細(xì)胞工程(生物技術(shù)概論)

第四章細(xì)胞工程一定義

細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，通過類似于工程學(xué)的步驟，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平上，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)以獲得新型生物或一定細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。廣義的細(xì)胞工程包括所有的生物組織、器官及細(xì)胞離體操作和培養(yǎng)技術(shù)，狹義的細(xì)胞工程那么是指細(xì)胞融合和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

根據(jù)研究生物類型不同，細(xì)胞工程可分為:

動物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、微生物細(xì)胞工程。

二、細(xì)胞工程的主要研究內(nèi)容動物細(xì)胞工程包括：

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)〔包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)〕；

細(xì)胞融合技術(shù)；

胚胎工程技術(shù)〔核移植、胚胎分割等〕；

克隆技術(shù)〔單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個體克隆〕。

植物細(xì)胞工程包括：

植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù)；

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；

原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)；

亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。細(xì)胞、組織、器官培養(yǎng)

細(xì)胞融合

細(xì)胞核移植

染色體操作

體細(xì)胞誘變

轉(zhuǎn)基因生物等

根據(jù)實驗操作對象可分為：以細(xì)胞工程為根底，開展派生了不少以工程冠名的新領(lǐng)域：

組織工程

胚胎工程

染色體工程

按生物類型分：按實驗操作對象分：動物細(xì)胞工程細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞工程細(xì)胞融合微生物細(xì)胞工程體細(xì)胞突變轉(zhuǎn)基因生物等派生學(xué)科：組織工程；胚胎工程；染色體工程1、細(xì)胞和組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)都屬于體外培養(yǎng)，是指生物細(xì)胞和組織在離體條件下的生長和增殖。細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程的最根本技術(shù)，細(xì)胞融合、細(xì)胞核移植、染色體工程、轉(zhuǎn)基因生物、胚胎工程等細(xì)胞工程技術(shù)都離不開細(xì)胞和組織培養(yǎng)。近年來開展起來的組織工程和生物反響器就是在細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)上直接開展起來的。試管植物2、細(xì)胞融合

細(xì)胞融合〔cellfusion〕又稱細(xì)胞雜交〔cellhybridization〕，是指兩個或兩個以上的細(xì)胞融合形成一個細(xì)胞的過程。

細(xì)胞融合的范圍很廣，在不同種類之間，甚至不同物種之間都能發(fā)生融合，成為研究細(xì)胞、遺傳、免疫、藥物和新品種培育的重要手段。利用細(xì)胞融合技術(shù)開展起來的單克隆抗體技術(shù)，已成功地應(yīng)用到根底生命科學(xué)研究和醫(yī)藥生產(chǎn)的各個領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的開展，創(chuàng)造了極為可觀的經(jīng)濟效益，是應(yīng)用最為成功的生物技術(shù)之一。3、細(xì)胞核移植(nucleartransplantation)

利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)別離，然后再將不同來源的核與質(zhì)重組，形成雜種細(xì)胞。

細(xì)胞核移植是利用顯微操作技術(shù)將細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)別離，然后再將不同來源的核與質(zhì)重組，形成雜種細(xì)胞?？寺游铩嗬颉虻恼Q生使細(xì)胞核移植技術(shù)引起了全世界的關(guān)注。體細(xì)胞克隆羊

——多莉277次乳腺細(xì)胞核移植實驗；獲得29個發(fā)育為8細(xì)胞的“胚〞；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉〞。全球首只克隆貓ＣＣ和“媽媽〞在一起世界第一只克隆寵物

北京第2頭克隆牛誕生生命源于牛耳細(xì)胞

英國培育出新型轉(zhuǎn)基因克隆豬

〔1〕既然綿羊的體細(xì)胞可以被成功地克隆成一個新的個體，是否意味著人類也可以克隆自己呢？〔2〕是否應(yīng)該允許進(jìn)行克隆人的實驗？

《時代》封面故事“爭論克隆人〞

多利于1996年7月5日出生，2003年2月14日死亡。維爾穆特領(lǐng)導(dǎo)培育的世界上第一只體細(xì)胞克隆動物-克隆羊“多利〞于2003年2月因肺部感染而死亡?；缄P(guān)節(jié)炎時的多利

克隆有缺陷克隆鼠突然“發(fā)福〞4、染色體工程(chromosomeengineering)

把單個的染色體或染色體組轉(zhuǎn)入或移出受體細(xì)胞，從而形成新的染色體組合和遺傳構(gòu)成。

該技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于優(yōu)良品種的培育，如多倍體育種已經(jīng)成為很常規(guī)的育種技術(shù)。近年來開展起來的人工染色體技術(shù)為基因組研究、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因治療提供了重要手段和途徑。5、胚胎工程(embryonicengineering)

