PikoReal使用培訓(xùn)-致病菌檢測(cè)

PikoReal熒光定量PCR使用培訓(xùn)

－致病菌檢測(cè)

內(nèi)容：1、熒光定量PCR根本原理介紹2、PikoReal功能簡(jiǎn)介3、致病菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析PCR和定量PCR

——根本知識(shí)介紹

生命的遺傳物質(zhì)DNA〔少數(shù)物種為RNA〕，對(duì)于不同的物種來(lái)說(shuō)，其堿基排列順序是獨(dú)一無(wú)二的檢測(cè)不同生物中特異的DNA片段，就可以清楚的區(qū)分不同的生物。中心法那么堿基配對(duì)原那么PolymeraseChainReaction〔PCR〕——聚合酶鏈?zhǔn)椒错戵w外的DNA復(fù)制PCR反響體外RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNART-PCR反響通過(guò)PCR或RT-PCR反響，就可累計(jì)大量的特異性目的片段，用于下游的檢測(cè)和研究Melting94CPrimersBind58CExtension72CPCR的根本原理PCR的根本原理PolymeraseChainReaction〔PCR〕——聚合酶鏈?zhǔn)椒错懺赑CR反響過(guò)程中，升溫，降溫交替進(jìn)行，循環(huán)往復(fù)——熱循環(huán)提供熱循環(huán)環(huán)境的儀器——熱循環(huán)儀〔PCR儀〕TemperatureTimeMeltAnnealCopyMeltAnnealCopyCycle1Cycle2PCR的根本原理模板〔DNAorRNA〕DNA：從animal,plant,bacteria,yeast,virus中抽提RNA：抽提后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(也在PCR儀上完成〕引物〔一對(duì)或多對(duì)〕脫氧核糖核苷酸(dNTP原料)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶Buffer〔緩沖液提供適合的酶作用環(huán)境〕反響體系：5-50ul〔常用〕PCR的根本原理PCR反響體系PCRkitPCR的根本原理PCR實(shí)驗(yàn)流程圖:A模板，引物,dNTP,緩沖液,DNA聚合酶上樣PCR反響PCR的根本原理PCR實(shí)驗(yàn)流程圖:B+-PCR產(chǎn)物電泳，EB染色兩種產(chǎn)物兩對(duì)特定引物擴(kuò)增的片段多種產(chǎn)物非特異性引物擴(kuò)增出一系列片段PCR實(shí)驗(yàn)流程圖:CPCR的根本原理凝膠成像系統(tǒng)成像，定終產(chǎn)物濃度–半定量PCR是當(dāng)今應(yīng)用最廣泛的生物技術(shù)之一幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，藥物研發(fā)中心，臨床診斷實(shí)驗(yàn)室都在使用PCR技術(shù)，而且還有新的應(yīng)用方向不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)幾個(gè)重要的應(yīng)用領(lǐng)域:

科學(xué)研究

醫(yī)學(xué)研究及診斷

法醫(yī)鑒定

食品檢驗(yàn)PCR應(yīng)用

PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)缺點(diǎn)：擴(kuò)增與檢測(cè)分開(kāi)進(jìn)行→

繁瑣使用熒光染料EB檢測(cè)DNA→有毒不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果沒(méi)有可比性通量太低擴(kuò)增檢測(cè)

PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)缺點(diǎn)：很難準(zhǔn)確得到樣本內(nèi)模板DNA或RNA的量終點(diǎn)的產(chǎn)物量不一定能如實(shí)反響和起始模板量的對(duì)應(yīng)關(guān)系相同模板在同一臺(tái)PCR儀上相同條件下重復(fù)96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖PCR反響進(jìn)入平臺(tái)期，合成新鏈的原料開(kāi)始缺乏，酶的活力也下降，導(dǎo)致新增DNA的量增長(zhǎng)緩慢，最后停止增長(zhǎng)。熒光定量PCR——根本原理——熒光染料和探針——應(yīng)用介紹光源熒光定量PCR——根本原理熱循環(huán)儀探測(cè)器可以實(shí)時(shí)檢測(cè)出每輪循環(huán)的PCR產(chǎn)物量參加熒光染料的PCR體系模板，引物,dNTP,緩沖液,DNA聚合酶和熒光探針或熒光染料在體系中原料充足的情況下，產(chǎn)物按固定倍數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)指數(shù)增長(zhǎng)期間，初始模板濃度不同的樣品的擴(kuò)增曲線彼此平行同時(shí)擴(kuò)增梯度稀釋的同一樣品〔濃度〕擴(kuò)增曲線循環(huán)數(shù)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系Cq熒光定量PCR——根本原理未知濃度樣品Cq

=-klgX0+b

標(biāo)準(zhǔn)曲線：區(qū)別：普通PCR：可以粗略定出反響結(jié)束時(shí)終產(chǎn)物的量-半定量熒光定量PCR儀：可以精確測(cè)量出初始模板量熒光定量PCR——熒光染料和探針?lè)翘禺愋缘臒晒馊玖?/p>

SYBRGreenI

特異性的熒光探針

TaqMan

SYBR-GreenI5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission非特異性熒光染料–SYBR-GreenSYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission非特異性熒光染料–SYBR-Green融解曲線分析〔Tm〕非特異性熒光染料–SYBR-GreenTm：50%的DNA產(chǎn)物解鏈時(shí)的溫度一種DNA片段只有一個(gè)特定的Tm，所以通過(guò)溶解曲線分析，可以檢驗(yàn)擴(kuò)增的產(chǎn)物是否是目的片段Tm非特異性熒光染料–SYBR-Green應(yīng)用列舉：酵母菌檢測(cè)根據(jù)Tm值判斷是否是酵母菌RQSequenceSpecificProbes:Taqmanprobes5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation特異性熒光探針–Taqmanprobes

特異性熒光探針–Taqmanprobes

常用的標(biāo)記探針的染料：第一通道：FAM第二通道：HEX第三通道：Rox第四通道：CY5致病微生物：沙門(mén)氏菌金黃色葡萄球菌單核細(xì)胞增生李斯特氏桿菌腸毒素大腸桿菌阪崎腸桿菌彎曲桿菌〔禽類(lèi)〕肉毒梭菌志賀氏菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌副溶血弧菌創(chuàng)傷弧菌等均能把3-5天的檢測(cè)時(shí)間縮短到一天之內(nèi)特異性熒光探針–Taqmanprobes

單重和多重?zé)晒舛縋CR單通道〔單色〕：一個(gè)PCR管里只做一個(gè)基因定量〔多用SybrGreen〕雙通道〔兩色〕：一個(gè)PCR管里做兩個(gè)基因的定量多通道〔多色〕：一個(gè)PCR管里做三個(gè)以上基因定量常用FAMHEXPikoReal功能簡(jiǎn)介研發(fā)生產(chǎn)中心：位于芬蘭Espoo光源:5xLED壽命長(zhǎng)，終身無(wú)需更換，為qPCR實(shí)驗(yàn)提供持續(xù)，穩(wěn)定的激發(fā)信號(hào)無(wú)需使用ROX染料進(jìn)行光強(qiáng)校正探測(cè)器：CCD相機(jī)能同時(shí)快速收集整板多重?zé)晒庑盘?hào)數(shù)據(jù)高靈敏度PCR模塊：96孔半導(dǎo)體PCRPikoREAL的硬件系統(tǒng):功能：絕對(duì)定量雙探針?lè)℉RM法相對(duì)定量基因型分析熔解曲線分析選配模塊五通道四色：激發(fā)波長(zhǎng)(nm)發(fā)射波長(zhǎng)(nm)預(yù)校正的染料475–500520–550FAM,SYBRGreen515–535557–590HEX,YakimaYellow570–590615–650ROX,TexasRed600–640666–740Cy5475–500520–590單色通道，HRM通道一個(gè)反響管里最多可同時(shí)檢測(cè)4種不同的致病菌核酸儀器特點(diǎn)：1、硬件組合優(yōu)越，設(shè)計(jì)創(chuàng)新2、更加適合5-10ul小反響體系，成倍節(jié)省實(shí)驗(yàn)本錢(qián)3、小巧、快速、穩(wěn)定、安靜無(wú)聲

