PCR技術的原理及應用

PCR技術的原理及應用1精選2021版課件PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長2精選2021版課件PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物3精選2021版課件PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶4精選2021版課件PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設想被人們遺忘了……5精選2021版課件PCR技術簡史DNA的復制核酸體外擴增的設想聚合酶鏈反應的發(fā)明1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復制最初采用E-coliDNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項技術獲諾貝爾化學獎6精選2021版課件KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。7精選2021版課件生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學檢測人類學研究……8精選2021版課件基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段9精選2021版課件DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術引物DNA聚合酶10精選2021版課件引物引物Mullis的構思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段11精選2021版課件94℃變性50-65℃退火XX℃延伸12精選2021版課件94℃55℃37℃13精選2021版課件Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402014精選2021版課件72℃94℃55℃PCR循環(huán)15精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點標準的PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L16精選2021版課件1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍17精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃18精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物19精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶20精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束95℃第2輪開始21精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq22精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束23精選2021版課件PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增24精選2021版課件實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR在醫(yī)學和科研中的應用提綱25精選2021版課件在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR定義26精選2021版課件常規(guī)PCR技術：

對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析。無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。實時熒光定量PCR原理27精選2021版課件實時定量PCR技術：

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。

28精選2021版課件如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值實時熒光定量PCR原理29精選2021版課件30精選2021版課件實時熒光定量PCR原理--------擴增曲線擴增曲線圖：

橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件31精選2021版課件實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值

熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準差的10倍手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99

真正的信號:熒光信號超過域值32精選2021版課件實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。C(t)value33精選2021版課件實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性34精選2021版課件實時熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反應：

X=X0*2n非理想的PCR反應：

X=X0(1+Ex)nn：擴增反應的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率35精選2021版課件實時熒光定量PCR原理---------定量原理在擴增產(chǎn)物達到閾值線時:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量.在閾值線設定以后,它是一個常數(shù),我們設為M方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得:lgM=lgX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。36精選2021版課件實時熒光定量PCR原理---------標準曲線模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。37精選2021版課件確定未知樣品的C(t)值通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample實時熒光定量PCR原理絕對定量2538精選2021版課件提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設計及應用實時熒光定量PCR原理

實時熒光定量PCR的幾種方法介紹實時熒光定量PCR實驗設計及應用39精選2021版課件非特異性熒光標記：1、SYBRGreenⅠ特異性熒光標記：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor實時熒光定量PCR原理---DNA產(chǎn)物的熒光標記QQR40精選2021版課件實時熒光定量PCR方法1－－－SYBRGreenⅠ法41精選2021版課件SYBRGreenⅠ法

SYBRGreenⅠ能結合到雙鏈DNA的小溝部位

SYBRGreenⅠ只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreenⅠ發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號（一般設置在復性階段）。SYBRGreen42精選2021版課件實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation43精選2021版課件實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析溫度熒光強度TmTm值：DNA解鏈一半時的溫度44精選2021版課件實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析將溫度與熒光強度的變化求導。(-dI/dT)-dIdTTm45精選2021版課件SYBRGreenⅠ法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，有雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產(chǎn)物46精選2021版課件CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少。

Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量。47精選2021版課件SYBRGreenⅠ法--------PCR反應的建立反應體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreenⅠ使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應Buffer體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同48精選2021版課件SYBRGreenⅠ法應用范圍起始模板的測定

基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應的條件，對常規(guī)PCR有指導意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。49精選2021版課件SYBRGreenⅠ法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設計復雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點容易與非特異性雙鏈DNA結合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應條件對引物特異性要求較高缺點50精選2021版課件本單位目前開展的工作多種病原體定量和定性細胞因子檢測（人，小鼠，大鼠等）基因表達水平檢測PCR芯片51精選2021版課件實時熒光定量PCR方法2-------TaqMan法52精選2021版課件與目標序列互補TaqMan---水解型雜交探針

5′端標記有報告基團(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光（熒光共振能量轉移原理，F(xiàn)RET）

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針53精選2021版課件TaqMan法工作原理每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光54精選2021版課件TaqMan法PCR反應的建立1、引物、探針的設計：