以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對象進(jìn)行的操作，主要技術(shù)包括體外受精、胚胎切割、胚胎移植等。

胚胎工程胚胎工程是以生殖細(xì)胞和胚胎細(xì)胞為對象進(jìn)行的細(xì)胞工程操作，主要包括體外受精、胚胎移植、胚胎切割等。它在畜牧業(yè)生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛的推廣應(yīng)用。成為常規(guī)的畜牧優(yōu)良品種繁育技術(shù)。

2002年5月24日，廣西大學(xué)動物繁殖研究所宣布，研究人員于5月中旬成功地繁殖了一只胚胎細(xì)胞克隆兔。這只克隆兔出生時重82克，如今體重增長數(shù)倍，看上去發(fā)育良好。與一般實驗動物相比，兔子與人類的生理更加接近，克隆兔的成功誕生，有助于人類醫(yī)學(xué)研究。出生近兩周的克隆兔(前)與同日出生的普通兔(后)相比，體形上要大許多。

世界首例冷凍克隆牛胚胎移植犢牛在萊陽農(nóng)學(xué)院降生

6、干細(xì)胞與組織工程

干細(xì)胞〔stemcell〕是動物體內(nèi)具有分化潛能，并能自我更新的細(xì)胞，分為胚胎干細(xì)胞和組織干細(xì)胞。

胚胎干細(xì)胞來自囊胚期的細(xì)胞團(tuán)，屬于全能干細(xì)胞，每個細(xì)胞可以發(fā)育成為完整的個體。組織干細(xì)胞存在于成體組織中，屬單能或多能干細(xì)胞，可以定向分化為一種或幾種不同的組織。

肝骨上皮細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞心肌脂肪細(xì)胞大腦干細(xì)胞骨基質(zhì)骨骼肌血細(xì)胞骨基質(zhì)襯質(zhì)細(xì)胞血管有些成人干細(xì)胞是多能的,分化成各種細(xì)胞的潛力稱為可塑性。可塑性是如何調(diào)節(jié)的？組織工程是在干細(xì)胞的根底上開展起來的，將干細(xì)胞與材料科學(xué)相結(jié)合，將自體或異體的干細(xì)胞經(jīng)體外擴增后種植在預(yù)先構(gòu)建好的聚合物骨架上，在適宜的生長條件下干細(xì)胞沿聚合物骨架遷移、鋪展、生長和分化，最終發(fā)育具有特定形態(tài)及功能的工程組織。

人工培養(yǎng)的肌肉曹誼林教授在小鼠身上培育的人耳如果能夠消除體細(xì)胞的“記憶〞，它們就有可能恢復(fù)到胚胎細(xì)胞的狀態(tài)——科學(xué)家稱之為把細(xì)胞“重編程〞。把通過“重編程〞得到的干細(xì)胞在不同的環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，就能得到各種分化細(xì)胞。人們通常把這種利用體細(xì)胞制造胚胎干細(xì)胞，分化后再移植回人體的技術(shù)稱作“治療性克隆〞。

盛慧珍教授（右二）正在指導(dǎo)學(xué)生做實驗

７、轉(zhuǎn)基因生物與生物反響器轉(zhuǎn)基因動物是通過基因工程技術(shù)將外源的目的基因?qū)肷臣?xì)胞或早期胚胎，并整合到受體細(xì)胞的基因組中，發(fā)育形成所有細(xì)胞都含有目的基因的動物個體。將目的基因在器官或組織中進(jìn)行特異性高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物稱為動物生物反響器。第一只轉(zhuǎn)基因動物是Gordon通過向小鼠的單細(xì)胞胚胎的原核注入純化的DNA獲得的。1987年Gordon獲得tPA的轉(zhuǎn)基因小鼠后，轉(zhuǎn)基因羊、牛、豬的乳腺生物反響器相繼研究成功目前研究較多的有乳腺生物反響器、血液生物反響器和膀胱生物反映器等。其中乳腺生物反映器最為引人注目，已開始進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化。轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物的置備比轉(zhuǎn)基因動物相對簡單。通過基因工程技術(shù)將外源的目的基因?qū)胫参锛?xì)胞后直接進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)就可以再生出轉(zhuǎn)基因植株。當(dāng)這些轉(zhuǎn)基因植株開花結(jié)果時，所改變的遺傳性狀就可以通過種子遺傳給下一代植株。轉(zhuǎn)基因棉花、大豆、油菜和玉米等已進(jìn)行了大面積的種植。我國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的推廣已取得了巨大的成功，使農(nóng)藥的使用量減少了70%~80%，大幅度降低了生產(chǎn)本錢，還減少了環(huán)境污染。能夠產(chǎn)生某些重要蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因植物稱為植物反響器。目前研究最多的是生產(chǎn)抗體和疫苗的植物生物反響器。〔一〕植物細(xì)胞工程的概念

