甘藍(lán)型油菜抗菌核病的遺傳研究及其基因定位

甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL油菜菌核病是由腐生性真菌(necrotrophicpathogen)核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引發(fā)的，是世界范疇內(nèi)多個作物的病害，也是我國油菜三大病害(菌核病、根腫病和病毒病)之首。我國油菜主產(chǎn)區(qū)特別是長江中下游油菜重要產(chǎn)區(qū)發(fā)病嚴(yán)重。油菜對菌核病的抗性由多基因控制，易受到環(huán)境和其它因素的影響。同時由于缺少抗性資源和精確可靠的鑒定辦法，油菜抗菌核病的研究進(jìn)展緩慢。因此，尋找可靠的鑒定辦法，運用分子生物學(xué)技術(shù)手段定位油菜抗菌核病的數(shù)量性狀位點(QTL)，對揭示油菜品種的抗菌核病機理、標(biāo)記輔助選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病的油菜品種含有重要意義。本研究運用來自雙低油菜品種華雙5號和自選材料甲7005兩個親本雜交F1代衍生的的DH(doubledHaploid)群體，在苗期以及成株期進(jìn)行了抗菌核病的表型鑒定，各生育期抗性鑒定辦法比 苗期抗性鑒定比較了活體葉片菌絲塊接種、離體葉片菌絲塊接種、葉柄接種方法和子葉接種法；成株期采用終花期菌絲塊鑒定。這些辦法都能顯示群體間抗感病差別明顯。苗期2種接種辦法不存在明顯有關(guān)性，成株期接種辦法和苗期離體葉片接種辦法明顯有關(guān)，成株期接種辦法和苗期活體葉片不存在有關(guān)。甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的性狀在不同生育期不同接種鑒定辦法中均體現(xiàn)出正態(tài)分布，抗(耐)菌核病性狀在家系間的表型差別達(dá)成極明顯水平?？?耐)菌核病性狀在不同年份相似生育期相似接種辦法之間達(dá)極明顯有關(guān)：抗(耐)菌核病性狀在不同生育期不同接種辦法之間的有關(guān)性也達(dá)極明顯水平。甘藍(lán)型油菜抗菌核病的0TL對和2年2種接種鑒定辦法的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行0TL2年成株期重復(fù)檢測到的QTL位點有1個，位于C6連鎖群上的同一種位點。種不同的鑒定辦法重復(fù)檢測到的0TL位點有2個，分別位于A3和A9華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011Sclerotinia(stemrot)disease，causedbynecrotrophicpathogenSclerotiniasclerotiorum(Lib．)deBary，isaworldwidediseaseofmanycrops，andthetoponeofthethreemajordiseases，includingSclerotiniasclerotiorum，elubrootandvirusdiseaseinoilseedrape(Brassicanapus)．ThisdiseasespreadseriouslyintheYangtzeRiverAreaofChina，themainrapeseedproducingarea，causingsevereeconomiclosses．GeneticstudieshaveindicatedthatresistancetoSclerotiniaispolygenic，andvulnerabletoenvironmentalandotherfactors．Becauseofthelackofresistanceandaccurateandreliableinoculationmethods，thedevelopmentofrapeseedresistantbreedinghasbeenrestricted．Therefore，thesearchforareliableinoculationmethodandtheapplicationofmolecularbiologytechniquestolocateresistanceQTLsplayasignificantroleinrevealingthemechanismofresistancetoSclerotiniasclerotiorumandmarker-assistedbreedingofdiseaseresistantvarietiesofoilseedrape．Inthisstudy，resistantphenotypeandQuantitativeresistanceloci(QTL)toSclerotiniasclerotiorumWasidentifiedattheseedlingstageandmaturestageindoublehaploid(DH)populationsderivedfrommicrosporecultureofF1whoseparentswereHuashuangNo．5andJia7005．Themajorresultswereasfollows：ComparisonofdifferentinoculationTheresistancetoSclerotiniasclerofiorumatseedlingstageWasvaluatedwi廿lfourmethods，includingplacingmycelialplugsonleavesofliveplants，detachedleavesassay，petioleinoculationtechnologyandcotyledonassay．TheresistancetoSclerotiniasclerotiommatmaturestagewasevaluatedbymycelialplugsinoculationmethodstems．AllthesemethodswereeffectiveforidentifyingresistantandsusceptibleTherewasnocorrelationbetweenthedetachedleavesassayandplacingthemycelialplugontheleavesofliveplants．Therewassignificantcorrelationbetweendetachedleavesassayandmycelialplugsinoculationmethodsatmaturestage．GeneticanalysisofresistancetosclerotiniasclerotioruminBrassicaAllofthetraitsofresistance(i．e．tolerance)toSclerotiniasclerotiorumindifferentgrowthstagesanddifferentinoculationmethodshadshownanormaldistributionthephenotypicdifferencesamonggenotypesreachedasignificantlevel．Thecorrelationofthephenotypewiththesameinoculationmethodindifferentyearswascorrelationbetweentheresistance(i．e．tolerance)toSclerotiniasclerotiorumingrowingstageandwithdifferentinoculationmethodsalsoreachedasignificantMappingQTLsconferringresistancetosclerotiniasclerotioruminWiththedataofresistanttraitscollectedfromdetachedleavesassayandmycelialpluginoculationmethodatmaturestagein2010and2011，32QTLsweredetectedwithaLODscoremorethan2．5inthetwoyearsinDHpopulations，locatingn甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTLlakeagegroupA1、A2、A3、A6、A7、A9、C6、C8．髓esingleQTLaccountedforphenotypevariationfrom3．73％to41．81％．Amongthem，nineQTLswgretotallydetectedbydetachedleavesassayin2010accountingforphenotypevariation3．73％to13．07％．FourteenQTLsweretomllydetectedbymycelialplugmethodatmaturestagein2010，accountingforphenotypevariationfrom81％．NineQTLsweretotallydetectedbymycelialplugatmaturestageinaccountingforphenotypevariationfrom2．91％toTherewasonecommonlocidetectedinlinkagegroupC6bymycelialplugandtheotherWaslocatedonlinkagegroupA9．