臨床免疫學課件

沉澱反應（precipitationreaction)

可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉澱

1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應抗血清混合出現(xiàn)沉澱1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加於其中，發(fā)現(xiàn)沉澱反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術1965年Mancini提出單向免疫擴散技術，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉澱反應達到快速、微量、自動化的新階段。

根據(jù)沉澱反應的介質和檢測方法的不同,沉澱反應可分為:

液相內的沉澱反應凝膠內的沉澱反應

第一節(jié)液體內沉澱試驗根據(jù)沉澱現(xiàn)象的不同，液體內沉澱又可分為三類：絮狀沉澱環(huán)狀沉澱免疫濁度沉澱

一、絮狀沉澱試驗絮狀沉澱試驗是一項經典實驗技術。曾用於測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉澱的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。

(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質存在的條件下，抗原與抗體結合出現(xiàn)可見的絮狀沉澱。絮狀沉澱易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。

(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產生沉澱量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉澱物最多的管為最適比例管。

2.抗體稀釋法

本法採用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現(xiàn)沉澱物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結合，可一次完成抗原和抗體的滴定並找出抗原、抗體的最適比。

(三)方法評價

絮狀沉澱試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。

二、環(huán)狀沉澱試驗環(huán)狀沉澱(ringprecipitation)試驗是由Ascoli於1902年建立的一種經典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術瞭解待測血清內是否存在某種抗原或抗體。

(一)原理把抗原溶液小心地加於已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在介面處形成清晰的乳白色沉澱環(huán)。

(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加於沉澱管(內徑約1.5~2mm)底部，避免產生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加於抗血清液面上，形成清晰的交界面。

3.置沉澱管於室溫下使其反應，1~5min內在兩介面間呈現(xiàn)乳白色沉澱環(huán)為陽性。30min仍無沉澱環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

(三)方法評價

該試驗是經典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用於鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

三、免疫濁度試驗經典的免疫沉澱試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結果，方法有耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內快速結合並產生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。

(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩衝液中形成免疫複合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由於溶液內複合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫複合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和複合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。

2.操作步驟(1)用稀釋緩衝液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。

3.方法評價

敏感度高於單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內、批間重複性較好，變異係數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報告結果。

(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水準軸照射，碰到小顆粒的免疫複合物，光線被折射，發(fā)生偏轉，這種偏轉的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與複合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成複合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。

1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結合反應過程中，在單位時間內兩者結合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其複合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。

(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，於普通座標紙上繪製標準曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應抗原含量。

(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節(jié)約反應時間，每小時可檢測數(shù)十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水準。

2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡後，測定其複合物的量。複合物的濁度不再受時間的影響，但反應複合物聚合產生絮狀沉澱之前(大約反應數(shù)十分鐘)進行濁度測定。

(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪製標準曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。

(3)方法評價：

敏感度達mg/L水準，可自動化，但反應時間較長

(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體後，當遇到相應抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。

2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪製標準曲線，查出待測抗原量。

3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應液中無PEC沉澱劑的影響，個體IC對結果影響也小，所以結果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

第二節(jié)凝膠內沉澱試驗凝膠內沉澱試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀醯胺凝膠等。根據(jù)實驗目的與方法不同，可將固相內沉澱驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmunoelec-trophoresis)。這是一項凝膠內電泳加擴散技術，專門一章介紹。

一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質在凝膠中自由擴散，與抗體結合形成沉澱環(huán)，沉澱環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關。

(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固後在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h後可見其孔周圍出現(xiàn)沉澱環(huán)。

單向免疫擴散試驗示意圖

沉澱環(huán)的直徑與待檢標本內含量不是直線關係，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用於大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通座標紙作圖，擴散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關係。(2)Fehcy曲線：適用於分子抗原，擴散時間較短，使用半對數(shù)座標紙作圖，抗原量的對數(shù)和擴散圈直徑之間呈線性關係。

雙免疫擴散試驗（doubleimmunodiffusion）

雙向免疫擴散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

雙向免疫擴散試驗示意圖

第三節(jié)免疫電泳技術免疫電泳技術是電泳分析與沉澱反應的結合產物。這種技術有兩大優(yōu)點，一是加快了沉澱反應的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應，以此作更細微的分析。

