組織芯片技術(shù)3

組織芯片技術(shù)組織芯片是由生物芯片開(kāi)展延伸而來(lái)的一種特殊的生物芯片技術(shù),是生物芯片重要的組成局部。生物芯片(biochip)是將大量特定核酸片段、多肽分子、細(xì)胞等按照一定的設(shè)計(jì)方案,通過(guò)微加工及微電子技術(shù)固定在載體(如硅片、玻片、尼龍膜等)的外表形成生物分子點(diǎn)陣。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和組織芯片。組織芯片(tissuechip)又稱組織微陣列(tissuemicroarray)技術(shù),是由Kononen等于1998年首先建立并報(bào)道,一般是將數(shù)十至上百個(gè)甚至更多小的組織整齊有序地排列在一張載玻片上而制成縮微組織芯片,即組織切片。組織芯片技術(shù)是以形態(tài)學(xué)為根底的分子生物學(xué)新技術(shù),可以做常規(guī)病理學(xué)的HE染色、各種免疫組織化學(xué)染色、組織化學(xué)染色、原位雜交、熒光原位雜交、原位PCR和原位RT－PCR等,可在同一張切片上高通量獲得組織學(xué)、基因和蛋白的表達(dá)信息,這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍涵括了整個(gè)生命科學(xué)中各個(gè)根底研究、臨床研究、應(yīng)用研究以及藥物開(kāi)發(fā)的相關(guān)領(lǐng)域,①選取所需蠟塊,常規(guī)切片做HE染色,顯微鏡下確定目標(biāo)區(qū)并做定位標(biāo)記。②采用組織打孔/陣列儀在受體蠟塊上打孔,并精確排成微孔陣列。③在做標(biāo)記的蠟塊上鉆取組織柱,按設(shè)計(jì)方案移到受體蠟塊上。④把設(shè)計(jì)好的蠟塊放入溫箱,根據(jù)蠟質(zhì),調(diào)定溫箱溫度,在半融狀態(tài)下取出,室溫冷卻,放入4℃冰箱中備用。⑤借助特定切片輔助系統(tǒng)—粘著包被帶卷片系統(tǒng),對(duì)組織芯片蠟塊連續(xù)切片。切片厚度2～3μm,一般可切片50～100張。1.組織芯片制備過(guò)程常見(jiàn)的分類方法:2.組織芯片分類①根據(jù)一張芯片上樣本含量的多少分為低密度芯片(<200點(diǎn))中密度芯片(200～600點(diǎn))高密度芯片(>600點(diǎn))目前國(guó)際上常用的TMA的標(biāo)本量多為60-100個(gè)，組織片的直徑在2mm左右。一般情況下，在直徑2mm的組織片上有約100000個(gè)細(xì)胞，而直徑0.6mm的組織片上僅有約30000個(gè)細(xì)胞②按組織來(lái)源分為人類組織芯片疾病組織芯片正常組織芯片胚胎組織芯片惡性腫瘤組織芯片良性腫瘤組織芯片其它疾病組織芯片動(dòng)物組織芯片預(yù)后組織芯片由治療前后的腫瘤組織組成，用于尋找與治療和預(yù)后有關(guān)的標(biāo)志物。腫瘤組織芯片多腫瘤組織芯片〔由多種類型腫瘤組成，用于腫瘤基因和/或相關(guān)基因的篩選〕腫瘤進(jìn)展組織芯片〔由不同開(kāi)展階段的腫瘤組織組成包括癌前病變、甚至正常組織〕應(yīng)用組織芯片技術(shù)研究的腫瘤范圍很廣,幾乎涉及全身,包括胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、腎癌、膀胱癌等

3.組織芯片的應(yīng)用〔1〕組織芯片在腫瘤學(xué)研究中的作用①不同組織來(lái)源腫瘤的相關(guān)基因表達(dá)狀況有學(xué)者采用組織芯片技術(shù),選用5種常用抗體(AE1/3、波形蛋白、CD45、結(jié)蛋白和S-100蛋白)對(duì)54例正常組織和60例腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了抗原檢測(cè),結(jié)果證實(shí)了大局部正常組織與腫瘤組織之間可表達(dá)相同的抗原,局部抗原具有特殊性。②同一腫瘤不同開(kāi)展階段的相關(guān)基因表達(dá)狀況

用前列腺不同階段的病變組織(良性前列腺增生、原發(fā)癌、轉(zhuǎn)移癌及激素治療失敗后的局部復(fù)發(fā)癌)制成組織芯片,對(duì)5個(gè)基因(男性激素受體基因、myc、erbB-2、細(xì)胞周期素D1、N-myc)進(jìn)行檢測(cè)分析,證明前列腺組織不同階段的病變具有一些相關(guān)的基因類型,轉(zhuǎn)移癌與myc基因擴(kuò)增有關(guān),激素治療失敗后的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移癌與男性激素受體基因擴(kuò)增有關(guān)。利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)(SP法)檢測(cè)40例原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)及其相應(yīng)癌旁、遠(yuǎn)離癌正常組織中Rb蛋白的表達(dá)情況,證明HCC的發(fā)生、開(kāi)展與Rb蛋白的缺失可能有關(guān)。③組織芯片與基因芯片聯(lián)合應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)基因,揭示未知的生物功能

