蛋白質(zhì)組學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)組學(xué)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[摘要]基因研究是20世紀(jì)乃至21世紀(jì)生命科學(xué)的主線(xiàn)。隨著人類(lèi)基因組全序列測(cè)定的完成，人類(lèi)基因的注釋與確認(rèn)已成為生命科學(xué)面臨的最重要任務(wù)之一。人類(lèi)基因組中絕大部分基因及其功能有待于在蛋白質(zhì)水平上加以揭示與闡述。蛋白質(zhì)科學(xué)，特別是蛋白質(zhì)組學(xué)，因此應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組學(xué)與技術(shù)已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)與生物技術(shù)的重要戰(zhàn)略前沿，其地位被提高到前所未有的高度。本文會(huì)就蛋白質(zhì)組學(xué)的概念、主要研究方法、在腫瘤治療方面的應(yīng)用和目前存在的問(wèn)題及研究前景等方面作一簡(jiǎn)單綜述。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組基因組腫瘤治療一、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的研究意義和背景上世紀(jì)生物科學(xué)界不得不提的一件大事無(wú)疑就是人類(lèi)基因組計(jì)劃了。以人類(lèi)基因組計(jì)劃（HGP）為代表的基因組計(jì)劃是20世紀(jì)僅次于曼哈頓原廣彈研制計(jì)劃與阿波羅登月計(jì)劃的重大科技工程。其中，HGP旨在完成人基因組24條染色體上5萬(wàn)左右基因的作圖(遺傳圖與物理圖)和30億堿基的DNA全序列的測(cè)定。此計(jì)劃最初由美國(guó)能源部提出，自1990年10月1日正式啟動(dòng)以來(lái)進(jìn)展神速，世界各國(guó)紛紛啟動(dòng)自己的HGP，各種DNA測(cè)序技術(shù)日益成熟，以致原本計(jì)劃在15年的時(shí)間完成的HGP已于2003年提前兩年初步完成。[1但當(dāng)人們?yōu)镠GP的成功而歡呼雀躍時(shí)，一項(xiàng)更艱巨、更宏大的任務(wù)——基因組功能的闡明——已擺在世界科學(xué)家的面前。生命科學(xué)因而在轉(zhuǎn)瞬間進(jìn)入了一個(gè)新紀(jì)元：后基因組時(shí)代（Postgenomeera）。在這個(gè)時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)（Functionalgenomics），包括結(jié)構(gòu)基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個(gè)物種的基因組被測(cè)序，但其中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達(dá)序列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)等，都是從細(xì)胞中mRNA的角度來(lái)考慮的，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。但事實(shí)并不完全如此，從DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)，存在三個(gè)層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，翻譯水平調(diào)控，翻譯后水平調(diào)控。從mRNA角度考慮，實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好。更重要的是，蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無(wú)法從mRNA水平來(lái)判斷。[2]眾所周知，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，由于其可變性和多樣性等特殊性質(zhì)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研究技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個(gè)生命過(guò)程。于是，鑒于基因組研究的種種不足和蛋白質(zhì)研究的迫切需求，人類(lèi)經(jīng)過(guò)一個(gè)世紀(jì)的跋涉，重返蛋白質(zhì)這個(gè)現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)源地之一。這不是簡(jiǎn)單的回歸，而是一次真正的黑格爾式的“重返”。以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）因而橫空出世，并成為生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代的里程碑和后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。二、蛋白質(zhì)組的概念蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念是在1994年由澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出的，它源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合，其定義為在一種細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)。[3]如今也有人稱(chēng)蛋白質(zhì)組為由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。