免疫電泳包括:

免疫電泳對流免疫電泳火箭電泳免疫印跡等

一）、免疫電泳

免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散的結合。方法是先將樣品加入瓊脂中利用區(qū)帶電泳技術將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多條弧形沉澱線。

常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義。

二）、對流免疫電泳

對流免疫電泳實質上是定向加速度的免疫雙擴散技術，其基本原理是：將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫複合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

對流電泳示意圖

三）、火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術又稱作單向電泳擴散免疫沉澱試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術，實質上是加速度的單向擴散。

方法：在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本後，將抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強度進行電泳?？乖鞠蜿枠O，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結合沉澱。隨著泳動抗原的減少，沉澱逐漸減少，形成峰狀的沉澱區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。

火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

四）免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western-blot

應用舉例：用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上

第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現(xiàn)第二抗體

下次課內容:

凝集反應時間:2002/3

教員:毛旭虎

凝集反應（agglutination)毛旭虎醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO二年三月

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖斉c相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應（agglutination）。

1896年，Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發(fā)生特異性凝集的現(xiàn)象，有效地診斷傷寒病。

1900年，Landsteriner在特異性血凝現(xiàn)象的基礎上發(fā)現(xiàn)了人ABO血型，並於1930年獲得了諾貝爾獎。

凝集反應可分為：

直接凝集反應間接凝集反應

一）直接凝集反應

細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖谶m當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應（directagglutination）。凝集反應中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗全稱為凝集素（agglutinin）。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。

玻片法：

ABO血型的鑒定試管法：肥達試驗（Widaltest）傷寒外斐試驗（Weil-Felixtest）立克次體

二）間接凝集反應

將可溶性抗原（或抗體）先吸附於適當大小的顆粒性載體的表面，然後與相應抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應（indirectagglutination）或被動凝集反應（passiveagglutination）。

根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式，間接凝集反應可分為：正向間接凝集試驗反向間接凝集試驗正向間接凝集抑制試驗反向間接凝集抑制試驗

1。正向間接凝集試驗：用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體

2．反向間接凝集反應

用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原

3．正向間接凝集抑制反應

抗原致敏的顆粒載體及相應的抗體，用於檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。

間接凝集抑制反應原理示意圖A：標本中含抗原B：標本中不含抗原

4．反向間接凝集抑制反應

抗體致敏的顆粒載體及相應的抗原，用於檢測標本中是否存在與致敏抗體相同的抗體。

在間接凝集反應中，可用作載體的顆粒種類很多，常用的有動物或人紅細胞、細菌和多種惰性顆粒如聚苯乙烯膠乳等。間接血凝試驗是以紅細胞作為載體膠乳凝集試驗是以聚苯乙烯膠乳作為載體協(xié)同凝集反應（coaggoltination）是以一種金黃色葡萄球菌作為載體（它的菌體細胞壁中含有A蛋白（SPA）。SPA具有與IgG的Fc段結合的特性，因此當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體。）

沉澱反應（precipitationreaction)

1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應抗血清混合出現(xiàn)沉澱1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加於其中，發(fā)現(xiàn)沉澱反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術1965年Mancini提出單向免疫擴散技術，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉澱反應達到快速、微量、自動化的新階段。

根據(jù)沉澱反應的介質和檢測方法的不同,沉澱反應可分為:

液相內的沉澱反應凝膠內的沉澱反應

第一節(jié)液體內沉澱試驗根據(jù)沉澱現(xiàn)象的不同，液體內沉澱又可分為三類：絮狀沉澱環(huán)狀沉澱免疫濁度沉澱

一、絮狀沉澱試驗絮狀沉澱試驗是一項經典實驗技術。曾用於測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉澱的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。

(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質存在的條件下，抗原與抗體結合出現(xiàn)可見的絮狀沉澱。絮狀沉澱易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。

(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產生沉澱量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉澱物最多的管為最適比例管。

2.抗體稀釋法

本法採用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現(xiàn)沉澱物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結合，可一次完成抗原和抗體的滴定並找出抗原、抗體的最適比。

(三)方法評價

絮狀沉澱試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。

二、環(huán)狀沉澱試驗環(huán)狀沉澱(ringprecipitation)試驗是由Ascoli於1902年建立的一種經典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術瞭解待測血清內是否存在某種抗原或抗體。