對(duì)激素治療失敗的前列腺癌的病因?qū)W進(jìn)行cDNA芯片表達(dá)譜研究，并對(duì)高表達(dá)基因作了組織芯片驗(yàn)證，篩選到在前列腺癌激素治療失敗的樣本中顯著表達(dá)的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2，提示胰島素樣生長(zhǎng)因子可能是前列腺癌開(kāi)展過(guò)程中關(guān)鍵的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑?！?〕組織芯片在免疫組織化學(xué)質(zhì)量控制中的應(yīng)用可根據(jù)質(zhì)控的需要設(shè)計(jì)出各種不同組織芯片,同時(shí)對(duì)多種不同情況進(jìn)行檢測(cè),如抗體染色是否成功,染色的強(qiáng)弱情況,有沒(méi)有內(nèi)源性生物素的干擾等。北京友誼醫(yī)院病理科制備標(biāo)準(zhǔn)化組織芯片進(jìn)行免疫組化質(zhì)控測(cè)定

每張測(cè)試片中含9個(gè)組織芯,而每個(gè)點(diǎn)都代表不同的組織,陰性和不同程度的陽(yáng)性都包含在內(nèi),能充分反映染色質(zhì)量的優(yōu)劣。并且選用了含生物素高的肝和腎作為標(biāo)記點(diǎn),同時(shí)又可檢測(cè)使用生物素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室在免疫組化染色前是否滅活內(nèi)源性生物素左：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤CD20染色〔染色理想〕右：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤CD20染色〔染色太淺〕左：PR染色，由于未封閉內(nèi)源性生物素而導(dǎo)致肝細(xì)胞胞質(zhì)著色右：PR染色，由于未封閉內(nèi)源性生物素而導(dǎo)致腎細(xì)胞胞質(zhì)著色左：乳腺癌PR染色〔染色理想〕右：乳腺癌PR染色〔染色不理想〕利用組織芯片技術(shù)制作特殊染色陽(yáng)性對(duì)照的組織芯片,將陽(yáng)性對(duì)照的組織芯片與待檢測(cè)的組織裱在同一張玻璃切片上,進(jìn)行特殊染色〔3〕組織芯片技術(shù)在特殊染色陽(yáng)性對(duì)照中的應(yīng)用4.組織芯片的優(yōu)點(diǎn)〔1〕高通量利用組織芯片技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測(cè)120例胃粘膜病組織中13種細(xì)胞周期調(diào)控因子(Ubipuitin、p16、p21、p27、p53、p57、cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、CDK6)的表達(dá),僅用13張芯片就完成了全部實(shí)驗(yàn),并獲得了胃粘膜疾病中13種細(xì)胞周期調(diào)控因子表達(dá)的數(shù)據(jù)?！?〕高效性組織芯片因其體積小，信息含量高省時(shí)、省力、節(jié)約經(jīng)費(fèi)、節(jié)省試劑〔1～2周之內(nèi)可完成數(shù)千個(gè)組織標(biāo)本的數(shù)十個(gè)基因表達(dá)或蛋白分子的定位、定量、定性分析。是傳統(tǒng)病理學(xué)方法所需費(fèi)用的1/10～1/100〕可最大限度地利用有限的標(biāo)本資源,易于開(kāi)展交流及合作〔3〕平行性腫瘤微陣列/芯片技術(shù)采用同一標(biāo)準(zhǔn)選材、操作和判定結(jié)果,所得結(jié)果均一可靠〔4〕實(shí)驗(yàn)誤差小組織芯片可同時(shí)檢測(cè)一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況,能在一張切片上同時(shí)看到一個(gè)腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中的基因擴(kuò)增情況。它使分析成百乃至上千個(gè)腫瘤標(biāo)本中DNA、mRNA、蛋白質(zhì)的工作在最短的時(shí)間內(nèi)完成。組織芯片中的眾多組織都處在相同條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),因此較傳統(tǒng)的病理切片的實(shí)驗(yàn)誤差小。(5)用途廣泛既可用于根底研究,也可用于臨床研究?？捎糜诜肿釉\斷，預(yù)后指標(biāo)篩選、治療靶點(diǎn)定位、抗體和藥物篩選、基因和蛋白表達(dá)分析等。5.局限性〔1〕組織標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題檔案蠟塊組織的前期固定和處理不標(biāo)準(zhǔn),處理方法不統(tǒng)一,尤其是對(duì)某些特殊標(biāo)本的處理不夠準(zhǔn)確,使其存在一定程度的蛻變,往往會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。這些在對(duì)組織芯片進(jìn)行分析時(shí)就不能采用同一標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)價(jià)和分析,不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)定,更不利于實(shí)驗(yàn)科室間的信息交流與合作?！?〕芯片中組織標(biāo)本的代表性與基因芯片不同,組織芯片雖然也可制成高密度點(diǎn)陣，但其精確性并不與點(diǎn)陣數(shù)目呈完全正相關(guān)，主要問(wèn)題是取樣點(diǎn)小，在構(gòu)建腫瘤組織微陣列時(shí)所取樣本是否正確,并且由于腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性問(wèn)題，所取位點(diǎn)不能完全代表腫瘤的全貌。但根據(jù)對(duì)乳腺癌預(yù)后相關(guān)標(biāo)記物(ER、PR和HER2)的比照分析說(shuō)明,從組織塊獲取一個(gè)點(diǎn)與常規(guī)組織切片的符合率超過(guò)90.0%，而2