[4]它與基因組的概念有很大差異：基因組是靜態(tài)的，一個(gè)生物體只有一套基因組；而蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的，一個(gè)基因可以表達(dá)出多種蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)又分別有不同的高級(jí)結(jié)構(gòu)，不同細(xì)胞在不同生理或病理狀態(tài)下所表達(dá)的蛋白質(zhì)的種類(lèi)也不盡相同。[5]蛋白質(zhì)組學(xué)的研究試圖比較細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)和鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。其研究?jī)?nèi)容主要包括蛋白質(zhì)鑒定、翻譯后修飾和蛋白質(zhì)功能確定等。[6]三、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略和技術(shù)由于生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)；而多個(gè)蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級(jí)聯(lián)因果；而且在執(zhí)行生理功能時(shí)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的，因此傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究的方式已無(wú)法滿(mǎn)足后基因組時(shí)代的要求。蛋白質(zhì)組學(xué)一經(jīng)出現(xiàn)，就有兩種研究策略。一種可稱(chēng)為“竭澤法”，即采用高通量的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)分析生物體內(nèi)盡可能多乃至接近所有的蛋白質(zhì)，這種觀點(diǎn)從大規(guī)模、系統(tǒng)性的角度來(lái)看待蛋白質(zhì)組學(xué)，也更符合蛋白質(zhì)組學(xué)的本質(zhì)。但是，由于蛋白質(zhì)表達(dá)隨空間和時(shí)間不斷變化，要分析生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)是一個(gè)難以實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)。另一種策略可稱(chēng)為“功能法”，即研究不同時(shí)期細(xì)胞蛋白質(zhì)組成的變化，如蛋白質(zhì)在不同環(huán)境下的差異表達(dá)，以發(fā)現(xiàn)有差異的蛋白質(zhì)種類(lèi)為主要目標(biāo)。這種觀點(diǎn)更傾向于把蛋白質(zhì)組學(xué)作為研究生命現(xiàn)象的手段和方法。[7]而現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)亦層出不窮，主要包括：雙向電泳(2-DE)、新型質(zhì)譜(MS)技術(shù)、數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置與檢索系統(tǒng)等。為了保證分析過(guò)程的精確性和重復(fù)性，大規(guī)模樣品處理機(jī)器人也被應(yīng)用。整個(gè)研究過(guò)程包括：樣品處理、蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)豐度分析、蛋白質(zhì)鑒定等步驟。[8]下面就其中最基礎(chǔ)的兩項(xiàng)技術(shù)——用于分離的雙向電泳技術(shù)和用于鑒定的質(zhì)譜技術(shù)作簡(jiǎn)單介紹。（一）二維凝膠電泳技術(shù)二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophocresis,2-DE)是目前惟—能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)。2-DE是由O’Farrell和Klose于1975年分別提出的。在2-DE中，蛋白質(zhì)首先根據(jù)等電點(diǎn)的不同在一向等電聚焦電泳中分離，接著被轉(zhuǎn)移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小不同被分離。由于電泳裝置的限制和載體兩件電解質(zhì)的特性，使得2-DE的重復(fù)性很差，很難制備大量重復(fù)性好的2-DE膠。20世紀(jì)80年代初期出現(xiàn)的固相化pH梯度(immobilizedpHgradient，IPG)等電聚焦電泳技術(shù)，使2-DE的重復(fù)性和上樣量大大改善，不同實(shí)驗(yàn)室之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行比較，加之后續(xù)的微量鑒定技術(shù)如Edman微量測(cè)序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高，使得2-DE獲得了廣泛的應(yīng)用，成為蛋白質(zhì)組研究中首選的分離技術(shù)。盡管如此，2-DK技術(shù)仍存在許多不足，如膜蛋白、堿性蛋白、低豐度蛋白的分離與檢測(cè)、重復(fù)性以及規(guī)模化和自動(dòng)化的問(wèn)題。對(duì)2-DE技術(shù)的改進(jìn)，包括對(duì)2-DE樣品的前處地及2-DE后的蛋白點(diǎn)檢測(cè)的研究一直在進(jìn)行。[9]（二）生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜分析法是通過(guò)測(cè)定樣品離子的質(zhì)荷比(m／z)來(lái)進(jìn)行成分和結(jié)構(gòu)分析的分析方法。80年代中期出現(xiàn)了兩種新的電離技術(shù)：電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離。