(一)原理把抗原溶液小心地加於已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在介面處形成清晰的乳白色沉澱環(huán)。

(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加於沉澱管(內徑約1.5~2mm)底部，避免產生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加於抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉澱管於室溫下使其反應，1~5min內在兩介面間呈現(xiàn)乳白色沉澱環(huán)為陽性。30min仍無沉澱環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

(三)方法評價

該試驗是經典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用於鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

三、免疫濁度試驗經典的免疫沉澱試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結果，方法存在耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內快速結合並產生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。

(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩衝液中形成免疫複合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由於溶液內複合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫複合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和複合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。

2.操作步驟(1)用稀釋緩衝液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。

3.方法評價

敏感度高於單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內、批間重複性較好，變異係數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報告結果。

(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水準軸照射，碰到小顆粒的免疫複合物，光線被折射，發(fā)生偏轉，這種偏轉的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與複合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成複合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。

1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結合反應過程中，在單位時間內兩者結合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其複合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。

(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，於普通座標紙上繪製標準曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應抗原含量。

(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節(jié)約反應時間，每小時可檢測數(shù)十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水準。

2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡後，測定其複合物的量。複合物的濁度不再受時間的影響，但反應複合物聚合產生絮狀沉澱之前(大約反應數(shù)十分鐘)進行濁度測定。

(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪製標準曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。

(3)方法評價：

敏感度達mg/L水準，可自動化，但反應時間較長

(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體後，當遇到相應抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。

2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪製標準曲線，查出待測抗原量。

3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應液中無PEG沉澱劑的影響，個體IC對結果影響也小，所以結果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

第二節(jié)凝膠內沉澱試驗凝膠內沉澱試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀醯胺凝膠等。根據(jù)實驗目的與方法不同，可將固相內沉澱驗分為3類：①雙相瓊脂擴散試驗(doublegeldiffusiontest)，②單相瓊脂擴散試驗(singlegeldiffusiontest)，③凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)。這是一項凝膠內電泳加擴散技術，專門一章介紹。

一、單相瓊脂擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質在凝膠中自由擴散，與抗體結合形成沉澱環(huán)，沉澱環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關。

(二)操作步驟1.將抗體和0.9%瓊脂糖50~56℃混合，即刻傾注成平板。2.待凝固後在瓊脂板上打孔，孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃，讓其向四周自由擴散，24~48h後可見其孔周圍出現(xiàn)沉澱環(huán)。

單向免疫擴散試驗示意圖

沉澱環(huán)的直徑與待檢標本內含量不是直線關係，有兩種計算方法：(1)Mancini曲線：適用於大分子抗原，擴散時間>48h，使用普通座標紙作圖，擴散環(huán)直徑平方和濃度呈線性關係。(2)Fehcy曲線：適用於較小分子抗原，擴散時間較短，使用半對數(shù)座標紙作圖，抗原量的對數(shù)和擴散圈直徑之間呈線性關係。

(三)方法評價

單向瓊脂擴散試驗是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設備，一般實驗室均可使用的常規(guī)方法，試驗的重複性和線性均好。敏感度為1.25mg/L。

(四)影響因素1.抗原分子量抗原分子量大，擴散慢，沉澱環(huán)較小；抗原分子量小，擴散快，沉澱環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標準品在血清學上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結果偏高或偏低。

2.抗體種類

實驗證明兔抗血清優(yōu)於馬、羊抗血清，兔抗血清可測抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊為0.4~4IU/ml，為提高實驗敏感度，應首選敏感度高的抗血清。

3.抗體稀釋度

抗體濃度大，沉澱環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉澱環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉澱環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉澱環(huán)清晰的基礎上加大稀釋度以提高敏感度。下圖為抗體分別以1:25、1:50、1:75、1:100稀釋，所形成的4條標準曲線。

4.擴散時間

抗原達到擴散終點後，其沉澱環(huán)直徑才與抗原含量呈一定關係?？乖吭礁撸_到一定關係所用擴散時間越長。

5.擴散溫度

在4~37℃範圍內，提高溫度加快擴散速度，縮短反應時間。但有的沉澱環(huán)僅在低溫下形成，溫度高反而消失。在同一次試驗的孵育過程中，要防止溫度急劇變化，以免出現(xiàn)雙圈。6.瓊脂板厚度

