第四節(jié)微生物細(xì)胞工程

第四節(jié)微生物細(xì)胞工程微生物是一個(gè)相當(dāng)籠統(tǒng)的概念，既包括細(xì)菌、放線菌這樣微小的原核生物，又涵蓋菇類、霉菌等真核生物。由于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)迅速，實(shí)驗(yàn)操作方便，有些微生物的遺傳背景已經(jīng)研究得相當(dāng)深入?，F(xiàn)已在國(guó)民經(jīng)濟(jì)的不少領(lǐng)域，如抗生素以及其他發(fā)酵工業(yè)、污染防治與環(huán)境保護(hù)、滅蟲害與農(nóng)林開展、深開采與貧礦利用、資源保護(hù)與能源再生、種菇蕈造福群眾等方面發(fā)揮了非常重要的作用。第四節(jié)微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程是指應(yīng)用微生物細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平的研究和生產(chǎn)。具體內(nèi)容包括各種微生物細(xì)胞的培養(yǎng)、遺傳性狀的改變、微生物細(xì)胞的直接利用以及獲得微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物等。本節(jié)僅從細(xì)胞工程的角度，概述通過(guò)原生質(zhì)體融合的手段改造微生物種性、創(chuàng)造新變種的途徑與方法。第四節(jié)微生物細(xì)胞工程一微生物細(xì)胞融合二原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合三真菌的原生質(zhì)體融合四微生物細(xì)胞工程研究進(jìn)展一微生物細(xì)胞融合早在1958年，岡田善雄發(fā)現(xiàn)，用紫外線滅活的仙臺(tái)病毒可以誘發(fā)艾氏腹水瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生多核體。微生物細(xì)胞壁是細(xì)胞融合的一道天然屏障，要使不同細(xì)胞遺傳信息發(fā)生重組就需要除去細(xì)胞壁。不少人嘗試制備微生物原生質(zhì)體。一微生物細(xì)胞融合1972年，匈牙利Ferernczy等首先報(bào)道在微生物中的原生質(zhì)體融合，他們采用原生質(zhì)體融合技術(shù)使白地霉?fàn)I養(yǎng)缺陷型形成強(qiáng)制性異核體。1976年巨大芽抱桿菌、枯草桿菌、裂殖酵母等原生質(zhì)體融合取得成功，構(gòu)巢曲霉和煙曲霉、婁地青霉和產(chǎn)黃青霉等真菌種間原生質(zhì)體融合也獲得成功。〔一〕微生物細(xì)胞融合工藝菌種選擇擴(kuò)大培養(yǎng)大量菌體細(xì)胞①高滲溶液(SMM液、DP液)②脫壁酶(蝸牛酶、溶菌酶)原生質(zhì)體融合劑(PEG)原生質(zhì)體融合去融合劑融合原生質(zhì)體培養(yǎng)基細(xì)胞壁再生菌落繁殖融合體篩選〔二〕影響微生物細(xì)胞融合的因素微生物原生質(zhì)體融合受以下因素的影響：①參與融合菌株的遺傳性狀。參與融合的菌株一般都需要有選擇標(biāo)記，標(biāo)記主要通過(guò)誘變獲得。在進(jìn)行融合時(shí)，應(yīng)先測(cè)定各個(gè)標(biāo)記的自發(fā)回復(fù)突變率。假設(shè)回復(fù)突變率過(guò)高，那么不宜作為選擇標(biāo)記。②制備原生質(zhì)體的菌齡。制備細(xì)菌原生質(zhì)體應(yīng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期菌齡的細(xì)胞，因?yàn)榇藭r(shí)的細(xì)胞壁中肽聚糖的含量最低，對(duì)溶菌酶也最敏感。〔二〕影響微生物細(xì)胞融合的因素③培養(yǎng)基成分。細(xì)菌在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)對(duì)溶菌酶的敏感程度不一。培養(yǎng)用根本培養(yǎng)基比用完全培養(yǎng)基效果更好。④細(xì)胞的前處理。