Keywords：Brassicanapus；Sclerotiniasclerotiorum；Resistanceindentification甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTt菌核病是世界范疇內(nèi)多個作物的重要病害，菌核病是由腐生性真菌(necrotrophicpathogen)核盤菌引發(fā)的，能侵染75個科400多個植物物種，重要是雙子葉植物，涉及某些重要的經(jīng)濟作物：豆科作物(大豆、菜豆、豌豆)和油料作物(油菜、向日葵)(BolandandHall，1994)。核盤茵感染寄主植物后產(chǎn)生超敏反映(hypersensitiveresponse，HR)或細(xì)胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)，抵抗病原菌的侵入，反而有助于病菌的進(jìn)一步擴展(Kyoung，etal，)，這些特性近幾十年來，油菜菌核病日益嚴(yán)重。在我國的長江中下游和東南沿海油菜重要種植區(qū)，菌核病造成的產(chǎn)量損失10％一30％，重病區(qū)高達(dá)80％，同時造成油份含量和質(zhì)量減少(McCartnetetal，1999)?，F(xiàn)在已有多個方法控制菌核病的發(fā)生：例如栽培管理、化學(xué)辦法和品種本身的抗性。栽培管理能夠避免或減少茵核病病情，但是只靠栽培管理本身并不是抱負(fù)的控制方法?；瘜W(xué)辦法對于菌核病的控制效果也不甚理迄今為止，大量育種學(xué)家研究和田間實驗報道表明油菜沒有發(fā)現(xiàn)免疫和高抗的種質(zhì)資源，只有部分抗性或是耐病的育種品系(Zhao，)。篩選抗菌核病的油菜種質(zhì)資源，特別是篩選適于多個研究規(guī)定的抗病材料的鑒定辦法，是開展油菜抗菌核病遺傳育種研究的基礎(chǔ)。現(xiàn)在，分子標(biāo)記和QTL定位在多個作物(如大豆、菜豆、油菜、向日葵)中用來擬定核盤菌的抗性位點。但是，這些報道中的單個QTL只能解釋表型變異的--d,部分，并且依賴于測量環(huán)境，檢測到的QTL不穩(wěn)定，在不同的群體和不同的年份檢測到不同的QTL。近年來由于分子生物學(xué)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，油菜抗菌核病的研究獲得了某些進(jìn)展，國內(nèi)外研究者通過QTL定位和基因體現(xiàn)分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或分離出與抗性有關(guān)的基因，并獲得抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l葉柄鑒定辦法源于Zhao(、)提到的葉柄鑒定辦法。將4-5葉期的第三葉柄鑒定不用通過春化作用，周期短，辦法易于掌握，培養(yǎng)室內(nèi)可控制條件下不受自然環(huán)境干擾，適于大批量供試材料的接種鑒定，如種質(zhì)資源，育種低世代材料，初級抗(耐)病材料等的初級鑒定。但供試材料接種后發(fā)病程度較嚴(yán)重，對寄主本身破壞性大極大，供試寄主植株接種后普通無再運用價值，某些低抗(耐)材料在鑒定中由于病斑擴展至材料死亡將被裁減，高感和中感材料可能差別不明顯。草酸是核盤菌分泌的次生代謝產(chǎn)物，是核盤菌重要的致病因子。寄主植物對草酸的耐性程度決定了其對病原菌的抗(耐)性程度。草酸接種鑒定辦法重要參考劉勝毅(1991、)提出的接種辦法。其辦法是：3_4葉期的油菜幼苗，在主莖底部剪斷，將剪下的主莖放入裝有5ml濃度為40mMOA的試管中。浸染48h后，用分光光度儀在518rim光波條件下測量浸染后OA溶液的吸光度。通過吸光度的變化來衡量油菜對菌核病的反映。明顯特點是辦法簡樸、省力，可隨意調(diào)節(jié)草酸濃度，這是菌體接種所不及的。并且實驗過程操作簡便和周期短，節(jié)省時間，且所需空間很小，適于大規(guī)模品種群2甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL子葉接種重要參考HarshGarg()提出的接種辦法。菌落剛長至培養(yǎng)皿邊沿時，用8mm打孔器打取新生邊沿菌落，取7個菌絲塊放入75ml無菌PDB養(yǎng)(25。C，120r／min)。培養(yǎng)3天后將菌絲塊連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)入50ml4000r／min室溫離4],20min。用無菌ddH20清洗沉淀，于4000r／min室溫離4M0min，集沉淀，清洗2次；將清洗后的沉淀倒入無菌的150mlPDB培養(yǎng)基中，用食品攪拌器低速攪拌3min；攪拌均勻的菌絲懸浮液用4層紗布過濾；然后用血球計數(shù)板將菌絲濃選。Garg()研究表明子葉鑒定的重復(fù)性好，與田間病情調(diào)查數(shù)據(jù)有關(guān)系數(shù)高但現(xiàn)在國內(nèi)油菜對子葉鑒定的報道甚少，子葉鑒定體系尚不成熟。子葉接種周根據(jù)接種辦法不同，可分為終花期瓊脂塊接種、終花期牙簽接種(李強生，)、青角果期火柴棒接種(劉澄清，1991)以及花瓣接種辦法(Heran，1999)等，這些接種辦法的共同之處是接種于油菜莖桿。終花期將直徑5mm瓊脂菌絲塊貼于接種于第2片和第3片無柄葉節(jié)間，或是用醫(yī)用鑷子在離地面50cm的莖桿處打孔后插入帶菌牙簽，接種3天后測量菌斑，以菌斑大小反映油菜對菌核病的抗(耐)性。青角期在莖桿距地面20～25cm處用電鉆鉆孔，然后把帶菌火柴棒接種體插入孔中，接種后觀察病斑沿莖桿的擴展?fàn)顩r。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011植株群體冠層形成的田間小氣候。并且成株期接種要通過春花作用，周期長。接種后需要噴霧保持，田間濕度不均勻會造成測量時抗病差別。牙簽接種接種會在植株莖上產(chǎn)生人為創(chuàng)傷，其外部防御系統(tǒng)受到破壞，使寄主的抗侵染和抗擴展能力有所(李強生，胡寶成，等，)。但是成株期鑒定成果與田間自然發(fā)病的正有關(guān)性明顯，能較好的反映自然條件下田間菌核病的發(fā)病狀況。核盤茵重要通過感染核盤菌子囊孢子的花瓣落在植株莖、葉上來侵染植株?；ò杲臃N理論上是一種很好的辦法，模擬田間自然發(fā)病狀況。對于避病型而言，費維新()通過3年對油菜重要栽培種的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)：花期晚的油菜品種感病幾率較大。易倒伏油菜抗(耐)病性差，株型緊湊、株高較高的油菜發(fā)病幾率較大。傅壽仲等(1993)病圃觀察表明，甘藍(lán)型油菜無花瓣品系的發(fā)病率較常規(guī)對照品種減少80％，由于花瓣消除后可形成形態(tài)避病，消除病原菌傳輸媒介。另首先花瓣消除后，植株中下部的透光率較常規(guī)品種增13185％以上，氣溫增加0．1—2．7。C環(huán)境的改善能形成“生態(tài)避病"。陳大倫()以育成的無花瓣油菜與有花瓣油菜采用病圃自然鑒定和人工接種鑒定進(jìn)行對比實驗。成果表明：在自然病圃條件下，無花瓣品系的葉片受侵染率明顯低于有瓣品種，成熟期無花瓣品系菌核病危害程度均比現(xiàn)在公認(rèn)的抗(耐)茵核病能力較強的對照品種輕或相稱，比抗性較差的雜交油菜品種危害更輕：但人工接種鑒定表明，無瓣品系的病斑擴展速度均較抗性較強的有瓣抗(耐)茵核病能力較強的對照品種快?？梢?，即使無瓣品系本身并不含有較強的抗(耐)病性，但在花瓣消失后，其形態(tài)避病作用非常明顯。陳玉卿(1994)通過田間調(diào)查表明不同類型油菜田間抗菌核病性的差別雖與花期氣候條件有關(guān)，但白菜型油菜抗性差是由于苔莖葉和無葉柄全抱莖著生，短柄葉半抱莖著生，帶菌花器脫落后極易卡在這兩組葉片的葉腋內(nèi)，加之葉腋常積水露，為子囊孢子萌發(fā)提供4甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL兩組葉不抱莖，柄較圓，葉腋不易卡住花器，也極少積水露，葉片其它部位發(fā)病危及莖桿現(xiàn)象較少，因此花期病株率雖高，但至成熟期病株率和病指數(shù)卻明顯低于白歐洲品種。Mei(2011)通過比較蕓薹屬的3個基本種和3個復(fù)合種共68個品系，發(fā)現(xiàn)中用葉柄鑒定在中油821(CK)，NingRS．1，Major,andRV289抗(耐)性種質(zhì)。趙建苷基因連鎖，在雙底油菜的選育過程中抗性基因丟失。CaixiaLi()在澳大利種質(zhì)Fanl68，F(xiàn)an028，Zhougyou．zaNo．8(中國)RR002，Ag．Spectrum，Oscar和品種中雙9號的核盤菌抗性好于對照一中抗品種中油821現(xiàn)有的冬油菜栽培品種的抗性比春油菜抗性好，但是冬油菜栽培品種遺傳背景相對較窄，沒有好的抗病性資源，因此含有較廣泛遺產(chǎn)背景的春油菜是較好的運用抗性遺傳與QTL抗性變異還是廣泛存在的．抗病品種的雜交實驗表明，菌核病抗性是能夠遺傳的、5()(抗)×DHBa0604(感)組合P1、P2、F1、BCl、BC2和F26個世代群體菌核病的抗性，通過主基因一多基因混合模型分析，牙簽接種3d的抗性受2對加性主基因+加性一顯性多基因控制；接種5d的抗性由2對加性一顯性一上位性主基因控制，顯性及顯性互作效應(yīng)明顯，無多基因修飾；接種3～5d的菌絲擴展抗性由2對加性一花瓣接種15d的抗性由2對加性一顯性一上位性主基因+加性一顯性一上位性多基因由于鑒定辦法的限制和抗性資源缺少，油菜抗菌核病QTL定位研究進(jìn)展比較緩慢，現(xiàn)在國內(nèi)外對于油菜菌核病QTL定位的報告較少，并且，這些報道中的單個QTL只能解釋表型變異的-d,部分，并且依賴于測量環(huán)境，檢測到的QTL不穩(wěn)定，在不同的群體和不同的年份檢測到不同的QTL。