植物細(xì)胞工程是一門以植物組織和細(xì)胞的離體操作為根底的實驗性學(xué)科。它是以植物組織細(xì)胞為根本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改進(jìn)品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個體，或獲得有用物質(zhì)的過程統(tǒng)稱為植物細(xì)胞工程。三.植物細(xì)胞工程的開展〔二〕植物細(xì)胞工程的開展歷史

探索階段〔1902-1929〕

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至分到單個細(xì)胞的觀點。他認(rèn)為，如果每個細(xì)胞都有植物個體一樣的性質(zhì)和能力，那么可以通過植物細(xì)胞培養(yǎng)，把單個細(xì)胞培養(yǎng)成一個新個體。

在此思想指導(dǎo)下，許多科學(xué)家從事組織培養(yǎng)研究.1904年，德國植物胚胎學(xué)家Hanning用蘿卜和辣根的胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，提早長成了小植株，首次獲得胚培養(yǎng)成功。

成熟發(fā)芽

常規(guī)幼胚―→種子―→植物

培養(yǎng)

組織培養(yǎng)幼胚―→植株

1922年，Knudson對蘭花幼胚進(jìn)行培養(yǎng)獲得幼苗，克服了蘭花種子發(fā)芽難的困難。

1922，Kotte和Robbins對豌豆、玉米、棉花等的莖尖、根尖進(jìn)行了離體培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)了培養(yǎng)的分生組織只能進(jìn)行有限的生長。

1925年，Laibach進(jìn)行亞麻種間雜種幼胚培養(yǎng)，成功地得到了雜種植物。證明了胚培養(yǎng)在植物遠(yuǎn)源雜交中利用的可能性。

培養(yǎng)技術(shù)建立階段〔1930-1959〕

作為一門技術(shù)，它必須具有一定的程序性。也就是說，它應(yīng)該具有一定的技術(shù)模式。在這一階段，植物組織培養(yǎng)建立了兩個與培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的重要模式，一是培養(yǎng)基模式，二是激素調(diào)控模式。

1934年，White等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個活潑生長的無性繁殖系。1934年，Gautheret培養(yǎng)山毛柳、黑楊的形成層組織，獲得愈傷組織形成。

1937年，White和Went等分別發(fā)現(xiàn)B族維生素和吲哚乙酸〔IAA〕對培養(yǎng)的離體根生長具有重要作用。

1937-1938年，Gautheret在1934年培養(yǎng)山毛柳、黑楊成功獲得愈傷組織的根底上，在培養(yǎng)柳樹的培養(yǎng)基中，參加IAA和B族維生素等，使形成層的生長大為增加。

1937-1938年，Nobecourt培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。首次從液泡化的薄壁細(xì)胞建立愈傷組織培養(yǎng)物。White、Gautheret、Nobecourt等科學(xué)家被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人。在此根底上建立了植物組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，包括無機鹽成分、有機成分和生長刺激因素。這是隨后創(chuàng)立的各種培養(yǎng)基的根底，同時也建立了植物組織培養(yǎng)的根本方法，成為當(dāng)今各種植物組織培養(yǎng)的技術(shù)根底。

40年代末開始，進(jìn)行從脫分化細(xì)胞組織培養(yǎng)進(jìn)入探討器官再分化的研究。

脫分化

細(xì)胞〔組織、器官〕再分化

愈傷組織不定芽植株

不定根脫分化：離體培養(yǎng)條件下，一個已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無分化狀態(tài)或分生組織細(xì)胞狀態(tài)或胚性細(xì)胞的狀態(tài)的過程就是細(xì)胞脫分化。

再分化：脫分化后的分生細(xì)胞〔愈傷組織〕在特定的條件〔離體培養(yǎng)〕下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進(jìn)一步發(fā)育成完整生物體，這一過程稱為細(xì)胞再分化。

1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通過改變培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長素和細(xì)胞分裂素高促進(jìn)根的分化，低促進(jìn)莖和芽的分化。

1958年，Steward和Reinert以胡蘿卜根的懸浮細(xì)胞誘導(dǎo)分化成完整的小植株，發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞胚，為細(xì)胞離體培養(yǎng)中研究形態(tài)發(fā)生機制開拓了新的領(lǐng)域。

應(yīng)用研究階段〔1960-〕

1、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合。

1971年，Takebe等從煙草原生質(zhì)體得到再生植株，首次獲得原生質(zhì)體植株再生成功。

1972年，Carlson等通過兩個煙草物種之間原生質(zhì)體的融合，獲得了第一個體細(xì)胞雜種植株。

1978年，Melchers進(jìn)行了馬鈴薯和番茄的融合實驗，獲得了第一個屬間雜種植株

到目前為止，組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞融合已在許多植物上獲得再生成功。

2、微繁技術(shù)