瓊脂板厚度增加，沉澱環(huán)面積相應縮小。

二、雙相瓊脂擴散試驗(一)原理將可溶性抗原和抗體置於瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成可見的白色沉澱線。沉澱線的特徵與抗原抗體的濃度、純度和擴散速率等有關。

(二)操作步驟1.融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。2.凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。3.加樣在相對孔內加抗原或抗體。4.孵育使抗原抗體自由擴散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時形成可見的沉澱線。沉澱線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴散速度有關。

(三)雙相瓊脂擴散試驗的應用1.檢測未知抗原或抗體將已知的抗體或抗原與待檢標本加入成對孔中，根據(jù)沉澱線有無定性；根據(jù)沉澱線的位置估計抗原或抗體的相對含量；根據(jù)沉澱弧形狀判斷抗原或抗體的相對擴散速率，見圖。

A：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab沉澱線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關係

2.抗原性質分析利用三角孔型，將待檢抗原和標準抗原加入相鄰兩個孔中，與另一孔相對，根據(jù)沉澱線形狀分析待測抗原，見圖。

(1)沉澱線吻合：待檢抗原與標準抗原完全相同。(2)沉澱線相切：待檢抗原中含有與標準抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應。(3)沉澱線相交：待檢抗原有與抗血清對應的抗原，但和標準抗原不同。(4)沉澱線部分吻合：待測抗原和標準抗原性質相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標準抗原

3.抗體效價滴定

用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應抗體，以出現(xiàn)沉澱線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價。

免疫電泳技術

第一節(jié)概述免疫電泳技術實質上是直流電場作用下的凝膠擴散試驗。

Grabar和Williams於1953年首先將凝膠擴散置於直流電場中進行，讓電流加速抗原和抗體的擴散，並規(guī)定其運動方向，從而使這種沉澱反應時間大縮短，敏感度顯著提高。隨著現(xiàn)代生物學醫(yī)學科學技術的發(fā)展，免疫電泳技術有了新的發(fā)展，應用範圍日益擴大，不僅用於人與動物血清蛋白、各組織器官抗原成分及抗體的分析，也用於細菌、植物性抗原、酶與激素的檢測。

一、電泳的原理

帶電質點在電場中向帶有異相電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳?？贵w及大多數(shù)抗原是蛋白質，具有許多可解離的酸性和鹼性基團如COO—及NH3+等，在一定pH條件下，這種兩性電解質解離成為帶正電或負電的質點，其泳動方向和泳動速度與本身淨電荷量、顆粒大小、形狀等有關。所帶淨電荷量越多，顆粒越小，泳動速度越快。

二、影響因素

1.電場強度是指每釐米的電位降，以V/cm表示。電泳時，可採用恒定電流，變動電壓；也可恒定電壓，變動電流。I=V/R，恒定電壓時，因R不斷下降，所以電流增高，顆粒移動速度和熱效應也增大。通常採用電壓在2~10V/cm；當恒定電流時，由於R不斷下降，因此，V也隨之下降，從而蒸發(fā)較少，熱效應也小，移動率接近恒定。因此恒定電流要比恒定電壓好。常用電流為2~4mA/cm。

2.溶液pH值

溶液pH值決定蛋白質帶電荷種類和數(shù)量。pH離等電點越遠，離子解離越多，泳動速度越快，反之則越慢。為了使電泳速度恒定，必須採用緩衝溶液。由於大多數(shù)蛋白質的等電點較低，一般電泳所採用的緩衝溶液均偏鹼性，因而使大部分的分子帶負電荷。

3.離子強度

溶液的離子強越高，電導率越高，則帶電質點泳動速度越慢並有較高的熱效應；反之，離子強度低，質點泳動快，熱效應較小。

4.電滲

在電場中液體相對於固體的移動稱為電滲。在瓊脂凝膠電泳中，由於瓊脂是帶負電荷的極性基團(如SO42—、COO—)，使瓊脂成為負電的固相，靜電感應作用使瓊脂網格附近的水帶正電，因此，液體向負極流動，形成電滲力。帶電質點泳動時受電泳力和電滲力的共同作用。如電泳力低於電滲力，則向負極移動。如抗體，在鹼性環(huán)境帶負電，應向正極移動，但由於其等電點較高，電荷少，抵不過電滲力而泳向負極。