劉春林()通過RAPD標(biāo)記作圖，以F2單株的抗病性作為指標(biāo)，檢測到3菌核病有關(guān)的QTL，分別位于第4、8、14三個連鎖群上，解釋的變異分別為13．8％、和15．3趙建偉()以寧RS．1(抗病)與恢5200(感病)構(gòu)建的F2：3家系作為作圖群體，運用運用區(qū)間作圖法，檢測到7個QTLs。其中與甘藍(lán)型油菜苗期葉片的病抗性有關(guān)的QTLs3個，分別位于第15、14、12-Z．個連鎖群上，解釋的表形變異為27．2％、13．3％和14％。對成株期莖抗病性檢測到4個QTLs，分別位于4的抗病性(SRM)檢測到兩個效應(yīng)明顯的位點，分別位于第20和第6連鎖群上，解釋的變異分別為39．9％和30．7％；對莖干抗病斑擴展速度檢測到2個QTL，分別位于第3和第11個連鎖群上，解釋的表型變異為27．9％和17。4％。鎖群上，解釋的表型變異分別為23．2％、16．6％和13．6％。36甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL成株期花瓣法3種辦法，和兩年重復(fù)實驗，用復(fù)合區(qū)間作圖法共檢測到19個抗性，位于分別位于Nl、N2、N3、N4、N5、N9、N10、N12、N15、N19等10個不同連鎖群上，單個QTL解釋的表型變異為9．54％一42．17％。檢測到10個QTLs，其中苗期離體葉菌絲瓊脂塊接種檢NN3個QTLs，位于第5連鎖群的2個和位于第12個連鎖群上的一種，解釋的遺傳變異分別為41．51％、9．54％和10．18％；病圃埋菌核鑒定成株期抗性，終花期未檢測到抗性QTL，成熟前以病情指數(shù)為指標(biāo)在第15個連鎖群上檢測到一種QTL，解釋的遺傳變異為18．78％?；ò杲臃N法共檢澳JJN6個抗性QTLs，接種后10d在第15連鎖群檢測到1個QTL，解釋的遺傳變異為42．17％；接種后20d在5連鎖群檢測到1QTL9連鎖群檢NN2QTLs，解釋的遺傳變異分別為36．67％、13．75％、29．56％；成熟前病情指數(shù)在第12連鎖群檢測到2個QTLs，解釋的遺傳變異為14．88％、17．74％。苗期和成株期未檢測到共同的QTL。檢測N9個QTLs，牙簽接種后檢NN3個QTLs，分別為第3、5和第4連鎖群上，解釋的表型變異為16．38％、11．34％、24．69％：花瓣接種法檢測到6個抗性QTLs，分別位于第21、10、19連鎖群上，其中第1連鎖群上有3個QTLs。解釋的遺傳變異10．40卜24．79但是兩年的田間實驗成果顯示苗期抗性和成株期抗性以及兩年成株期抗性未檢測到Zhao和Meng等()運用部分抗性材料RV289與p1804(感病)性材料Major與Stellar(感病)構(gòu)建的DH系(分別標(biāo)記HUA群體和MS群體)群體，進(jìn)行葉柄鑒定辦法進(jìn)行抗菌核病的QTL定位，以sn(莖干病斑長度)和dw(萎蔫天數(shù))為衡量抗病指標(biāo)。在每個群體重復(fù)3次。在HUA群體中，3次重復(fù)檢NN7個與s11有關(guān)的QTLs，第一次重復(fù)檢測N6個與sll有關(guān)的QTLs，分別位于N2，N12，N14，N16，N19．其中N14上檢i貝tJN2個QTL位點；第二次重復(fù)檢NN2個與s11有關(guān)的QTLs，分別位于N5和N16上；第三次重復(fù)檢測到1個與sll有關(guān)的QTL，位于N16上。在N16上，三次重復(fù)都檢測到與sll有關(guān)的QTL。在HUA群體中，3次重復(fù)檢測到4個與dw有關(guān)的QTLs，分別位于N3，N12，N16，N19上。在MSi貝!JNQTI+，位于N3上，與s11和dw都有關(guān)。尹向瑞(，)--兩年內(nèi)成株期用3種接種辦法(36．06％，分布在N4、N7、N10、N12、LGl37華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011現(xiàn)免疫品種，但是存在部分抗病的品種或是品系。因此甘藍(lán)型油菜存在耐病性和避病性。油菜的避病性普通與開花期、株型有關(guān)。黃繼英(1990)系。表明：甘藍(lán)型油菜以上生分枝、始花期偏遲、直立型及來自西歐的品種，自然發(fā)病較輕；下生分枝、始花期偏早、倒伏嚴(yán)重及來自加拿大的品種發(fā)病較嚴(yán)重。張潔夫(1994)等通過田間自然發(fā)病調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同油菜種質(zhì)資源對菌核病的抗(耐)性隨著開花期的推遲而增強，不同類型種責(zé)問，群體開花期早的抗性差于開花期遲的。趙建偉()通過定位開花期的QTL，并比較開花期QTL與抗菌核病的QTL發(fā)現(xiàn)，雙低油菜的釋放使油菜菌核病的發(fā)病狀況日益嚴(yán)重，油菜育種學(xué)家通過田間自然發(fā)病調(diào)查發(fā)現(xiàn)油菜種子中硫苷含量低的品種對菌核病的抗性明顯減少。宋志榮()通過田間自然發(fā)病狀況分析發(fā)現(xiàn)高硫苷品系的病情指數(shù)均極明顯不大于低硫苷品系，但是高硫苷品系之間以及低硫苷品系之間的病情指數(shù)均無明顯差別．這表明油菜硫苷特性與植株對菌核病抗(耐)性呈正有關(guān)。Zhao()通過定位硫苷含量位點，并比較分析硫苷含量位點和抗菌核病QTL發(fā)現(xiàn)，位于第17個連鎖群上控制脂肪族硫苷含量的一種位點與苗期葉片抗性的QTL部分重疊，位于第7個連鎖群上控制3一吲哚甲基硫苷含量的位點與成株期莖干抗性的QTL部分重疊。有關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，硫苷含量與抗菌核病呈明顯正有關(guān)，硫苷含量低的品種抗菌核病能力明顯減少。即使在過去的研究中已經(jīng)定位到與抗菌核病有關(guān)的QTL，但是植物對菌核病抗性的分子基礎(chǔ)卻是知之甚少。由于擬南芥與蕓薹屬植物同屬十字花科，基因組的共線性程度高(油菜和擬南芥的蛋白質(zhì)編碼序列同源性8)并沒有商業(yè)化使用，因此研究者運用擬南芥全基因組的微陣列來研究油菜抗菌核病的基因體現(xiàn)圖譜，試圖解釋油菜抗菌核病的生化和遺傳基礎(chǔ)。趙建偉()用擬南芥全基因組微陣技術(shù)檢測部分抗性材料RV289與感病材料Stellar接種核盤菌后的莖干組織基因體現(xiàn)差別，通過基因體現(xiàn)圖譜分析發(fā)現(xiàn)差別體現(xiàn)的基因功效可能涉及致病性有關(guān)蛋白(PR蛋白)、與氧暴發(fā)有關(guān)的蛋白、蛋白激酶、分子轉(zhuǎn)運蛋白、細(xì)胞維持和發(fā)育有關(guān)的蛋白等。在部分抗病和感病兩種基因型中抗性反映體現(xiàn)為基因體現(xiàn)時間和數(shù)量上的差別。在兩種基因型中差別體現(xiàn)基因的數(shù)目都隨時間而增加，8甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTLYang()運用擬南芥寡核苷酸芯片技術(shù)研究油菜葉片接種核盤菌后的基因體現(xiàn)譜，發(fā)現(xiàn)與抗病有關(guān)的基因體現(xiàn)存在時間上的差別；種核盤菌后的材料明顯差異體現(xiàn)的基因功效可分為5類：細(xì)胞拯救和防御的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄因子、茉莉酸的生物合成和信號轉(zhuǎn)道、細(xì)胞壁有關(guān)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、其它轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這些結(jié)論與趙建偉基因體現(xiàn)研究的結(jié)論相吻合。家族，甘藍(lán)型油菜基因組由白菜基因和甘藍(lán)基因構(gòu)成，涉及大量的同源基因家族，WRKY、APETALA2(AP2)和MYB家族。在實驗的兩個品種中，編碼茉莉酸、乙烯、生物素合成途徑有關(guān)蛋白以及赤霉素降解有關(guān)蛋白基因誘導(dǎo)體現(xiàn)；另外編碼碳水化合物代謝和能量代謝(這些代謝能將碳轉(zhuǎn)化成三羧酸循環(huán)，并產(chǎn)生活性氧)有關(guān)蛋白的基因體現(xiàn)水平發(fā)生也變化；編碼參加芥子酸和苯基丙酸合成有關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄水平增加，表明次生代謝產(chǎn)物也是甘藍(lán)型油菜防御菌核病的成分。內(nèi)本身菌核病抗性基因體現(xiàn)的成果，因此可分離出植物本身菌核病抗性基因，并將其轉(zhuǎn)移到其它植物中以產(chǎn)生對核盤菌小種的抗性。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及油菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，許多學(xué)者已經(jīng)通過基因工程的手段來研究如何提轉(zhuǎn)化的抗性有關(guān)基因能夠分為4大類，第一類：分解病原菌，從而克制病原菌侵入和擴展的有關(guān)抗性基因，重要涉及幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因。