由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異，同樣是革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)溶菌酶的敏感程度也不一樣。芽孢桿菌對(duì)溶菌酶的敏感性大于棒狀桿菌。在棒狀桿菌制備原生質(zhì)體前，菌體前培養(yǎng)需要添加少量青霉素以阻止肽聚糖合成過(guò)程中的轉(zhuǎn)肽作用，從而削弱細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的抗性。二原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合細(xì)菌是最典型的原核單細(xì)胞生物，細(xì)胞外有一層成分不同、結(jié)構(gòu)相異的堅(jiān)韌細(xì)胞壁，形成抵抗不良環(huán)境因素的天然屏障。根據(jù)細(xì)胞壁成分的差異將細(xì)菌分成革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌兩大類。前者肽聚糖約占細(xì)胞壁成分的90％，而后者的細(xì)胞壁上除了局部肽聚糖外還有大量的脂多糖等有機(jī)大分子。由此決定了它們對(duì)溶菌酶的敏感性有很大差異。二原核細(xì)胞的原生質(zhì)體融合溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物、微生物細(xì)胞及其分泌物中。它能特異地切開肽聚糖中N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1，4糖苷鍵，從而使革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁溶解。由于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁組成成分的差異，處理革蘭氏陰性菌時(shí)，除了溶菌酶外，一般還要添加適量的EDTA(乙二胺四乙酸)，才能除去它們的細(xì)胞壁，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。〔一〕PEG融合示意圖〔二〕G+細(xì)胞融合的過(guò)程①分別培養(yǎng)帶遺傳標(biāo)志的雙親本菌株至細(xì)胞壁最易被降解指數(shù)生長(zhǎng)中期；②分別離心收集菌體，用高滲培養(yǎng)基制成菌懸液，以防止下階段原生質(zhì)體破裂；③混合雙親本，加適量溶菌酶，作用20~30min；④離心后得原生質(zhì)體，用少量高滲培養(yǎng)基制成菌懸液；〔二〕G+細(xì)胞融合的過(guò)程⑤參加10倍體積的PEG促使原生質(zhì)體凝集、融合；⑥數(shù)分鐘后，參加適量高滲培養(yǎng)基稀釋；⑦涂接于高滲選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。長(zhǎng)出的菌落很可能已結(jié)合雙方的遺傳因子，要經(jīng)數(shù)代篩選及鑒定才能確認(rèn)已獲得能穩(wěn)定遺傳的雜合菌株?！踩矴-細(xì)胞融合的過(guò)程革蘭氏陰性細(xì)菌，在參加溶菌酶數(shù)分鐘后，應(yīng)添加0.1mol/L的EDTA-Na2共同作用15~20min，那么可使90％以上的革蘭氏陰性細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)榭晒┘?xì)胞融合用的球狀體。盡管細(xì)菌間細(xì)胞融合的檢出率僅在10-5～10-2之間，但由于菌數(shù)總量十分巨大，檢出數(shù)仍是相當(dāng)可觀的。三真菌的原生質(zhì)體融合真菌主要包括單細(xì)胞的酵母類和多細(xì)胞菌絲類。降解真菌細(xì)胞壁、制備原生質(zhì)體是融合的關(guān)鍵。真菌的細(xì)胞壁成分較復(fù)雜，主要由幾丁質(zhì)及各類葡聚糖構(gòu)成纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，夾雜著少量的甘露糖、蛋白質(zhì)和脂類。因此可在含有滲透壓穩(wěn)定劑的反響介質(zhì)中參加消解酶進(jìn)行酶解，也可用蝸牛復(fù)合酶進(jìn)行處理，原生質(zhì)體的得率都在90％以上。此外還有纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、新酶等。