現(xiàn)代分子生物學(xué)第八章

現(xiàn)代分子生物學(xué)指導(dǎo)老師：楊林松演繹人：徐楸能1編輯ppt8.1真核基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)概念和一般規(guī)律

8.1.1基因表達(dá)的根本概念基因組：一個細(xì)胞或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因?；颍褐改墚a(chǎn)生一條肽鏈或功能RNA所必需的DNA片段。它包括編碼區(qū)和其上下游區(qū)域。以及在編碼片段間(外顯子)的間斷切割序列〔內(nèi)含子)基因表達(dá)：基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生具有特異生物學(xué)功能的蛋自質(zhì)分子或RNA分子的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控：受內(nèi)源及外源信號調(diào)控的這個調(diào)控的過程。2編輯ppt8.1.2真核基因的斷裂結(jié)構(gòu)

1.外顯子與內(nèi)含子現(xiàn)已證明大多數(shù)真核基因都是蛋白質(zhì)編碼序列和非蛋自質(zhì)編碼序列兩局部組成的〔表8-1〕。編碼序列稱為外顯子，非編碼序列稱為內(nèi)含子。在一個結(jié)構(gòu)基因中，編碼某一蛋自質(zhì)不同區(qū)域的各個外顯子并不連續(xù)排列在一起，而常常被長度不等的內(nèi)含子所隔離，形成鑲嵌排列的斷裂方式。所以真核基因有時被稱為斷裂基因。3編輯ppt許多情況下,高等真核基因核DNA序列中對應(yīng)于外顯子的局部可能還不到10%

圖8-1是哺乳動物二氫葉酸復(fù)原酶基因，全長25一31kb,但6個外顯子總長只有2kb。少數(shù)基因根本不帶內(nèi)含子。前尚不清楚內(nèi)含子的生理功能。某些基因完全除去內(nèi)含子以后，照樣可以產(chǎn)生有活性的mRNA;另一些基因，如SV40T抗原基因，一旦除去內(nèi)含子，成熟mRNA運(yùn)人細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的過程就完全被阻斷。

4編輯ppt研究發(fā)現(xiàn)，只有真核生物具有切除基閃中內(nèi)含子，產(chǎn)生功能型mRNA和蛋內(nèi)質(zhì)的能力，原核生物一般不具有這種本領(lǐng)。如果要在原核細(xì)胞里表達(dá)真核基因,必須首先構(gòu)建切除內(nèi)含子的重組基因，才有可能得到所研究的蛋白質(zhì)。5編輯ppt2.外顯子與內(nèi)含子的連接區(qū)真核基因斷裂結(jié)構(gòu)的另一個重要特點是外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)的高度保守性和特異性堿基序列。外外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)就是指兩者的交界或稱邊界序列，它有兩個重要特征：內(nèi)含子的兩端序列之間沒有廣泛的同源性，因此內(nèi)含子兩端序列不能互補(bǔ),說明在剪接加工之前，內(nèi)含子上游序列和下游序列不可能通過堿基配對形成發(fā)夾式二級結(jié)構(gòu)。外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)序列雖然很短，但卻是高度保守的，因此，該序列可能與剪接機(jī)制密切相關(guān)，是RNA剪接的信號序列。6編輯ppt序列分析說明，幾乎每個內(nèi)含子5’端起始的兩個堿基都是GT,而3’端最后兩個堿基總是AG,由于這兩個堿基的高度保守性和廣泛性,把它稱為GT-AG法那么，由于內(nèi)含子兩末端的序列不同，可定向標(biāo)明內(nèi)含子的兩個末端,根據(jù)剪接加工過程沿內(nèi)含子自左向古進(jìn)行的原那么，一般將內(nèi)含子5‘端接頭序列稱為左剪接位點，3’端接頭序列稱為右剪接位點,故將前者稱為供體位點，后者為受體位點。外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)的保守序列幾乎存在于所有高等真核生物基閃中，說明可能存在著共同的剪接加工機(jī)制。但是在線粒體基因和酵母tRNA基因中不存在這類保守序列，暗示存在不同類型的剪接過程。7編輯ppt3.外顯子與內(nèi)含子的可變調(diào)控在基因轉(zhuǎn)錄，加工產(chǎn)生成熟mRNA分子時，內(nèi)含子通過剪接加工被去掉，保存在成熟MRNA分子中的外顯子被拼接在一起，最終被翻譯成蛋白質(zhì)。因此通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用，該cDNA分子只含有外顯子，沒有內(nèi)含子。有些真核基因，如肌紅蛋白重鏈基因卻能精確地剪接成一個成熟的mRNA，我們稱這種方式為組成型剪接。一個轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組成型剪接只能產(chǎn)生一種成熟的mRNA，編碼一個多膚。但是，有不少真核基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過不同的剪接方式，產(chǎn)生不同的mRNA并翻譯成不同的蛋白質(zhì)。另外一些核基因在轉(zhuǎn)錄時選擇了不同的啟動子，或者在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上選擇不同的多(A〕位點而使初級轉(zhuǎn)錄物具有不同的二級結(jié)構(gòu).因而影響剪接過程，最終產(chǎn)生不同的mRNA分子。