第二類：抑9華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011制和分解病原菌分泌的次級代謝產(chǎn)物，從而克制病原菌的致病性，涉及草酸氧化酶基因和多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白基因。第三類：抗病有關(guān)信號通路轉(zhuǎn)錄因子，啟動抗性有關(guān)信號通路基因的體現(xiàn)，涉及WRKY、MAPKs、EIN3。第四類：其它抗性有關(guān)基因，重要是單鏈抗體的應(yīng)用。已知葡聚糖，幾丁質(zhì)是大多數(shù)病原真菌細(xì)胞壁的重要構(gòu)造成分，葡聚糖酶(glucanase)和幾丁質(zhì)酶(chitinase)能夠分解真菌細(xì)胞壁的這些重要構(gòu)造成分，從而克制病原菌的生長繁殖，因此人們試圖將幾丁質(zhì)酶基因和葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入油菜品種中以達(dá)成抗真菌病害的目的。幾丁質(zhì)酶基因已被Oppenheim(1992)和G-rison(1996)分別成功地轉(zhuǎn)到油菜和冬油菜中，并獲得抗性增強的植株，且田間對菌核病耐性較好的油菜株系構(gòu)成型體現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因。13-1，3一葡聚糖苷酶基因作為與植物防衛(wèi)體系親密有關(guān)的病程有關(guān)蛋白(PR)(a，b)運用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化辦法，將抗菌核病的13-1，3株，活體接種核盤菌，成果表明部分轉(zhuǎn)基因植株抗性比對照的明顯增強。陳雁某些研究表明真菌分泌的草酸是核盤菌重要的致病因子，草酸缺失突變體不具有致病性和產(chǎn)生菌核的能力。草酸分泌物能夠從幾個方面增加核盤菌的致病能力。草酸能夠酸化病菌感染部位，大多數(shù)真菌侵染過程中分泌的酶在低ph強，與鈣離子結(jié)合形成草酸鈣沉淀(Cessnaetal)，草酸作為菌核病擴展過程oxidase(草酸氧化酶)、oxalatedecarboxylase(草酸脫羧酶)、HydrogenPeroxid(過氧化氫)基因?qū)σ鸷瞬】剐暂^好?，F(xiàn)在在小麥、大麥中已分離出 oxidase基并將其轉(zhuǎn)入油菜中，能夠明顯提高油菜對菌核病的抗性(XiangbaiDong，cta1．1995)。轉(zhuǎn)入草酸氧化酶的甘藍(lán)型油菜中，抗病有關(guān)蛋白蛋白、水楊酸途徑有關(guān)蛋白等)基因的體現(xiàn)量比常規(guī)對照品種高(冀瑞琴，a、b)因，并克隆到38個BnWRKY甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL位子細(xì)胞核內(nèi)。油菜中這些轉(zhuǎn)錄因子受病原菌和激素的誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。但是現(xiàn)在只分離和克隆到轉(zhuǎn)錄因子，并未見其運用于抗病功效研究中。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen．a(chǎn)ctivitedproteinkin嬲es，MAPKs)是一類號通路，造成植株對殺生性真菌一核盤菌的感病性增強。HengYinetal()用寡成型體現(xiàn)，用植物激素茉莉酸解決后，上調(diào)體現(xiàn)，而用水楊酸和ABA差別。Western雜交分析成果發(fā)現(xiàn)，BnOIPK在短時間內(nèi)能被茉莉酸和寡殼糖誘導(dǎo)體現(xiàn)。從油菜品種中雙9號中分離克隆出MAPK4基因，過體現(xiàn)MAPK盤菌的生長，構(gòu)成型激活PDFl．2的體現(xiàn)，減少H202的產(chǎn)生，正向調(diào)節(jié)與茉莉酸信號轉(zhuǎn)道有關(guān)的抗性反映，明顯增強油菜對菌核病的抗性(Liu)，反義體現(xiàn)則減少近年來研究表明核盤菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶(oyaatrns，PG)在病菌感染植物過程中起非常重要作用，多聚半乳糖醛酸酶也是茵核病分泌的次生代謝產(chǎn)物，與草酸協(xié)同作用造成核盤茵侵染寄主植物。草酸能夠減少環(huán)境pH，為提高PG的酶活性及降解植物細(xì)胞壁發(fā)明有利條件，酸化了的細(xì)胞間層妨礙多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白(polygalacturonaseinhabitorPGIP)的活性(王心宇等)。大多數(shù)植物能編碼多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白基因，多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白能使病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶失活，從而制止病原茵的擴展。Hedegusetal()報道在油菜基因組中編碼最少16個BnPGIP基因，這些基因在病原菌浸染、機械損傷和信號分子誘導(dǎo)的體現(xiàn)各不相似，但是大多數(shù)的基因與核盤菌的浸染有關(guān)?，F(xiàn)在尚未見有關(guān)PGIP基因轉(zhuǎn)化油菜品種的報道。乙烯是植物氣體激素，它作為一種內(nèi)源信號分子，與水楊酸、茉莉酸等介導(dǎo)的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑互相作用，在植物抵抗病原茵侵染的防衛(wèi)反映中起著非常重要作用。乙烯不敏感轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因(ethyteneinsensitive3，EIN3)烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游元件，其作為轉(zhuǎn)錄因子啟動一系列轉(zhuǎn)錄級聯(lián)反映，從而激活乙烯誘導(dǎo)的防御有關(guān)基因體現(xiàn)。許李明()克隆分離到擬南芥EIN3在油菜中的同源基通過傳統(tǒng)育種手段或是生物技術(shù)手段實現(xiàn)的遺傳修飾，已經(jīng)成功地產(chǎn)生對菌核病抗性增強的油菜品種?，F(xiàn)在已有研究者采用一種新的技術(shù)來轉(zhuǎn)化油菜品種獲得菌核病永久抗性的轉(zhuǎn)化植株，這一技術(shù)重要集中在重組單鏈抗體的應(yīng)用上。wil1Jam華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011Yajima()從小鼠胰臟細(xì)胞中分離出菌核病特異性單鏈抗體，構(gòu)建重組體現(xiàn)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，接種離體葉片和植株莖干，成果表明病斑大小在轉(zhuǎn)基因植株中明顯不大于未轉(zhuǎn)化對照，轉(zhuǎn)基因植株對菌核病的耐性明顯增強。現(xiàn)在油菜抗菌核病的基因工程研究中，除MAPK基因外，大多是轉(zhuǎn)化外源的抗性基因，對于油菜內(nèi)源抗性基因轉(zhuǎn)化的研究有待進(jìn)一步提高。由核盤菌引發(fā)的油菜菌核病是油菜中最重要的病害，我國油菜生產(chǎn)過程中由菌核病引發(fā)的損失嚴(yán)重?，F(xiàn)在在油菜中沒有發(fā)現(xiàn)免疫或高抗品種，對菌核病抗性的遺傳規(guī)律尚不清晰。因此開展油菜抗菌核病的遺傳規(guī)律研究和QTL定位對于油菜抗菌核病育種含有重要的指導(dǎo)意義。本研究將開展下列方面的工作：1．比較幾個慣用油菜抗菌核病鑒定辦法的可行性和可靠性；2．對DH系群體進(jìn)行茵核病抗性鑒定，分析抗性遺傳規(guī)律；3．運用油菜遺傳連鎖圖基礎(chǔ)初步定位甘藍(lán)型油菜抗菌核病的QTL。上述研究將對進(jìn)一步認(rèn)識油菜抗(耐)菌核病的規(guī)律，鑒定抗菌核病的基因資源以及有效開展菌核病的抗性鑒定提供參考數(shù)據(jù)，可為油菜抗茵核病基因的精擬定位，揭示抗茵核病的遺傳規(guī)律以及抗菌核病的分子機制奠定基礎(chǔ)?！彼{(lán)犁油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL2抗性鑒定群體：從190個作圖群體中隨機挑選71蓉年3月播種于20cm直徑的白色顰料缽中，每個DH系材料種植6 病斑長度(SLL，stemlesionlength)作為抗性鑒定指標(biāo)。接種后每天觀察統(tǒng)計萎蔫華中農(nóng)業(yè)人學(xué)201l屆頒Ij圖1葉柄接種示意辦 圖2離體葉片接種示意辦Fig．1．DiagrammicsketchofpetioleFig．2．Diagrammicsketchofdetachedleavesinnoculationmethod innoculationmethod苗期離體葉片瓊脂塊接種法實驗材料于lO月播種于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜實驗田，隨機區(qū)組設(shè)計，三次重復(fù)。取7—8葉期健康新生II一卜片(普通為倒數(shù)第2片完全展開葉)，每個DII系材料選用健康1I．