭用量及脫色時間等因素，還應考慮它對抗生素的吸附問題，否那么影響收率。編輯課件編輯課件3.3.2結晶抗生素精制常用結晶法來制得高純度成品。常用的幾種結晶方法有：1、改變溫度結晶利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來進行結晶。2、利用等電點結晶當將某一抗生素溶液的pH調到等電點時，它在水溶液中溶解度最小，那么沉淀析出。3、加成鹽劑結晶在抗生素溶液中加成鹽劑使抗生素以鹽的形式從溶液中能夠沉淀結晶。編輯課件青霉素鈉鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性質，再二次醋酸丁酯萃取液中參加醋酸鈉乙醇溶液，并控制溫度青霉素鈉鹽就結晶析出。反響如下：編輯課件醋酸丁酯中含水量過高會影響收率，但可提高晶體純度。水分在0.9%以下對收率影響較小。得到的晶體要求顆粒均勻，有一定的細度。顆粒太細會使過濾、洗滌困難。晶體經丁醇洗滌，真空枯燥即可等到成品。編輯課件編輯課件3.4成品鑒定成品鑒定是根據(jù)藥典的