8編輯ppt選擇性剪接：同一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于不同的剪接方式形成不同mRNA的過程。選擇性剪接的典刑例子：小鼠淀粉酶基因表達(dá)的組織特異性變化9編輯ppt在小鼠肝和唾液腺這兩種組織中，淀粉酶mRNA的編碼序列完全相同，但5‘端起始局部長度不同。事實上,L外顯子只是唾液腺淀粉酶基因中內(nèi)含子序列的一局部，將在mRNA成熟過程中被切除。有實驗證明，由S外顯子起始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是由L外顯子起始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的100倍以上。由于一個基因的內(nèi)含子成為另一個基因的外顯子，形成基因的差異表達(dá)，這是真核基因斷裂結(jié)構(gòu)的一個重要特點。10編輯ppt8.1.3基因家族真核細(xì)胞的DNA是單順反子結(jié)構(gòu)，很少出現(xiàn)置于一個啟動子控制之下的操縱子。真核細(xì)胞中許多相關(guān)的基因常按功能成套組合，被稱為基因家族。同一家族的成員有時緊密地排列在一起，成為一個基因簇;但更多的時候，它們分散在同一染色體的不同部位.甚至位于不同的染色體上。具有各自不同的表達(dá)調(diào)控模式。11編輯ppt1.簡單多基因家族簡單多基因家族中的基因一般以串聯(lián)方式相連?；蚪M分析說明，大腸桿菌中共有7個這樣的拷貝，每一個拷貝中只有tRNA基因的種類、數(shù)量和存在部位有些變化。12編輯ppt在真核生物中，前rRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為45S(約有1400個核苷酸)，包括18s、28s和5.8S三個主要分子。前rRNA分子中至少有100處被甲基化〔主要是核糖的2-OH甲基化)，初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也被特異性RN4酶切割降解。產(chǎn)生成熟rRVA分子。這個過程需要snoRNA的參與(圖8-4)5SrRNA作為一個獨認(rèn)的轉(zhuǎn)錄單位，由RNA聚合酶3〔而不是聚合酶I)完成轉(zhuǎn)錄。13編輯ppt果蠅tRNA基因家族具有兩個海膽組蛋白家族所沒有的特點：