探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反應參數(shù)的確定：

一般為：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，最大信號/背景比值引物濃度：50-900nM探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同55精選2021版課件已肝病人血液中HBV的絕對定量目的：利用核酸檢測，縮短檢驗時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)方法：從血液中提取病毒DNA，擴增病毒基因，以TaqMan探針進行檢測設置對照：濃度為106、105

、104

、103

的標準樣品各一個，設陰性和空白對照實驗步驟：提取HBVDNA

設計特異引物設計TaqMan探針并標記探針擴增程序結果：獲取血液樣品中HBVDNA的精確copy數(shù)利用TaqMan法檢測血液中的HBV56精選2021版課件數(shù)據(jù)分析分析結果：HBVDNA的精確copy數(shù)為

3.7X105利用TaqMan法檢測血液中的HBVsamplesample57精選2021版課件TaqMan法應用范圍起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定單核苷酸多態(tài)性分析

(singlenucleotidepolymorphism，SNP)58精選2021版課件TaqMan法優(yōu)缺點對目標序列的高特異性

------陰性結果確定設計相對簡單

------與目標序列某一區(qū)域互補重復性比較好優(yōu)點只適合一個特定的目標委托公司標記，價格較高不易找到本底低的探針缺點59精選2021版課件實時熒光定量PCR方法3--Molecularbeacon法(分子信標)60精選2021版課件標記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標序列互補莖由互補配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針61精選2021版課件Molecularbeacon(分子信標)工作原理

熒光共振能量轉移（FRET）探針與DNA雜交時產(chǎn)生熒光

-----延伸過程：不產(chǎn)生熒光

------退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光信號62精選2021版課件Molecularbeacon(分子信標)應用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析63精選2021版課件Molecularbeacon(分子信標)優(yōu)缺點高特異性：對目標序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點只能用于一個特定目標設計困難價格比較高缺點64精選2021版課件幾種方法總結化學試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測主要應用范圍SYBRGreenI結合于雙鏈DNA的小溝中否復性/延伸熔解曲線分析定量和檢測目標基因MolecularBeacon發(fā)夾型雜交探針有復性SNP分析定量和檢測目標基因TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟SNP分析定量和檢測目標基因65精選2021版課件實時熒光定量PCR的實驗設計和數(shù)據(jù)處理絕對定量與相對定量66精選2021版課件絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應的模板濃度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷貝數(shù)轉基因的拷貝數(shù)相對定量：計算初始反應模板的相對含量差異表達分析芯片評估轉基因生物的檢測基因型檢測67精選2021版課件實時熒光PCR絕對定量方法unknown104103標準品，標準曲線已知濃度的相應DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實時PCR反應得到相應的C(t)，構建標準曲線樣品與標準品同時進行PCR反應得到未知濃度樣品的C(t)值68精選2021版課件使用實時熒光定量PCR進行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝區(qū)分小差異樣品：24，48，96，……大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測100—1010省時有效69精選2021版課件實時熒光相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達差異（倍數(shù)關系）相對定量的問題解決樣品材料不均一造成的差別解決加樣過程中的差別內(nèi)標基因內(nèi)標通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響較小對目的基因進行均一化：目的基因拷貝／每一個內(nèi)標基因拷貝70精選2021版課件提綱實時熒光定量PCR原理實時熒光定量PCR的幾種方法介紹

實時熒光定量PCR實驗設計及應用71精選2021版課件實時熒光定量PCR法標準樣品相對定量中的內(nèi)標內(nèi)標通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量絕對定量的標準樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA和體外轉錄的RNA72精選2021版課件實時熒光定量PCR法－－標準樣品DNA拷貝數(shù)

用于生成標準曲線的樣品如何設定？含有和待測樣品相同擴增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴增片段的cDNA紫外分光光度計或熒光酶標測定濃度根據(jù)質(zhì)?；騝DNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀釋73精選2021版課件實時熒光定量PCR法定量方法絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標準曲線相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標轉錄本之間基因的表達差異（不同時相）

2-△C（t）雙標準曲線法74精選2021版課件

TaqMan法舉例標記探針使用TaqMan探針進行雙通道熒光定量

Fam標記目標基因探針VIC標記看家基因探針75精選2021版課件TaqMan法舉例材料準備從正常乳腺組織中提取的總RNA從乳腺癌組織中提取的

總RNA含ERBB2andGAPD