致病菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果分析檢測(cè)流程25g或25ml樣品＋225ml預(yù)增菌培養(yǎng)液，混勻，適宜的溫度下培養(yǎng)24小時(shí)取1ml培養(yǎng)液，參加裂解液，裂解細(xì)菌，釋放核酸〔45min〕配制標(biāo)準(zhǔn)品，PCR反響液，加樣〔30min〕定量PCR反響，查看并分析結(jié)果〔1.5h〕陰性：出結(jié)果報(bào)告陽(yáng)性：繼續(xù)用培養(yǎng)法驗(yàn)證結(jié)果兩天內(nèi)可出結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目

GB中的名稱(chēng)OXOID的英文名稱(chēng)OXOID的中文名稱(chēng)OXOID貨號(hào)規(guī)格沙門(mén)氏菌緩沖蛋白胨水（BPW）BufferPeptoneWater(ISO)緩沖蛋白胨水(ISO)CM1049B500gCM1049R2.5kgCM1049T5kg金葡菌10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯TryptoneSoyaBroth（Soybean

CaseinDigestMediumUSP）胰蛋白胨大豆肉湯（美國(guó)藥典中大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基）CM0129B500gCM0129R2.5kgCM0129T5kg大腸埃希氏菌O157：H7/NM改良EC肉湯ECBROTH(ReducedBileSalts)EC肉湯（減少膽鹽）CM0990B500g志賀氏菌GN增菌液GNBrothGN增菌液R453511100gR453512500gR4535142.5kgOXOID常用預(yù)增菌培養(yǎng)液：賽默飛咨詢熱線：800－810－51181、預(yù)增菌－按說(shuō)明書(shū)操作2、細(xì)菌裂解，配制反響液及上樣1〕細(xì)菌裂解：獲得待測(cè)樣品。2〕配制標(biāo)準(zhǔn)品：陰性對(duì)照樣品，陽(yáng)性對(duì)照樣品〔4個(gè)濃度〕3〕按檢測(cè)樣品量計(jì)算所需反響液的量4〕配制所需反響液，混合均勻5〕把反響液參加反響板，并分別在相應(yīng)的孔參加陰性對(duì)照樣品、陽(yáng)性對(duì)照樣品，待測(cè)樣品。以下操作均按照檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：檢測(cè)試劑開(kāi)放，可選擇各國(guó)產(chǎn)及進(jìn)口廠家試劑盒

以金黃色葡萄球菌的檢測(cè)為例1、樣品預(yù)增菌25g或25ml樣品＋10%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯37度，24小時(shí)金黃色葡萄球菌：StaphylococcusAureus(SA)