片片，重復(fù)次，選用葉片時注意葉片大小利節(jié)問位點盡量保持一敏。葉柄基部廠玎紗布保濕。將4。C保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化一次，繼代一次。菌落長至培養(yǎng)皿邊沿時，用8mm打孔器打取新生邊沿菌落接種于葉片的中上部并偏離主葉脈處，接種時菌絲塊菌絲面貼向葉片表面。接種后噴霧用塑料薄膜覆蓋保濕，放置于20℃暗室中(圖2)。44h和68h后分別測量菌斑直徑(垂直方向測量2次，計算而積)。苗期活體葉片菌絲塊接種中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜課題組玻璃溫室中進(jìn)行。將供試實驗材料播種于20cm直徑的塑料缽中，每個DH系材料6株。待實驗材料長至7-8葉期時，在倒數(shù)第2片完全展開葉上進(jìn)行接種鑒定，重復(fù)兩次。將4℃保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化一次，繼代一次。菌落長至培養(yǎng)皿邊沿時，用8mm打孑L器打取新生邊沿菌落接種于葉片的中上部并偏離主葉脈，用大頭針將瓊脂塊固定在葉片上，接種時菌絲塊菌絲面貼向葉片表面，然后噴霧用塑料薄膜保濕。44h和68h后測量菌斑(垂直方向測量2次，計算病斑圓面積和橢圓面積)。子葉接種子葉接種重要參考HarshGarg()提出的子葉接種辦法。菌落長至培養(yǎng)皿邊沿時，用8ram打孔器打取新生邊沿菌落，取7個8ram菌絲塊放入75mi無菌PDB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)(25℃，120r／min)。培養(yǎng)3天后將菌絲塊連同培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)入50ml離心管中，于4000r／min轉(zhuǎn)速下室溫離心20min。用無菌ddH。0清洗沉I．藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL淀，于4000r／min轉(zhuǎn)速下室溫離心lOmin，收集沉淀，清洗2次；將清洗后的沉淀倒入無菌的150mlPDB培養(yǎng)基中，用食品攪拌器低速攪拌3rain；攪拌均勻的菌絲懸浮液用4層紗布過濾；然后用血球計數(shù)板將菌絲濃度調(diào)制104片段／ml；用調(diào)節(jié)好的菌絲懸浮液浸染已經(jīng)完全展開的lO天左右大小的子葉，在每片子葉上用lOul移液器兩邊各接種lOul菌絲液。噴霧保濕。2天后測黽菌斑大小。以上過程均在人工氣候室中進(jìn)行。白天溫度22℃，夜間20℃，光照強度10001ux，光周期為16h／8h對濕度保持在75％。的已知抗性的品系或品種：華雙5號、甲7005、華雙5號和甲7005配制的F1、中將4℃保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化一次，繼代一次，用8mm緣菌落放于長lOcm、寬5cm的保鮮膜上，接種于50cm將菌絲塊固定，不要讓菌絲塊暴露于空氣中，噴霧保濕，并用紗網(wǎng)覆蓋。接種后4天開始調(diào)查病斑直徑，調(diào)查3次?？咕瞬TL后期的抗菌核病QTL定位由苗期離體葉片鑒定和成株期瓊脂塊鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行掃描，由于在上訴多個接種辦法的比較中發(fā)現(xiàn)，只有苗期離體葉片鑒定辦法和成株期瓊脂塊鑒定辦法穩(wěn)定性和重復(fù)性優(yōu)良，能夠用于抗蔭核病QTL定位。用SAS(version9．1．3)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和有關(guān)性分析。PROC程序用來進(jìn)行群體數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢測；PROCANOVA程序用來進(jìn)行單因素方差分析，分析各品種或家系間抗病差別性。PROCCORR程序用來分析多個鑒定辦法以及多個鑒定指標(biāo)之間的有關(guān)性；PROCGPLOT程序來做茁期離體葉片和成株期接種鑒定的線性回歸分析。華中農(nóng)業(yè)人學(xué)壩I3towilt)以及莖干病斑K度(SLL，stemlesionlength)作為鑒定鑒定指標(biāo)。接種后8h分生組織出現(xiàn)萎蔫黃化一_【二部組織癱軟，倒伏，整株萎蔫、黃化、死亡(圖4)圖3、葉柄接種后24h的病斑體 圖4、葉柄接種后48h的病斑體Fig．3．Typicalhypersensitiveofpetiole Fig．4．Thephenotype 24hpost—inoculation 但是由于接種后氣溫較高，空氣濕度較大，病斑擴展速度較快，在很短的時間內(nèi)病情快速暴發(fā)，抗性較差的家系材料全部死亡(圖四)。兩種鑒定指標(biāo)在實際操作過程中，無法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。在接種第3天大部分植株萎蔫死亡，不同的DH無法顯示出抗病差別。并且油菜植株在一種月大小時，呈現(xiàn)蓮座狀，主莖不明顯，無法測量主莖病斑長度。此種鑒定辦法在后續(xù)的研究中有待進(jìn)一步完善。用離體葉片鑒定辦法對71個DH家系進(jìn)行菌核病抗性鑒定，用病斑直徑、病斑面積(圓面積和橢圓面積)作為抗性鑒定指標(biāo)。接種后12h能夠在瓊脂塊大小范疇內(nèi)葉片背面觀察到褐色病斑，接種18h后能夠在瓊脂塊周制觀察到褐色病斑，在葉甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL養(yǎng)重要來自土豆培養(yǎng)基和腐爛的葉片組織。接種后44h大多數(shù)葉片病斑直徑范疇為2-6cm，接種后72h多數(shù)病斑已經(jīng)擴展到葉片范疇以外。44h和68h病斑方差分析顯示各家系間差別明顯，觀察和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)44h為比較適宜的病斑測量時間，此時家系間抗性差別明顯并且寄主植物有充足的時間啟動本身的抗病防御機制。苗期離體葉片鑒定分別以3種鑒定指標(biāo)(病斑直徑、病斑橢圓面積、病斑圓面積)進(jìn)行方差分析，方差分析顯示3種鑒定指標(biāo)在不同家系間的差別達(dá)極明顯水平(p<O．0001)。有關(guān)系數(shù)分析成果顯示，3種鑒定指標(biāo)之間存在明顯的一致性(表1)。2次重復(fù)間有關(guān)系數(shù)也達(dá)極明顯水平(表2)。表 離體葉片接種辦法3種指標(biāo)有關(guān)系數(shù)分Table1．CorrelationCoefficientsbetweenofthreeresistanceparametersindetachedleavesinoculationmethods。表達(dá)0．01明顯水平，一representsignificanceat0．01probability8’表達(dá)概 a)represent表2離體葉片2Table2．CorrelationCoefficientsbetweenoftworepuficationsindetachedleavesinoculationmethods重復(fù)橢圓面積 圓面積0．8039”0．7259 直徑0．2477。0．2499”0．2164 重復(fù)橢圓面積0．2426。0．2512。0．2163。二 圓面積0．2519”0．2540。0．2204”0．9925。 。表達(dá)0．01明顯水平，“representsignificanceat0．01probability 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l表3活體葉片鑒定2Table3．CorrelationCoefficientsbetweenoftworepulicationswith墅竺!壘壁堡璺壘!巳!壘竺i墜g磐!竺竺!i壘!壁望墮!旦!竺璺!重復(fù) 重復(fù)橢圓面 圓面 橢圓面。表達(dá)0．01明顯水平，”representsignificanceat0．01probability8’表達(dá)概 砷represent通過離體葉片鑒定分析發(fā)現(xiàn)，3種抗性鑒定指標(biāo)都能反映DH系對菌核病的抗性，但是在病斑擴展過程中觀察到：葉片受病原菌侵染后，菌絲沿葉脈方向的擴展速度要快于在葉肉內(nèi)的伸展速度，因此造成病斑的形狀如不規(guī)則橢圓形。用橢圓面積和圓面積來計算病斑擴展，更能反映出菌斑的真實形成過程。并且在離體葉片分析中發(fā)現(xiàn)3種抗性指標(biāo)有關(guān)性極高，都能反映葉片對茵核病的抗性，因此在活體葉片鑒定中采用面積作為抗性鑒定指標(biāo)。用活體葉片鑒定辦法對71個DH家系進(jìn)行菌核病抗性鑒定，用病斑直徑、病斑面積(圓面積和橢圓面積)作為抗性鑒定指標(biāo)。接種40小時后測量菌斑大小，方差分析顯示各家系間差別明顯(p<O．0001)，有關(guān)性分析能夠看出1次重復(fù)內(nèi)的2定指標(biāo)均達(dá)極明顯水平，但是2次重復(fù)間沒有有關(guān)性，表明活體葉片接種這種辦法能夠辨別各家系間的抗性差別，但是重復(fù)性差，鑒定辦法不能重復(fù)，可靠性差(表3)，不含有作為抗性QTL定位的鑒定辦法的條件。由于子葉接種辦法是一種新的嘗試，接種材料時選用已知抗性的品種或品系(在實驗材料中已經(jīng)列出)，而非上述幾個接種辦法中使用的DH系。