三真菌的原生質(zhì)體融合真菌原生質(zhì)體融合的要點(diǎn)與前述細(xì)胞融合類似，多以PEG為融合劑，在特異的選擇培養(yǎng)基上篩選融合子。但真菌多為單倍體，只有形成真正單倍重組體的融合子才能穩(wěn)定傳代；雜合雙倍體和異核體的融合子遺傳特性不穩(wěn)定，需經(jīng)多代考證才能最后斷定是否為真正的雜合細(xì)胞。三真菌的原生質(zhì)體融合〔一〕酵母的原生質(zhì)體融合〔二〕霉菌的原生質(zhì)體融合融合技術(shù)要點(diǎn)〔一〕酵母的原生質(zhì)體融合〔一〕酵母的原生質(zhì)體融合〔一〕酵母的原生質(zhì)體融合〔二〕霉菌的原生質(zhì)體融合簡(jiǎn)要介紹霉菌〔絲狀真菌〕原生質(zhì)體融合的根本方法，種內(nèi)和種間原生質(zhì)體融合和融合產(chǎn)物的生化遺傳分析，以及原生質(zhì)體融合在工業(yè)上的應(yīng)用。1.霉菌原生質(zhì)體融合方法2.種內(nèi)原生質(zhì)體融合1.霉菌原生質(zhì)體融合方法〔1〕親株的選擇和標(biāo)記：由于原養(yǎng)型親株特性的多樣化，選擇不同特性的親株進(jìn)行融合很有必要，例如：選擇一株高產(chǎn)(或優(yōu)質(zhì))、孢子形成率少或生長(zhǎng)速率緩慢；與另一株低產(chǎn)(或劣質(zhì))、孢子形成率多或生長(zhǎng)速率快的兩菌株進(jìn)行融合，很有希望獲得高產(chǎn)(或優(yōu)質(zhì))和孢子形成率多或生長(zhǎng)快速的融合產(chǎn)物。融合親抹的標(biāo)記，對(duì)檢出融合產(chǎn)物及其精確的遺傳分析是必不可少的。常用的選擇性標(biāo)記，有營(yíng)養(yǎng)缺陷和藥物抗性非選擇性標(biāo)記，有菌落形態(tài)、孢子顏色和特定代謝產(chǎn)物的量或質(zhì)等?！?〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)①原生質(zhì)體別離：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的菌絲體，置于添加外源溶菌酶的高滲穩(wěn)定劑溶液中酶解脫壁，別離并純化原生質(zhì)體。例如有效溶解產(chǎn)黃青霉或頂頭孢霉的菌絲壁的多糖酶——纖維素酶、蝸牛酶、溶解酶L1等，用量為在0.1%~1.0%之間，于30~33℃處理1~4小時(shí)；用0.7M氯化鈉或0.6M硫酸鎂作高滲溶液穩(wěn)定保護(hù)原生質(zhì)體。在此高滲穩(wěn)定溶液中酶解脫壁，通?？色@得高產(chǎn)率的原生質(zhì)體?！?〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)②原生質(zhì)體再生：所謂再生，即脫壁的球狀原生質(zhì)體，在高滲穩(wěn)定的再生培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)細(xì)胞壁，并形成菌絲或菌落?！?〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)③滅活原生質(zhì)體融合：用熱、藥物和紫外線處理，使一方或雙方都滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。用產(chǎn)黃青霉的一方原生質(zhì)體融合前先經(jīng)紫外線照射滅活后與另一方活的原生質(zhì)體融合，可提高其融合頻率5~10倍。推測(cè)紫外線滅活原生質(zhì)體一方或雙方，誘導(dǎo)遺傳物質(zhì)的單向傳遞或是致死損傷互補(bǔ)，而紫外線照射是否能引起附加突變而影響遺傳分析，這些問(wèn)題至今未見報(bào)道。〔2〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)④原生質(zhì)體與脂質(zhì)體融合：青霉素產(chǎn)生菌突變阻斷三肽前體的生物合成，這種不產(chǎn)生青霉素突變型原生質(zhì)體，與包裹著α-三肽的脂質(zhì)體相混合，用PEG誘導(dǎo)融合，融合產(chǎn)物可產(chǎn)生較大量青霉素。脂質(zhì)體可作為遺傳物質(zhì)和其他生物活性化合物或代謝中間物的載體，通過(guò)與原生質(zhì)體融合而傳遞?！?〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)⑤融合產(chǎn)物的選擇：間接選擇法是將融合原生質(zhì)體涂布于CM上生長(zhǎng)，再影印于MM或選擇性MM上，由于多數(shù)融合原生質(zhì)體在核融合前就發(fā)生別離，成為兩親株標(biāo)記的別離子，少數(shù)菌落即為異核體并長(zhǎng)成二倍體。〔2〕原生質(zhì)體的別離、再生和回復(fù)直接選擇法是將融合原生質(zhì)體直接接種在MM或選擇性MM上，形成異核體，體內(nèi)核遷移融合形成二倍體，用理化因素處理二倍體孢子，發(fā)生核別離和重組，生成包括重組體在內(nèi)的高頻率別離子，對(duì)重組別離子的細(xì)胞大小，核數(shù)目和DNA含量，形態(tài)以及別離子標(biāo)記進(jìn)行簽定和分類。2.種內(nèi)原生質(zhì)體融合〔1〕異核體形成：營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記互補(bǔ)的原生質(zhì)體融合，導(dǎo)致異核體形成。異核體產(chǎn)量取決于融合頻率，Ca(NO3)2或CaCl2和低濃度PEG于pH那么可獲得優(yōu)良結(jié)果。異核體開展產(chǎn)物有以下幾種。①形成異核體和偶見的穩(wěn)定二倍體——曲霉和青霉屬的一些種是這種異核體的典型代表。②形成異核體和常見的短暫二倍體——頂頭孢霉在原生質(zhì)體融合中容易產(chǎn)生高頻率的異核體，但異核體極不穩(wěn)定，只別離到極少數(shù)雜合原養(yǎng)型茵落，二倍體階段相當(dāng)短暫，迅速發(fā)生染色體別離；赤霉素產(chǎn)生菌具有類似情況?！?〕原生質(zhì)體融合和重組原生質(zhì)體融合有低頻率的自發(fā)融合和高頻率的誘發(fā)融合，兩者相差幾個(gè)數(shù)量級(jí)。誘發(fā)融合是以等量原生質(zhì)體相混合，以CaCl2作高滲穩(wěn)定溶液(pH為7)，用PEG融合，取樣鏡檢，到達(dá)最高融合率時(shí)，離心洗滌除去大局部PEG-Ca2+。融合原生質(zhì)體接種到MM或選擇性MM平板上再生和回復(fù)成為正常細(xì)胞?！?〕原生質(zhì)體回復(fù)細(xì)胞壁合成后立即發(fā)生細(xì)胞分裂，分裂幾代后，才能回復(fù)成為正常細(xì)胞形態(tài)。形態(tài)多樣化取決于各自細(xì)胞分裂方式。當(dāng)細(xì)胞分裂受到干擾時(shí)，會(huì)出現(xiàn)各種畸變形態(tài)的細(xì)胞；不受干擾的細(xì)胞分裂，將回夏成為正常細(xì)胞。所有回復(fù)體細(xì)胞都能保持穩(wěn)定的傳代。不管近親或遠(yuǎn)親的種間原生質(zhì)體融合，其頻率比種內(nèi)約低5個(gè)級(jí)數(shù)。融合產(chǎn)物及其性質(zhì)可能有以下幾種情況：①形成異核體和二倍體：構(gòu)巢曲霉和皺孢曲霉，其融合產(chǎn)物表現(xiàn)為構(gòu)巢曲霉種內(nèi)融合產(chǎn)物的各種特性。②形成異核體和異倍體：首先形成異核體，異核體狀態(tài)穩(wěn)定，繼那么核融合。婁地青霉和產(chǎn)黃青霉融合可得到三種生長(zhǎng)緩慢的原養(yǎng)型菌落，第一種菌落形態(tài)正常，在CM上有選擇地產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷的婁地青霉孢子；第二種菌落是由松散網(wǎng)狀菌絲組成的異常形態(tài)，在CM上亦產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)缺陷的婁地青霉孢子。第三種菌落，在MM上形成大的原養(yǎng)型孢子。而用產(chǎn)黃青霉培養(yǎng)條件的三種菌落都能產(chǎn)生與產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生一祥的青霉素，第一和第二種菌落是異核體，第三種菌落是異倍體或局部異倍體。③形成局部異倍體：構(gòu)巢曲霉和煙曲霉融合，種間融合頻率比種內(nèi)至少低5個(gè)級(jí)數(shù)。異核體或完全異倍體狀態(tài)極短，故別離不到，異