這兩種技術(shù)所具有的高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在fmol乃至amol水平檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)幾十萬(wàn)道爾頓的生物大分子成為可能，從而開(kāi)拓了質(zhì)譜學(xué)一個(gè)嶄新的領(lǐng)域——生物質(zhì)譜。促使質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用和發(fā)展。[10]蛋白質(zhì)組學(xué)泰斗JohnYates曾說(shuō)：“質(zhì)譜方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中絕對(duì)關(guān)鍵，正因?yàn)橛辛速|(zhì)譜技術(shù)，才能有蛋白質(zhì)組學(xué)的存在，正因?yàn)橛辛说鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)，才有生化技術(shù)的進(jìn)展?！盵11]質(zhì)譜技術(shù)的重要性可想而知。目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀，其離子化方式主要是電噴霧電離與基質(zhì)輔助激光解吸電離，前者常采用四極桿質(zhì)量飛行器，所構(gòu)成的儀器稱(chēng)為電噴霧(四極桿)質(zhì)譜儀；后者常采用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱(chēng)為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）的特點(diǎn)之一是可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離子段聯(lián)用，因而可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜化臺(tái)物分離與鑒定的聯(lián)機(jī)操作。而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）的特點(diǎn)是對(duì)鹽和填加物的耐受能力強(qiáng)，且操作簡(jiǎn)便，測(cè)定速度快，易于實(shí)現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，圖譜容易解析。此外，用于生物大分子測(cè)定的質(zhì)譜儀還有離子阱(iontrap)質(zhì)譜儀和傅立葉變換離子回旋共振(fouriertransformioncyclotronresonance,FTICR)質(zhì)譜等。[12]四、蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤治療方面的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是最為明顯的，例如在新藥開(kāi)發(fā)中高通量地篩選藥物分子靶標(biāo)。其在腫瘤治療亦有得大幫助，甚至還分化出一門(mén)腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)。下面介紹在華南常發(fā)的兩種腫瘤在蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的情況。（一）鼻咽癌鼻咽癌是我國(guó)(尤其是華南地區(qū))及東南亞常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，在世界其他國(guó)家或地區(qū)較為少見(jiàn)。中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所與湖南師范大學(xué)生命科學(xué)院率先采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析了人鼻咽癌細(xì)胞系HONE1的總蛋白質(zhì)和新近克隆的鼻咽癌相關(guān)基因NGX6轉(zhuǎn)染人鼻咽細(xì)胞系HNE—1后差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中，通過(guò)2-DE分析HONE1細(xì)胞系的總蛋白質(zhì)，MALDI-T0F-M5鑒定出10種在HONE1細(xì)胞系中表達(dá)較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子(ILGF)、白細(xì)胞介素-14(IL-14)、癌蛋白WNT-2和絲裂原激活蛋白激酶-8(MAPK-8)等。同時(shí)，利用計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)還構(gòu)建了一個(gè)鼻咽癌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的雛形。在NGX6基因轉(zhuǎn)染前后人鼻咽細(xì)胞系HNE1差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分析中，則鑒定出7種經(jīng)NGX6基因誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞凋亡相關(guān)的Fas蛋白、與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的鋅指蛋白(ZNF)和與細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)的主要組織相容性抗原Ⅱ(MHCⅡ)等。這些研究為進(jìn)一步開(kāi)展鼻咽癌組織的蛋白質(zhì)組研究和建立鼻咽癌蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)奠定了基礎(chǔ)。[13]（二）肝癌肝癌同樣是我國(guó)東南沿海地區(qū)及東南亞國(guó)家高發(fā)的惡性腫瘤之一，我國(guó)(尤其是上海地區(qū))在肝癌的病因、發(fā)病、早期診斷和治療方面一直居世界前列。因此中科院上海生化所在開(kāi)展腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究時(shí)選擇了肝癌作為主要方向。