接種后第二天甲7005出現(xiàn)褐色的壞死斑，但是斑點僅局限于子葉接種菌絲懸浮液的周邊。接種后第3天，大多數(shù)子葉出現(xiàn)壞死或水漬狀病斑，發(fā)病嚴(yán)重的子葉嚴(yán)重水漬化，子葉長滿白色菌絲，嚴(yán)重萎蔫。而對照品種中雙9號較抗品種則只是出現(xiàn)褐色壞死斑。由于子葉接種過程中，子葉面積小，茵絲擴展速度快，造成病斑經(jīng)常會擴展至子葉范疇外植株頂端分生組織的生長點，造成病斑大小無法測量。在接種過程中菌絲懸浮液的濃度較難控制，濃度稍大，病斑容易擴展至子葉范疇以外，菌液濃度稍薷型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL，’’’lll警1L圖5．子葉接種法接種3lesionsofvariousdiametersasassessed3dayspost-inoculationfollowinginoculationofBrassicanapuscotyledonswithwashedmaceratedmyceHumof存在周期短、室內(nèi)可控制條件下進(jìn)行、不受其它環(huán)境條件影響等優(yōu)點，并且從初步成株期接種分別于和 1年終花期進(jìn)行。接種后第2天菌絲開始侵以第一次測量病斑作為成株期莖干抗侵入指標(biāo)，以8天和4表4成株接種后7天3Table4．CorrelationCoefficientsbetweenofthreerepulicationsinmyceliali望旦!竺!璺!!竺望堡竺!塾竺堡苧!墊巳壁竺!：i望竺竺望!7d— 7d一”表達(dá)0．01明顯水平 一representsignificanceatO．Olprobability8’表達(dá)概 8’represent華中農(nóng)業(yè)人學(xué)201l屆碩l表5和2Table5．CorrelationCoefficientsbetweenoftwoyearsrepulicationsinmycelialpluginoculationmethodsin and20ll。表達(dá)0．01明顯水平，”representsignificanceatO．Olprobability4’表達(dá)概 8’represent年接種后第7天、第10天分別測量病斑(微推遲，重要是由于2011稍滯后)，以接種7d測量病斑作為成株期抗病菌侵入指標(biāo)，以第10天和第7發(fā)現(xiàn)3個重復(fù)間有關(guān)性達(dá)極明顯水平(表四)。和2將苗期離體葉片抗性鑒定成果和2011年成株期抗性鑒定成果進(jìn)行有關(guān)分析，成果顯示成株期莖干接種后不同時期測量的莖干病斑直徑與苗期葉片抗性存在明顯有關(guān)，但是成株期病斑擴展速度與苗期葉片抗性卻不存在明顯有關(guān)(表6)。甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL表6Table6．CorrelationCoefficientsbetweendetachedleavesinoculationmethodmycelialinoculation苗期圓面 苗期橢圓面苗期直 成株201l一7d 201l- 苗期直徑 成株201 0．22314。0．19883”0．23662 株0．19456”0．16914。0．20374。2011- 成株抗擴展0．79545”0．89595 。表達(dá)0．Ol明顯水平，“representsignificanceatO．01probability砷表達(dá)概 砷represent油菜菌核病抗(耐)親本與DH本研究中采用多個接種辦法、多個抗性指標(biāo)2年進(jìn)行抗性鑒定比較，試圖找到可靠的鑒定辦法。在抗性鑒定辦法的比較分析發(fā)現(xiàn)，苗期離體葉片鑒定和成株期鑒定能夠作為抗性O(shè)TL定位的鑒定辦法。在茵核病的遺傳分析和OTL定位中采用190個DH群體的離體葉片鑒定辦法和成株期鑒定辦法。片直徑大小從1．59cm到2．49cm，病斑橢圓面積大小從2．49cm2到5．74cm，病斑圓面積大小從2．37cm2-4．99cm2。成株期莖桿抗病性在接種7d后病斑長度從1．27cm10天，病斑的生長速度不同，從0．1cm到2．75cm 頻數(shù)1

_咽曲一墨病斑圓面積 鼠u誚H融冒目 2融22 頻1l 數(shù)頻l5 C日 1i：!i：{．(J{：j974H：j7f)n 口2 _融鼠鼠I_口2O

㈧—日

頻5國O 0．100．500．911．：{21．732．II201卜lOd病斑直徑 病斑擴展速度圖6抗病性在DHFig．6DistributionfrequencyofdiseaseresistanceintheDHpopulationsfI．omthecrossbetweenHuashuangNo．5andJia甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL表7親本及群體抗(耐)Table7Descriptivestatistiesofdeseaseresistanceintwoparentsand

1兩孺1—j性 年 辦 華雙5 甲 DH橢圓 離體葉 2．49-積圓面積 3 2．37- 直 1．59—成株 — 瓊脂 101．5 1．27—病斑 度 1．4 11擴 0．卜。表達(dá)0．01明顯水平，”representsignificanceat0．01probabilityDH采用2年2種不同的接種鑒定辦法和鑒定指標(biāo)對DH行有關(guān)分析，見圖7和表 -i—成株期菌絲塊接種后，4d病斑長度、6d病斑長度、8d病斑長度以及4—8d病斑擴展長度4種成株期抗性指標(biāo)，其中前3項作為植株抗侵染的指標(biāo)，4—8d病斑擴展速度作為植株抗擴展指標(biāo)。方差分析顯示這4項指標(biāo)在190個家系間都存在極明顯差別，4d病斑長度、6d病斑長度、8d病斑長度以及4．8d病斑擴展長度4項抗病指標(biāo)之間存在極明顯有關(guān)。苗期離體葉片接種的3項指標(biāo)：病斑橢圓面積、病斑圓面積、病斑直徑，這3項指標(biāo)在190個家系中存在極明顯差別，并且這3項指標(biāo)之間存在極明顯有關(guān)。2011年成株期菌絲塊接種7d斑長度、lOd病斑長度以及7．10d擴展長度均存在極明顯差別，并且7d和10d兩個不同時期以及病斑擴展之間存在極明顯有關(guān)。度之間均存在極明顯有關(guān)，但是的病斑長度與2011年病斑擴展速度在病斑(4dpi6dpi)(8dpi)在圖7中，以成株期7d、10d病斑大小和7．10d病斑擴展速度為例，進(jìn)行苗期和成株期病斑大小的回歸分析，由回歸分析成果能夠看出苗期病斑大小與成株期病斑直徑線性回歸明顯，而與病斑擴展速度線性回歸不明顯，這與有關(guān)系數(shù)分析成果吻合。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)20ll屆形!{坦 864一一年成株期J7(I病斑長度^星v

0 O苗期離體葉片病斑直釋 } 成棟期】_。皿病斑長度【_雪I)32l】_二c^一病斑擴展速度^呈：

O圖7Fig．7．Regressionanalysisbetweendetachedleavesandmycelialpluginoculationmethods表8DHTable8CorrelationCoefficientsbetweenofdifierentresistancecritirionanddifferentMy-6d成株期瓊脂塊接種后7天，meanssixdayspost．inoculationwithmycelialplugMy4—8d成株期瓊脂塊接種后4-8d擴展，meansfoursixdayspost-inoculationwithmycelialpluginc)DI-e離體葉片接種橢圓而積，meansthemeasureofareaofdeseaselesionellipsewithdetachedleavesmethodd)DI-c離體葉片接種圓面積，meansthemeasureofareaofdeseaselesioncirclewithdetachedleavesmethode)DI·l離體葉片接種病斑直徑，meansthediameterofdeseaselesionwithdetachedleavesmethod華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011234d病斑長度、6d病斑長度、8d病斑長度以及病斑擴展速度均存在明顯有關(guān)。苗期離體葉片接種鑒定的3項指標(biāo)與2011年7d、10d病斑直徑存在明顯有關(guān)，但是與7．10d病斑擴展速度不有關(guān)。以面苗期離體葉片接種鑒定與2011年成株期本實驗所用的遺傳連鎖圖譜由本實驗室蔡光勤師兄等人構(gòu)建。對406對SSR記的群體基因型分析，獲得473個標(biāo)記位點。用Mapmaker／Exp3．0連鎖分析，458個多態(tài)性標(biāo)記位點進(jìn)入連鎖群。構(gòu)成一張涉及19個連鎖群的甘藍(lán)型油菜分子標(biāo)記圖譜。該遺傳連鎖圖片全長1642．5cM，平均標(biāo)記間距3．6cM。復(fù)合區(qū)間作圖法檢測到的為了驗證抗菌核病基因型效應(yīng)的遺傳穩(wěn)定性，對2年2種鑒定辦法的各項指標(biāo)所得的實驗數(shù)據(jù)分別進(jìn)行QTL掃描分析(LOD>2．5)。圖7和表8列出了對苗期離體葉片抗病性和成株期莖干抗病性、莖干病斑擴展速度的全基因組QTL掃描的結(jié)果，2年內(nèi)2種鑒定辦法，共檢測到32個QTLs，分別位于AI、A2、A3、A6、A7A9、C6、C8連鎖群上。