1960年，Morel提出了利用莖尖離體快速繁殖蘭花的方法，在此根底上，國際上建立了蘭花工業(yè)，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

3、花藥培養(yǎng)技術(shù)

1973年，Nitch采用花藥預(yù)培養(yǎng)的方法，首次獲得了煙草花粉植株。

4、次生產(chǎn)物生產(chǎn)

〔三〕植物細(xì)胞工程的任務(wù)

〔1〕研究植物器官、組織和細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，所需要的有機營養(yǎng)、無機營養(yǎng)、植物激素等培養(yǎng)條件和刺激因素。

〔2〕研究植物器官、組織和細(xì)胞，在離體培養(yǎng)條件下，所需的溫度、濕度和光照等環(huán)境條件。

〔3〕研究植物的不同生理年齡、遺傳組成〔基因型〕在離體培養(yǎng)條件下，形態(tài)發(fā)生的規(guī)律。

〔4〕研究離體培養(yǎng)條件下再生植株群體的遺傳穩(wěn)定性和變異性。四、動物細(xì)胞工程開展史

細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

19世紀(jì)30年代，Muller,Schwann,Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象；

1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在；

1855年～1858年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞；

1859年，A.Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個細(xì)胞核融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。

據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而形成的。至此，自然界中廣泛存在著多核細(xì)胞的事實，才被生命科學(xué)工作者接受。

動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立

1907年，Harrison首先培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)管區(qū)細(xì)胞，并觀察到從中長出的軸突細(xì)胞〔神經(jīng)纖維〕，他的工作被認(rèn)為是動物細(xì)胞培養(yǎng)開始的標(biāo)志；

1911年，Carrel發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對于培養(yǎng)細(xì)胞的生長促進(jìn)作用，并首次把無菌技術(shù)引入組織培養(yǎng)技術(shù)中。

1914年，Thomson建立了器官培養(yǎng)技術(shù)。

1940年，1951年，Earle和Gay分別建立了c3H小鼠結(jié)締組織細(xì)胞系的L系和人體細(xì)胞系－人體宮頸癌Hela細(xì)胞系。

A.Carrel

細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生

1958年,Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。

60年代，Harris(1965)誘導(dǎo)不同動物體細(xì)胞融合獲得成功并培養(yǎng)存活。

Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用HAT選擇性培養(yǎng)基能使親本細(xì)胞死亡而只留下異型融合細(xì)胞，并能不斷地增殖，從此形成了細(xì)胞融合到雜種細(xì)胞選擇、培養(yǎng)的一整套技術(shù)。

1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用仙臺病毒誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。

動物克隆技術(shù)的建立

首例克隆動物成功的報道是在1962年，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1％的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。

這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動物個體的新型實驗途徑，其奉獻(xiàn)在于：實驗證明了完全分化的腸細(xì)胞仍然具有未分化細(xì)胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，從而證明了動物細(xì)胞仍然具有全能性；初步建立了體細(xì)胞核移植的實驗體系，證明在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育方向的早期，卵細(xì)胞質(zhì)對體細(xì)胞核的發(fā)育功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與有關(guān)的蛋白質(zhì)。

五、重要應(yīng)用

植物細(xì)胞工程的應(yīng)用

〔一〕、脫毒和快速繁殖

許多植物，特別是無性繁殖植物，帶有病毒，并直接傳給子代，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般莖尖生長點不帶病毒。所以，利用莖尖培養(yǎng)再生的植株，可能不帶病毒，再進(jìn)行大量繁殖生產(chǎn)脫毒苗。脫毒苗用于生產(chǎn)可明顯提高產(chǎn)量、質(zhì)量和商品價值。目前已在許多植物上得到應(yīng)用，如甘薯、馬鈴薯、草莓、果樹、花卉等。

許多名貴植物，之所以名貴，是因為繁殖系數(shù)太低，種子結(jié)實率低或者不結(jié)種子，而營養(yǎng)繁殖又很慢。利用組織培養(yǎng)再生植株，進(jìn)行大量繁殖，可以大大提高繁殖系數(shù)。目前組織培養(yǎng)快速繁殖已在許多植物上應(yīng)用，最早是蘭花〔60年代〕

〔二〕、細(xì)胞工程育種

1、

利用培養(yǎng)變異，篩選優(yōu)良突變體。

植物離體培養(yǎng)，能夠明顯提高突變率，并且會有各種各樣的生理和形態(tài)突變，如株高、花色、植株形態(tài)、生育期、耐性等等?？梢詮闹羞x擇優(yōu)良突變體，培育新品種。

2、利用遠(yuǎn)緣雜交幼胚培養(yǎng)，獲得雜種植株，克服其雜交不親和性。

有些植物遠(yuǎn)緣雜交，