第二節(jié)對流免疫電泳

對流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis,CIEP)又稱免疫電滲電泳(immuno-osmophoresis,IEOP)。是在直流電場中進行的免疫雙擴散技術。

(一)原理在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白因等電點高，只帶有微弱的負電荷，而且分子又較大，因此電泳力小，小於電滲力，泳向負極；而一般抗原蛋白質常帶較強的負電荷，分子較小，電泳力大，大於電滲力，泳向正極，電泳時抗原放負極側，抗體放正極側，抗原抗體相對泳動，一定時間後抗原和抗體將在兩孔之間相遇，在比例適當處形成肉眼可見的沉澱線。

(二)操作步驟1.製備1.2%巴比妥瓊脂凝膠板。2.在瓊脂板上成對打孔，孔徑3mm，孔距6mm。3.於陰極側孔內加入待檢血清或陽性對照血清，陽極側孔內加抗血清。4.電泳電泳條件3~4mAcm寬，電泳30min。5.觀察結果或在室溫放置數(shù)小時後觀察沉澱線，見圖。

1為陽性2為弱陽性3/4為強陽性

(三)方法評價對流電泳簡便、快速、敏感度較雙相瓊脂擴散試驗高8~10倍，但分辨力低於雙向瓊脂擴散試驗。

第三節(jié)火箭免疫電泳

火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIE)技術是把抗原放在含有抗體的凝膠內電泳，其沉澱形似火箭，故稱為火箭電泳。也有人稱其為電免疫擴散(electro-immunodiffusion,EID)。

(一)原理將待測抗原在含有適量抗體的瓊脂板中泳動時，在抗原與抗體達到適當比例時形成大的不溶性免疫複合物而沉澱，此沉澱物不再移動，未與抗體結合的抗原可穿過此沉澱繼續(xù)向前遷移並形成新的沉澱，隨著抗原的減少，沉澱帶越來越窄，形成火箭峰狀沉澱(見圖)。峰形高低與抗原量成正比。

(二)操作步驟1.製備抗體瓊脂糖凝膠板將已融化的1.2%巴比妥緩衝瓊脂糖冷卻至55℃左右，加入適量抗血清，混勻後立即澆板，置室溫凝固。2.打孔在瓊脂凝膠板一側打孔，孔徑3mm，孔距2mm。置瓊脂板於電泳槽內，搭橋後用微量注射器準確加樣10μl。3.電泳樣品孔放負極側，電壓8~10V/cm或電流3~5mA/cm，電泳6h。4.觀察沉澱峰電泳完畢後，觀察瓊脂板上沉澱峰，並測量從孔中心到峰尖的高度。5.繪製標準曲線圖以峰高為縱坐標，濃度為橫坐標(對數(shù)座標)，繪製標準曲線，求出待檢樣品內抗原濃度。

火箭電泳圖①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

(三)方法評價火箭電泳是一種操作簡便、省時、結果重複性好的定量檢測方法。其敏感度可測0.3mg/L抗原含量，若低於此水準則難以形成可見的沉澱峰。如加入少量125I標記的抗原在含抗體的瓊脂板上電泳，形成的不可見火箭峰，經洗滌乾燥後，用X線膠片感光，經顯影和定影，可呈現(xiàn)同位素顯影，這就是放射自顯影技術，可用於微量抗原含量測定，如測定血清AFP或IgE含量，可測至μg/L水準。

(四)注意事項1.所用瓊脂應是無電滲或電滲很小，否則火箭峰形狀不規(guī)則。2.觀察峰形可判斷電泳終點，如電泳頂部呈不清晰的雲(yún)霧狀或圓形，表示抗原未達到終點，應繼續(xù)電泳。3.待檢標本數(shù)多時，應將瓊脂板置於電泳槽上，搭橋並開啟電源後加樣，否則易出現(xiàn)寬底峰形，影響正確判斷結果。

第四節(jié)免疫電泳