單個QTL解釋的表型變異為3．73％41．81％，其中有位于A1連鎖群上的4個QTLs是重疊的，都來自成株期接種鑒定4項指標(biāo)(4d、個QTLs(位于同一位點)有部分區(qū)段重疊。位于C8連鎖群上的位點有2甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL成株期瓊脂塊接種辦法檢測到的QTLs終花期采用成株期瓊脂塊接種法，以接種后4天、6天、8天的病斑長在A9連鎖群上都檢測到QTL，Zhao al()在C6連鎖群上也檢測到一種QTL4．8d病斑擴展速度檢測到2個QTLs，分別位于A7和C6連鎖群上，其中連鎖群上的QTL與4d、6d、8d在C6連鎖群上檢測到的QTL重疊。由此成果能夠看出，甘藍(lán)型油菜抗侵入和抗擴展指標(biāo)檢測到的QTL不同，抗侵入重要是病原菌與寄主植物的物理作用，而抗擴展重要是寄主植物體內(nèi)多個與抗病有關(guān)酶基因的體現(xiàn)。苗期離體葉片鑒定辦法檢測到的QTLs11月采用離體葉片接種辦法對190個DH群體進(jìn)行菌核病鑒定，以接種后44h病斑直徑、病斑橢圓面積、病斑圓面積作為抗性指標(biāo)。共檢測到9個OZLs，分別位于A3、A9、C8連鎖群上，解釋的表型變異3．18％一13．07％，其中位于A9群上的0TL位點最大，其加性效應(yīng)為0．73，表型奉獻(xiàn)率為13．07％，這與成株期鑒定的成果相似，都在A9連鎖群上檢測到一種奉獻(xiàn)率比較大的抗性位點，且在這一區(qū)段部分重疊；A3連鎖群上檢測到的位點與成株期接種后8d檢測到的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201lQTL位點重疊。來自親本華雙5號的抗性等位基因在在A3和C8上的位點對抗性起減效作用。其中病斑直徑為抗性指標(biāo)檢測到3個QTLs，病斑橢圓面積和圓面積為抗性指標(biāo)也都檢測到3個QTLs，都位于A3、A9、C8連鎖群上，位點與直徑為指標(biāo)檢測到的QTL大致相似，只是加性效應(yīng)和奉獻(xiàn)率略有差別。闡明苗期鑒定的3項指標(biāo)都能反映油菜對菌核病的抗性。2011年成株期瓊脂塊接種辦法檢測到的QTLs4月采用成株期瓊脂塊鑒定，以接種后7天、10天的病斑長度和的病斑擴展速度為抗性指標(biāo)進(jìn)行檢測到10個QTLs，分別位于A2、A6、A7、C2C6、C8連鎖群，解釋的表型變異幅度為2．9l％一41．6％。其中接種后第7為指標(biāo)檢測到3個QTLs，位于A2(SRMll．7-1)、A7(SRMll．7-2)、C6(SRMll．7-3)連鎖群上，解釋的表型變異分別為3．9896、2．91％和33．13％，位于C6連鎖群上的C6SRMll．7C-3位點最大，來自抗性親本甲7005的抗性等位基因?qū)剐云鹪鲂ё饔?，其它位點對來自抗性親本的抗性等位基因?qū)剐云饻p效作用。接種10天病斑長度為指標(biāo)檢測到5個QTLs，分別位于A2(SRMll．J仉J)、A7個QTL解釋的表型變異變幅為3．04％．41．06％，共解釋了56．11％的表型變異。其中A2、A7、C6連鎖群上的位點與第7天檢測的位點重疊，位于C6連鎖群上的SRMll．10．4位點最大，來自抗性親本甲7005的抗性等位基因?qū)剐云鹪鲂ё饔?，并且與年成株期抗性6d、8d以及4-8d病斑擴展速度檢測到的位點完全重疊。其它位點來自親本華雙5號的抗性等位基因?qū)剐云鹪鲂ё饔?，苗期抗性鑒定也在C8連鎖群上檢測到一種QTL位點，但是與10d病斑長度為抗性指標(biāo)檢測到的位點沒有重疊區(qū)段。接種后7d．10d病斑擴展速度為抗性指標(biāo)檢測到2個QTLs，分別位于(SRMll．7-10-1)和C6(SRMll．7-10-2)連鎖群上，單個QTL解釋的表型變異為．和32．44％。其中C6連鎖群上的位點與7d和1ld病斑長度檢測到的位點相似。從上述成果能夠看出，甘藍(lán)型油菜抗菌核病在接種早期和接種后期檢測到的抗性QTL不盡相似，接種后期寄主植物充足啟動本身的防御機制?？骨秩牒涂箶U展機制也不盡相似，抗侵入重要是病原菌與寄主植物的物理作用，而抗擴展重要是寄主植物體內(nèi)多個與抗病有關(guān)酶基因的體現(xiàn)。這一點與得出的成果吻合。不同年份的成株期鑒定檢測到的QTLs和在甘藍(lán)型油菜相似的生育期進(jìn)行成株期抗性鑒定，2甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL到一種共同的位點，位于C6連鎖群上。這一位點涉及6個QTLs，其中3個來自年成株期接種后6d、8d病斑長度和4—8d病斑擴展速度，另外3個來自7d、QTL不同鑒定辦法檢測到的QTLs2種不同的鑒定辦法(苗期離體葉片鑒定和成株期瓊脂塊鑒定)在兩年的實驗中檢測到共同的2個QTL位點，其中苗期離體葉片鑒定和成株期鑒定在A3和A9連鎖群上檢測到共同的QTLs，苗期離體葉片鑒定和2011年成株期鑒定各在C8連鎖群上檢測一種QTL位點，但是沒有重疊區(qū)段。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l屆碩一l：表9復(fù)合區(qū)間作圖法檢測出的抗性Table9PutativeQTLsdetectedbyCIMforresistancetoSelerotinia抗性指標(biāo)QTL|x．問標(biāo)記加性效心6)InoculationmethodsResistantMarker 8)QTLb’加性效應(yīng)，正值表達(dá)對抗性起增效作用的等位基因來自親本華雙5號，負(fù)值表達(dá)來源于甲7005引QTLsdesignatedusingthetraitsnameinitialsfollowedbyfewnumbers，numberswereusedtoindieatetheinoculationtime，the．量m．m棚叭鍶№舨刪mk吼甜m．量m．m棚叭鍶№舨刪mk吼甜mm嘴 withincreasing華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011 一”"似∞陽瞄∞似似∞私勉l}}粥∞∞耵舶 艘嘞一啪啡眺一一嘲眥一一百|(zhì)|§一吣一眺～ 眥}電8伯麓別碰筋嬲囂l淞積囂}黜黜l{；鏹舶囂j鼬∞黜黜固鼬盆I儆瞄刀礤BOF葛書 SS陌書 日貸 皓*鋤 gg $Sfl站 &Rg 孫由 BBj鰳吣S熟讎耄；；撕拋翻拼研剛姒；拿椰裁 ＆甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL伯搿i；llo

▲— 圖7和2種鑒定辦法檢測到的甘藍(lán)型油菜抗菌核病的Fig．7．Quantitativetraitloci(QTLs)forSclerotiniasclerotiorumresistancewithdetachedleaves(m)andmycelialpluginoculationmethodsinand華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l討表型鑒定的精確與否是影響甘藍(lán)型油菜遺傳分析和QTL甘藍(lán)型油菜抗菌核病表型鑒定的真實可靠性影響抗性QTLs的定位。現(xiàn)在對油菜抗菌核病鑒定的程序重要有兩大類：室內(nèi)可控制條件下的苗期鑒定和田間成株期鑒定。在我們的實驗中這兩大類辦法都進(jìn)行過嘗試和比較，多個鑒定辦法的優(yōu)缺點也在綜述部分進(jìn)行了論述。苗期接種鑒定辦法重要有：離體葉片鑒定、葉柄鑒定、草酸鑒定、子葉鑒定。Bradly()比較了離體葉片鑒定、葉柄鑒定、草酸鑒定幾個苗標(biāo)sll(sternlesionlength)無法測量，并且另一鑒定指標(biāo)dw(daytOwilt)并不能區(qū)Harsh()成株期的田間接種辦法，重要有菌絲瓊脂塊接種、花瓣接種、帶茵牙簽接種、青角果火柴棒接種、帶菌大麥粒接種等辦法。另外，尚有病圃埋菌核鑒定法和田間分生孢子懸浮液噴霧法等。劉勝毅(1999)論，溫室病圃鑒定法是一種能夠真實反映田間發(fā)病狀況的辦法。但是現(xiàn)在沒有大面積的溫室病圃供使用，對大量的群體鑒定時難以進(jìn)行，并且溫室病圃發(fā)病時對周邊環(huán)境規(guī)定較高，需要均一的溫度和濕度條件，環(huán)境的控制比較難以實現(xiàn)，對溫室的設(shè)立要去較高。費維新()采用人工接種鑒定和田間自然發(fā)病鑒定的辦法，比甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和OTL在本研究中成株期重要采用帶菌瓊脂塊接種法，該辦法與苗期離體鑒定都有一個共同點：以瓊脂塊作為核盤菌生長的介質(zhì)，為其提供生長所需的能量。瓊脂塊接種鑒定簡便易行，適合大規(guī)模的接種鑒定。缺點是在接種在田間進(jìn)行，不能人為的控制發(fā)病時溫度和濕度的均一性，受田間自然環(huán)境和小氣候的影響。并且接種時單個植株的長勢也不一致，致使發(fā)病和擴展的程度有所差別。在我們的實驗中，瓊脂塊接種鑒定能較好的辨別群體之間的抗病差別。田間自然發(fā)病重要是由于核盤菌通過感染了核盤菌子囊孢子的花瓣落在植株莖、葉上來侵染植株，我們能夠考慮通過檢測被子囊孢子感染的花瓣來擬定病害的發(fā)生程度。普通油菜初花期被子囊孢子感染的花瓣較少，而盛花期和終花期被感染的花瓣較多。支較多，菌絲基本上無重疊現(xiàn)象?？偠灾?，菌絲的活力以及濃度是很難擬定的。甘藍(lán)型油菜抗茵核病的遺傳基礎(chǔ)和QTL實存在相對抗性較強的品種，抗性變異也是廣泛存在的。