以金黃色葡萄球菌的檢測(cè)為例2、細(xì)菌裂解，樣品制備A、取1ml培養(yǎng)液，13000rpm離心2分鐘B、去上清液，參加100ulDNA提取液充分混勻C、沸水浴加熱10分鐘〔誤差不超過(guò)1分鐘〕D、13000rmp離心5分鐘，上清液備用〔樣品〕試劑盒：Liferiver金黃色葡萄球菌核酸檢測(cè)試劑盒〔熒光法〕生產(chǎn)商：上海之江生物科技貨號(hào)：DD－0041－023、梯度標(biāo)準(zhǔn)品配制A、內(nèi)部對(duì)照：取內(nèi)部對(duì)照品4ul，加36ul水，震蕩混勻后，3000rmp離心10秒，備用。B、10倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)品〔如只需出陰陽(yáng)性結(jié)果，那么無(wú)需配制系列濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品〕1〕取4只2ml離心管，分別標(biāo)記為：2、3、4、5〔濃度依次為：5×106、5×105、5×104、5×103拷貝/ml)。2〕各管中分別參加36ul水3〕取4ul陽(yáng)性對(duì)照品參加1號(hào)管中，震蕩混勻后取4ul參加2號(hào)管，2號(hào)管震蕩混勻后取4ul參加3號(hào)管。依此處理4號(hào)管。4、反響液配制1〔絕對(duì)定量法用)計(jì)算所需各反響液成分，按下表量參加2ml離心管，震蕩混合均勻絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品：5(5個(gè)濃度，可定量出未知樣品拷貝數(shù)〕陰性對(duì)照：1未知樣品：n〔n為未知樣品數(shù)〕成分需要量（ul）SA核酸熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)液（6＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（6＋n）×0.2ul×110％內(nèi)部對(duì)照（6＋n）×0.5ul×110％×110％是指多配10％，以補(bǔ)償配制和加樣過(guò)程中的損耗如每個(gè)樣品需要做2個(gè)或3個(gè)重復(fù)，那么在各算式后再乘2或3即可4、反響液配制1(陰陽(yáng)性判定法用)計(jì)算所需各反響液成分，按下表量參加2ml離心管，震蕩混合均勻，3000rmp離心10秒，備用。絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品：1(1個(gè)濃度，作為陽(yáng)性參照〕陰性對(duì)照：1未知樣品：n〔n為未知樣品數(shù)〕成分需要量（ul）SA核酸熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)液（2＋n）×17.5ul×110％酶（Taq＋UNG）（2＋n）×0.2ul×110％內(nèi)部對(duì)照（2＋n）×0.5ul×110％×110％是指多配10％，以補(bǔ)償配制和加樣過(guò)程中的損耗如每個(gè)樣品需要做2個(gè)或3個(gè)重復(fù)，那么在各算式后再乘2或3即可5、上樣A、取一片96孔Piko板，放入上樣輔助儀，每孔參加反響液18ulB、取裂解的樣品，參加un孔，每種樣品1孔；取稀釋號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)品，依次參加最后一列的孔中。在0孔中參加2ul水。unununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSunununununununununununununununSununununununununununununununun0樣品排列建議：S-陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、0–陰性對(duì)照、un–未知樣品

6、覆膜，離心，放入qPCR7、設(shè)置程序，點(diǎn)擊Run啟動(dòng)PCR反響編程雙擊桌面儀器圖標(biāo)，翻開(kāi)軟件2、點(diǎn)擊New，新建一個(gè)運(yùn)行文件，點(diǎn)擊Protocol，進(jìn)入程序編輯界面編程選中以上各步，可以修改，添加和刪除反響步驟點(diǎn)擊反白不需要檢測(cè)的染料，輸入反響體系。編程添加新循環(huán)添加溶解曲線檢測(cè)上下移動(dòng)或刪除反響步驟輸入或輸出反響程序開(kāi)始運(yùn)行程序添加一個(gè)反響步驟添加數(shù)據(jù)采集步驟編程參數(shù)修改左邊選中要修改的步驟，右邊相應(yīng)的框中修改溫度和時(shí)間如要修改升降溫速率，熱蓋溫度，點(diǎn)擊“AdvancedProperties〞點(diǎn)擊Run啟動(dòng)PCR反響狀態(tài)監(jiān)控電腦監(jiān)控隨時(shí)可以點(diǎn)擊HOME，回主界面編輯新程序，分析已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果?；蜻M(jìn)入PlateLayout進(jìn)行板式設(shè)置。8、板布局點(diǎn)擊PlateLayout，進(jìn)入板布局界面，定位樣品，輸入名稱(chēng)，確定樣品屬性。-程序運(yùn)行前，運(yùn)行中，運(yùn)行