在基因家族中含有3個tRNAlys

基因，而基因家族中的每個基因都單獨按各自的方向進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

2.復(fù)雜多基因家族復(fù)雜多基因家族一般由幾個相關(guān)基因家族構(gòu)成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉(zhuǎn)錄單位。海膽基因家族和果蠅tRNA基因家族〔以以下圖〕：14編輯ppt3.發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜多基因家族血紅蛋白是動物體內(nèi)輸送分子氧的住要載體，由2a2b組成的四聚體加血紅素輔基(結(jié)合鐵原子)后形成功能性血紅蛋白。所有動物物種中血紅蛋白基因的根本結(jié)構(gòu)都相同〔圖8-6〕.然而，在生物個體發(fā)育的不同階段，卻出現(xiàn)幾種不同形式的a和b亞基。15編輯ppt人a一珠蛋白基因簇位于16號染色體短臂上，占30kb左右.其中ξ為胚胎期基因〔表8-2〕。β一珠蛋自基因簇位于11號染色體短臂上.占50-60kb?！矆D8-7〕16編輯ppt不同發(fā)育階段血紅蛋白亞型17編輯ppt胚胎期類α-珠蛋自，最先以ξ2型出現(xiàn)。以后逐漸被ξ1型所取代。在胎兒期有兩類等分子數(shù)β型鏈。因此，胚胎型血紅蛋白中含有兩個ξ2型α鏈和兩個ξ2型β鏈。新生兒出生后,98%的血紅蛋白中含有兩個儀α2單位和兩個β亞單位，2%的血紅蛋白含兩個α2單位和兩個β亞單位。在每個基因家族中，基因排列的順序就是它們在發(fā)育階段的表達(dá)順序〔圖8-8〕。18編輯ppt8.1.4基因表達(dá)的方式和特點1.基因表達(dá)的方式根據(jù)對刺激的反響模式,可分為組成性表達(dá)和選擇性表達(dá)兩大類。某些基因在個體的所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，這些基因即為管家基因.其表達(dá)模式又被稱為組成性基因表達(dá)。管家基因通常具備以下特點:①細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝過程中所必需的基因,例如編碼rRNA、肌動蛋白、微管蛋白等的基因;②通常能夠保持較高的表達(dá)量。根據(jù)這些特點，實驗研究中常把rRNA、肌動蛋白或微管蛋白基因作為RT-PCR的對照。在特定環(huán)境信號刺激下，相應(yīng)的基因被激活，基因表達(dá)產(chǎn)物增加，這種基因稱為可誘導(dǎo)基因。而如果基因被環(huán)境信號所被抑制，這種基因就是可阻遏基因(repmssihlegene)?；虮磉_(dá)調(diào)控大多數(shù)是對這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯速率的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物的水平發(fā)生改變并影響其功能。19編輯ppt2.基因表達(dá)的時空特異性基因表達(dá)的時間特異性〔temporalspecificity),即按功能需要，某一特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按特定的時M順序發(fā)生。多細(xì)胞生物基因表達(dá)的時間特異性又稱階段特異性?；虮磉_(dá)的空間特異性,是指在個體生長過程中，某種基因產(chǎn)物按不同組織空間順序出現(xiàn)，基因表達(dá)伴隨時間順序所表現(xiàn)出的這種分布差異，實際上是由細(xì)胞在不同器官的分布所決定的。所以，空間特異性又稱細(xì)胞或組織特異性?？臻g特異性的基因表達(dá)也普遍存在于動、植物生長發(fā)育的各個階段，如果蠅胚胎發(fā)育中許多調(diào)節(jié)體節(jié)形成的基因表達(dá)均呈現(xiàn)出顯著的組織特異性?；虮磉_(dá)調(diào)控能夠維持細(xì)胞的增殖、分化，維持個體的生長、發(fā)育，有助于生物體更好地適應(yīng)外界環(huán)境變化。20編輯ppt8.1.5真核基因表達(dá)調(diào)控一般規(guī)律真核生物和原核生物在基因表達(dá)調(diào)控上的巨大差異是由兩者根本生活方式不同所決定的。原核生物一般為自由生活的單細(xì)胞，只要環(huán)境條件適宜，養(yǎng)料供給充分，它們就能無限生長、分裂，因此，它們的調(diào)控系統(tǒng)就是要在一個特定的環(huán)境中為細(xì)胞創(chuàng)造高速生長的根底，或使細(xì)胞在受到損傷時，盡快得到修復(fù)。它們主要是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以開啟或關(guān)閉某些基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境條件〔主要是營養(yǎng)水平的變化)。環(huán)境因子往往是調(diào)控的誘導(dǎo)物，群體中每個細(xì)胞對環(huán)境變化的反響都是直接和根本一致的。21編輯ppt主要步驟22編輯ppt真核生物(除酵母、藻類和原生動物等單細(xì)胞類之外〕主要由多細(xì)胞組成，每個真核細(xì)胞所攜帶的基因數(shù)a及總基因組中蘊(yùn)藏的遺傳信息最都大大高于原核生物，如人類細(xì)胞單倍體基因組就包含有3x10^9bP總DNA,約為大腸桿菌總DNA的800倍，是噬菌體總DNA的10萬倍左右！真核生物基因組DNA中有許多重復(fù)序列，基因內(nèi)部還常插入不翻譯成蛋白質(zhì)的序列，都影響了真核基因的表達(dá)。真核生物的DNA還常與蛋白質(zhì)(包括組蛋白和非組蛋白〕結(jié)合,形成十分復(fù)雜的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)構(gòu)象的變化、染色質(zhì)中蛋白質(zhì)的變化及染色質(zhì)對DNA酶敏感程度的變化等都會對基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響。23編輯ppt此外，真核生物染色質(zhì)被包裹在細(xì)胞核內(nèi)，基因的轉(zhuǎn)錄(核內(nèi)〕和翻譯(細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)〕被核膜所隔開，核內(nèi)RNA的合成與轉(zhuǎn)運(yùn),細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中RNA的剪接和加工等無不擴(kuò)大了真核生物基因調(diào)控的范圍，使真核生物基因調(diào)控到達(dá)了原核生物所不可能擁有的深度和廣度。對大多數(shù)真核細(xì)胞來說，基因表達(dá)調(diào)控的最明顯特征是能在特定時間和特定的細(xì)胞中激活特定的基因，從而實現(xiàn)“預(yù)定〞的、有序的、不可逆轉(zhuǎn)的分化、發(fā)育過程,并使生物的組織和器官保持正常功能。24編輯ppt真核生物基因調(diào)控可分為兩大類：第一類是瞬時調(diào)控或稱可逆性調(diào)控，它相當(dāng)于原核細(xì)胞對環(huán)境條件變化所做出的反響，包括某種底物或激索水平升降時,或細(xì)胞周期不同階段中梅活性的調(diào)節(jié);第二類是發(fā)育調(diào)控或稱不可逆調(diào)控，是真核基因調(diào)控的精髓部分，它決定了真核細(xì)胞生長、分化、發(fā)育的全部進(jìn)程。25編輯ppt根據(jù)基因調(diào)控在同一事件中發(fā)生的先后次序，又可將其分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控,前者可以分為遺傳水平的DNA調(diào)控和表觀遺傳水平的染色質(zhì)調(diào)控，后者又進(jìn)一步分為RNA加工成熟過程的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控及蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控等。