對三大類油菜的抗病性研由于抗源的缺少，甘藍(lán)型油菜抗菌核病的育種進(jìn)程緩慢?，F(xiàn)在對油菜抗菌核病QTL分子標(biāo)記定位工作，報道的不多，在前面的綜述中已經(jīng)總結(jié)了現(xiàn)在QTL定位的研究工作。在本研究中，我們采用苗期離體葉片接種法和成株期瓊脂塊接種辦法鑒定了QTL華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l年成株期2年重復(fù)中，有1辦法和兩年重復(fù)中重復(fù)檢測到，推測這些抗性基因的體現(xiàn)與油菜生育期和組織特異性有關(guān)，不同生育期和接種組織部位的差別，都會造成檢測位點的不同。由于苗期離體葉片接種反映的是葉片的抗性，而成株期鑒定反映的是莖干的抗性，接種鑒定的時間也有差別，由此能夠推斷出甘藍(lán)型油菜對菌核病的抗性含有組織特異性和時和成株期瓊脂塊接種前期(6dpi)和接種后期(8．10dpi)的QTLs不盡相似，并且抗侵入和抗擴展為抗性指標(biāo)檢測到的QTLs者的互作以及環(huán)境條件的影響親密有關(guān)。在寄主植物發(fā)育的不同階段、接種的不同時期、不同部位、不同的接種辦法都有可能檢測到和抗性有關(guān)的不同基因。對菌核病的抗性更是如此，之因此這樣認(rèn)為，重要是基于下列2個方面的因素。①核盤菌寄主廣泛，可侵染400多個植物物種，是世界范疇內(nèi)寄主最廣泛的真菌病原菌之一，其感染寄主植物的分子機制現(xiàn)在尚不清晰的(Zhao，)。②在向日葵、大豆的抗菌核病研究中，普遍發(fā)現(xiàn)存在著復(fù)雜的抗性機理。Grezes—Besset(1994)研究向日葵的抗性機制，成果發(fā)現(xiàn)在莖桿和花序的抗性鑒定中分別檢測到不同的抗性基因，并且未見重復(fù)檢測到得基因。Mestries(1998)在向日葵抗菌核病QTL定位中，共檢測到的甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL6個與抗性有關(guān)QTLs，其中4個QTLs是控制葉片的抗性，2個QTLs控制柱頭的抗性，只有一種共同的QTL與葉片和柱頭的抗性都連鎖(這一研究成果與我們抗菌核病的定位成果相似)。從真菌病理學(xué)的角度來看，當(dāng)病原菌入侵寄主植物時，首先碰到的妨礙是來自 穿透釘(penetrationpegs)穿透油菜體表，在不同組織中穿透釘大小沒有差別，但是之間以及在細(xì)胞壁內(nèi)擴展(Huang)。而油菜在與核盤菌的協(xié)同進(jìn)化過程中，生華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2011指標(biāo)，這樣就克服了單運用病斑長度來考察材料抗感病程度的局限性。接種早期只能反映出病原菌與植物表面組織的互相作用這一物理過程，寄主植物表面角質(zhì)層的厚度和成分會發(fā)成細(xì)微的變化，此時病斑長度可能只是反映寄主植物表層的變化，利用此時的菌斑長度作為指標(biāo)考察抗病性并不能全方面的解釋植物抗侵入和抗擴展這兩個過程。只有當(dāng)茵絲侵入植物組織后來，才與組織內(nèi)的抗性有關(guān)酶互相作用，寄主體內(nèi)抗性有關(guān)基因體現(xiàn)，此時才體現(xiàn)出寄主植物分子和基因水平的抗性。因此運用病斑擴展速度考察材料抗病性更能真實地反映出菌絲與植物體內(nèi)的酶互相作用這一生理生化過程。QTL由于數(shù)量性狀在分離群體中呈現(xiàn)持續(xù)分布的特點，對數(shù)量性狀基因的定位重要采用統(tǒng)計學(xué)和遺傳學(xué)相結(jié)合的辦法進(jìn)行。現(xiàn)在慣用的數(shù)量性狀分析辦法有：單標(biāo)記分析法(ANOVA)、區(qū)間作圖法(IM)、復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)和完備區(qū)間作圖法不同的QTL作圖辦法各具特點。單標(biāo)記分析法的原理是通過測驗不同標(biāo)記基因型數(shù)量性狀均值的差別明顯性來擬定控制該數(shù)量性狀的QTL與否與標(biāo)記連鎖，如存在明顯差異，則表明可能存在一種與標(biāo)記相連鎖的QTL。由于其不需要構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖，辦法簡樸而被廣泛使用。區(qū)間作圖法、復(fù)合區(qū)間作圖法以及完備區(qū)間作圖法均是建立在完整的分子標(biāo)記連鎖圖的基礎(chǔ)，通過一維掃描全基因組逐點檢測QTL的存在，以兩個相鄰標(biāo)記位點間任一位置上存在QTL和不存在QTL的似然函數(shù)比值的對數(shù)，即(LOD)值的大小及其峰值的存在判斷任何一種位點的上存在QTL的可能性(Lander1989)?；荽筘S(1997)發(fā)現(xiàn)在同一明顯水平下，單因子方差即使難以標(biāo)定QTL的精確位置，但是分析發(fā)現(xiàn)QTL的能力可能是最高的，復(fù)合區(qū)間作圖法次之，區(qū)間作圖法最少，三種辦法的同一性仍然是最重要的。間作圖法無法精擬定位連鎖QTL，而復(fù)合區(qū)間作圖法則無法精擬定位互斥連鎖的QTL(李慧慧，)。在本研究中抗菌核病的QTL定位采用復(fù)合區(qū)間作圖法。甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和QTL此難以精確擬定LOD臨界值對應(yīng)的一次檢查和全局Q(犯假陽性錯誤的概率)，但一些非參數(shù)統(tǒng)計辦法已用于給定全局Q后LOD臨界值的擬定。Landerr1989)認(rèn)為LOD值的大小應(yīng)使檢測到的假陽性的QTL錯誤率(Q)不超出5％。普通認(rèn)為采用2-3的臨界值能夠把全局Q控制在5％以內(nèi)，在顯性QTL和互作QTL作圖中，似然比統(tǒng)計量有較大的自由度，還可適宜考慮采用較高的臨界值，如3—4。采用較高的LOD值能夠更加好地控制假Q(mào)TL的發(fā)生，同時遺傳效應(yīng)較小的真QTL卻不易被檢測出來(李慧)。在以往的作圖研究中，針對不同的作圖群體和研究的性狀，還沒有固定的LOD取值。在本實驗中，取LOD值為2．5作為QTL存在可能性的臨界值。由于本研究目的是通過對數(shù)量性狀的定位來增加對菌核病抗病性狀的選擇和標(biāo)記的輔助選擇的有效性，效應(yīng)小的QTL同樣重要。因此在QTL的初級定位研究中，取不太嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腖OD值作為檢測含有較小效應(yīng)QTL的定位參數(shù)亦是可取的(1)現(xiàn)在植物抗菌核病的分子和生化水平的抗性機理尚不明確，DH群體的成株期抗性如何，與否能真實的反映田間自然抗病反映?苗期抗性和成株期抗性與否存在有關(guān)性以及存在何種關(guān)系?其抗病特性與否真實的存在組織和時間體現(xiàn)的差別性?檢測到的抗性QTL有無差別?哪些抗性QTL是構(gòu)成型體現(xiàn)的?哪些抗性QTL是油菜發(fā)育時期特異體現(xiàn)的?哪些是受核盤茵誘導(dǎo)體現(xiàn)?以及這些QTL定位信息是如何的?都需要做進(jìn)一步研究。(2)菌核病的發(fā)生重要在油菜生育后期的成株期，例如盛花期、終花期和青角果期，因此，研究此發(fā)育時期的抗病特性更為重要，但是，如何優(yōu)化前人發(fā)明的成株期接種的弊端，如何找到適宜精確的接種辦法，是首要考慮的問題。(3)將本次檢測到的抗性有關(guān)QTL，特別是那些與前人定位研究中重復(fù)檢測到得QTL進(jìn)行序列對比和功效分析，即運用左右相近的標(biāo)記序列直接從基因組中分離目的片斷，對這些片斷進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對比前人研究的目的片段，以找到穩(wěn)定體現(xiàn)的QTL，并將其應(yīng)用(4)將本次定位到的那些對表型奉獻(xiàn)率較大的抗性QTL在次級作圖群體中進(jìn)行精細(xì)定位，然后將這些功效片斷分離克隆直至將抗菌核病有關(guān)基因分離、克隆以致應(yīng)用。(5)研究不同接種時間，不同接種部位，抗病有關(guān)基因的體現(xiàn)變化，結(jié)合本研究得到的抗性有關(guān)QTL定位成果做進(jìn)一步基因體現(xiàn)譜分析，以揭示甘藍(lán)型油菜與核盤菌互相作用的分子機理，為下一步的研究擬定候選基因。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)201l1993，2：4—費維新，李強生，陳風(fēng)祥，等．14護(hù)科學(xué)，，23(1)：254-甘藍(lán)型油菜抗(耐)菌核病的遺傳分析和OWL李強生，胡寶成，HA 科學(xué)Rimer，S．R．農(nóng)業(yè)科學(xué)，，37(14)：6378--伊向銳．甘藍(lán)型油菜抗菌核病0TL學(xué)張潔夫，陳玉卿，伍貽美，等．油菜種質(zhì)資源抗(耐)茵核病性篩選與鑒定．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994，(2)：26-28，24(3)：6—Bailey,DJ．ScreeningforresistancetoSclerotiniasclerotioruminoilseedrapeusingdetachedleaves．TestsAgrochem．Cult，1987，8：15