他們采用雙向凝膠電泳和液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了人肝癌細(xì)胞系BEL-7404和人正常肝細(xì)胞系L-02間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，以及用反義表皮生長(zhǎng)因子受體序列(antisenseepidermalgrowthfactorreceptorsequence)轉(zhuǎn)染前后的人肝癌細(xì)胞系(JX-0和JX-1)的蛋白質(zhì)組改變情況。其中,在分析人肝癌細(xì)胞系BEL-7404和人正常肝細(xì)胞系L-02間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-P在人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)比在人正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)高18倍，而表皮細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(epidermalfattyacidbindingprotein,E-FABP)和脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte-typefattyacidbindingprotein，A-FABP)只見(jiàn)于正常肝細(xì)胞，在肝癌細(xì)胞系中未檢測(cè)到表達(dá)。在分析用反義表皮生長(zhǎng)因子受體序列轉(zhuǎn)染前后的人肝癌細(xì)胞系(JX-0和JX-1)蛋白質(zhì)組的改變情況時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)40個(gè)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染前后表達(dá)有顯著改變，這些蛋白質(zhì)包括：腫瘤抑制蛋白maspin、熱休克蛋白27(HSP27)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX-1)和14-3·3σ蛋白等。另外，新加坡學(xué)者Seow等(2001)也利用雙向凝膠電泳、MALDI-TOF-MS或納噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜(nanoelectrosprayionizationMS/MS)技術(shù)鑒定了一株乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞系HCC-M中表達(dá)的蛋白質(zhì)，建立了該細(xì)胞系的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，并開(kāi)展了肝癌組織蛋白質(zhì)組的初步研究。[14]五、目前存在的問(wèn)題和研究前景盡管蛋白質(zhì)組學(xué)研究在近年得到很大的進(jìn)展，但仍然存在不少問(wèn)題。就2-DE技術(shù)來(lái)看，就存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的完善、重復(fù)性難以實(shí)現(xiàn)、動(dòng)態(tài)范圍有限、低拷貝蛋白質(zhì)難以檢測(cè)、蛋白質(zhì)的丟失、通量低和自動(dòng)化差等缺陷。[15]其中為了獲得通量化，每天必須記錄幾千個(gè)MPI。為此，急需發(fā)展一個(gè)裂解平行出現(xiàn)在凝膠基質(zhì)(gelmatrix)或結(jié)合至顆粒(重組融合蛋白親合純化)的多種蛋白的完全自動(dòng)化工作站。這個(gè)工作站應(yīng)包話(huà)樣品清洗、濃縮和隨后的質(zhì)譜樣品準(zhǔn)備。而且，質(zhì)譜設(shè)備要求每天能產(chǎn)生幾千個(gè)MPI。另外，新的質(zhì)譜方法將需要探索高的產(chǎn)品輸出，包括改進(jìn)的PSD分析工具及用于離子捕獲的MALDI。然而有一些滯后可能限制MALDI-MS在蛋白質(zhì)組和基因組計(jì)劃中的應(yīng)用。最引人注目的是鹽和去污劑。例如來(lái)自SDS電泳的SDS或染色試劑，大大增加了在測(cè)試過(guò)程中的背景。因此這就要求進(jìn)行質(zhì)譜之前樣品的清洗。[16]目前很多實(shí)驗(yàn)室致力于開(kāi)發(fā)新的大規(guī)模蛋白質(zhì)分離鑒定技術(shù)，并嘗試建立新的蛋白質(zhì)組研究技術(shù)平臺(tái)，如二維色譜-中聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、親相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等多種模式。而其他的關(guān)鍵問(wèn)題則包話(huà)：灌制膠、清洗試管和玻璃板、應(yīng)用于等電聚焦(IEF)電泳的樣品制備、轉(zhuǎn)IEF膠到SDS膠。包括發(fā)展從2-DE膠取點(diǎn)的機(jī)械于，它能從2—DE膠上自功切取成百上千的蛋白點(diǎn)。在研究分子遺傳學(xué)的Max-Planck研究所，已經(jīng)研制了一個(gè)可進(jìn)行8個(gè)管穿孔的膠取點(diǎn)設(shè)備，但需要進(jìn)一步改進(jìn)(如釋放膠碎片)及適用于20cmx30cm膠的機(jī)械手系統(tǒng)。[17參考文獻(xiàn)：1課件人類(lèi)基因組計(jì)劃及意義.PPT王金發(fā)2網(wǎng)上讀書(shū)園地論壇《蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展與趨勢(shì)》/bbs/htm_data/32/0501/47288.html3《蛋白質(zhì)組學(xué)》/qg-blog/swz/sw/qgyph/archives/2006/228.html4儀器信息網(wǎng)《蛋白質(zhì)組技術(shù)研究進(jìn)展》/show/download/shtml/004861.shtml5