26編輯ppt8.2真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控

真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻澤及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在如下差異:1.在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯一條多膚鏈，原核生物中常見的多基因操縱子形式在真核細(xì)胞中比較少見.2.真核細(xì)胞的DNA與組蛋白和大量非組蛋白結(jié)合.只有一小局部DNA是裸露的。3.高等真核細(xì)胞DNA中大局部不轉(zhuǎn)錄；大局部真核細(xì)胞還存在不被翻譯的內(nèi)含子4.真核生物能夠有序地根據(jù)生長發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA片段重排，還能在需要時增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)、這種能力在原核生物中也是極為鮮見的。27編輯ppt5.真核生物基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)大，它們可能遠(yuǎn)離核心啟動子幾百個甚至上千個堿基對。雖然這些凋節(jié)區(qū)也能與蛋白質(zhì)結(jié)合.但是并不直接影響啟動子區(qū)對于RNA聚合酶的接受程度，而是通過改變整個所控制基因5’上游區(qū)DNA構(gòu)型來影響它與RNA聚合酶的結(jié)合能力。6.真核牛物的RNA在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)后，才能被解譯成蛋白質(zhì).原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。7.許多真核生物的叢因只有經(jīng)過復(fù)雜的成熟和剪接過程，才能被順利地翻譯成蛋白質(zhì)。28編輯ppt8.2.1真核基因的一般結(jié)構(gòu)特征一個完整的真核基因，包括編碼區(qū)，5’和3’端長度不等的特異性序列，它們雖然不編碼氨基酸，卻在基因表達(dá)的過程中起重要作用?！踩缫砸韵聢D〕所以，基因的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必須的全部核苷酸序列。29編輯ppt基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的根本要素包括：

順式作用原件、反式作用因子和RNA聚合酶。

30編輯ppt順式作用原件是指啟動子和基因的調(diào)節(jié)序列。主要包括啟動子、增強(qiáng)子、沉默子等。反式作用因子是指能夠結(jié)合在順式作用元件上調(diào)控基因表達(dá)的蛋自質(zhì)或者RNA。RNA聚合酶是催化基因轉(zhuǎn)錄最主要的酶。31編輯ppt32編輯ppt33編輯ppt34編輯ppt35編輯ppt36編輯ppt37編輯ppt8.2.2增強(qiáng)子及其對轉(zhuǎn)錄的影響

增強(qiáng)子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列，最早發(fā)現(xiàn)于SV40早期基因的上游，有兩個長72bp的正向重復(fù)序列。增強(qiáng)子特性〔1〕增強(qiáng)效應(yīng)十清楚顯。(2)增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)。(3〕大多為重復(fù)序列〔50bp〕。(4〕其增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性。(5)沒有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)。(6)許多增強(qiáng)子還受外部信號的調(diào)控。38編輯ppt增強(qiáng)子的作用原理增強(qiáng)子可能有如下3種作用機(jī)制:①影響模板附近的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA雙螺旋彎折或在反式作用因子的參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介形成增強(qiáng)子與之間“成環(huán)〞連接，活化基因轉(zhuǎn)錄;②將模板固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利子DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進(jìn)RNA聚合酶II在DNA鏈上的結(jié)合和滑動;③增強(qiáng)子區(qū)可以作為反式作用因子或RNA聚合酶II進(jìn)人染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的“入口〞。39編輯ppt8.2.3反式作用因子真核生物啟動子和增強(qiáng)子