特殊食品和化妝品 紙質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試 秀麗線蟲(chóng)法編制說(shuō)明

《特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試秀麗線蟲(chóng)法編制說(shuō)明本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國(guó)標(biāo)委綜合[2007]114號(hào)文《關(guān)于下達(dá)2007年第七批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》立項(xiàng)，項(xiàng)目編號(hào)為：本標(biāo)準(zhǔn)由福建省特殊食品與化妝品協(xié)會(huì)歸口，并由協(xié)會(huì)組織實(shí)施。美國(guó)食品和藥物管理局已批準(zhǔn)六種主要藥物用于治療肥胖，包括奧利司他、芬特明、芬特明/托吡酯緩釋、氯卡塞林、納曲酮/安非他酮緩釋和利拉魯肽等。但長(zhǎng)期使用減肥藥有潛在的副作用，例如惡心、低血糖、腹瀉、便秘、嘔吐、頭痛、消化不良、疲勞、腹痛。近年來(lái)，許多天然、低毒、安全的減脂成分受到了廣泛關(guān)注，它們可能有助于防止體內(nèi)脂肪堆積，降低肥胖的風(fēng)險(xiǎn)，并用于特殊食品和化妝品中。因此，尋求天然、低毒、安全、靶點(diǎn)明確的生物活性脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)劑成為研究的熱點(diǎn)。而建立一種代替大小鼠的高效、快速檢測(cè)脂肪功能的動(dòng)物模型，成為重中之重。秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans,以下簡(jiǎn)稱線蟲(chóng))是一種生活在濕潤(rùn)陰涼的土壤中以大腸桿菌為食的微小生物。秀麗線蟲(chóng)繁殖快易培養(yǎng)，生命周期短，是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的多細(xì)胞真核生物，并且與人類基因的同源性高達(dá)60%。更重要的是，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的許多核心代謝途徑在秀麗線蟲(chóng)中相當(dāng)保守，包括神經(jīng)肽、血清素和胰島素的合成路徑，脂肪酸合成、延伸、去飽和及β-氧化代謝路徑等。此外，在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的幾種脂質(zhì)調(diào)節(jié)途徑已在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中得到證實(shí)。因此，秀麗線蟲(chóng)是研究脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，評(píng)價(jià)物質(zhì)調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪功能的優(yōu)秀模型系統(tǒng)。線蟲(chóng)脂肪含量的觀察和測(cè)量方法有多種，其中油紅O染色已被證明是評(píng)價(jià)線蟲(chóng)脂肪儲(chǔ)存的最準(zhǔn)確方法。油紅O是一種脂溶性二唑染料，可與線蟲(chóng)的中性脂質(zhì)和膽固醇酯特異性結(jié)合，使這些脂肪著色。線蟲(chóng)大部分脂肪儲(chǔ)存在腸道和皮膚樣的表皮細(xì)胞中，且由于線蟲(chóng)身體是透明的，因此可以通過(guò)觀測(cè)油紅O在線蟲(chóng)體內(nèi)的著色水平來(lái)判斷秀麗線蟲(chóng)脂肪含量，著色大/色深代表油脂含量越多。該測(cè)試方法可為利用秀麗線蟲(chóng)測(cè)試特殊食品和化妝品調(diào)節(jié)脂質(zhì)功能提供科學(xué)支撐。利用秀麗線蟲(chóng)模型對(duì)特殊食品和化妝品調(diào)節(jié)脂質(zhì)的功能進(jìn)行測(cè)試，有科學(xué)的理論基礎(chǔ)，方法清晰詳細(xì)可操作，結(jié)論有效。此外，秀麗線蟲(chóng)屬于低等真核生物，對(duì)動(dòng)物侵害少，不存在倫理學(xué)沖突。因此，本標(biāo)準(zhǔn)希望建立基于秀麗線蟲(chóng)生物模型測(cè)試特殊食品和化妝品調(diào)節(jié)脂質(zhì)功能的實(shí)驗(yàn)方法，特申請(qǐng)立項(xiàng)。三、編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的制定符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的原則。本著先進(jìn)性、科學(xué)性、合理性和可操作性的原則，以及標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性原則來(lái)進(jìn)行本標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。本文件按GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》、GB/T1.2-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定》、T/GDCA013-2022《化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲(chóng)法》、T/GDCA033—2023《化妝品抗羰基化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲(chóng)法》和DB35/T2132-2023《實(shí)驗(yàn)用秀麗隱桿線蟲(chóng)飼育技術(shù)》根據(jù)秀麗線蟲(chóng)模型測(cè)試特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)功能的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合保健食品功能評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則和化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)規(guī)范的要求制定。四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)指標(biāo)確立1.線蟲(chóng)有效樣本量食物實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本量有要求，參考國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)多批次數(shù)據(jù)顯示，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的線蟲(chóng)數(shù)量不少于30只既可以滿足區(qū)分空白組和受試物組的差異，在測(cè)試應(yīng)用上工作量也比較合理。由于線蟲(chóng)培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)逃逸或者死亡的情況，且在油紅染色過(guò)程中會(huì)有一定程度的線蟲(chóng)量損失，建議在受試物干預(yù)初期每組至少測(cè)試200條線蟲(chóng)。2.受試物干預(yù)時(shí)間參考國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)，受試物干預(yù)線蟲(chóng)的時(shí)間一般為3天，可以真實(shí)顯示出空白組和受試物組的差異。為了盡可能延長(zhǎng)受試物干預(yù)時(shí)間，規(guī)定將處于L1期的線蟲(chóng)開(kāi)始進(jìn)行受試物干預(yù)。線蟲(chóng)油紅O染色后，蟲(chóng)體應(yīng)完整清晰，油紅O著色適中。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及結(jié)果判斷有顯著性的差異。在實(shí)驗(yàn)滿足有效性的基礎(chǔ)上，樣品組線蟲(chóng)的總強(qiáng)度值顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明樣品在該濃度下具有減少線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的能力。在同一批次實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)比較不同樣品的線蟲(chóng)脂質(zhì)抑制率來(lái)判定其減脂功效據(jù)查證，目前尚無(wú)運(yùn)用秀麗線蟲(chóng)法測(cè)定特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，本標(biāo)準(zhǔn)屬國(guó)內(nèi)外首次制定，并根據(jù)各企業(yè)單位實(shí)際情況提供了實(shí)驗(yàn)條件的參考范圍，有利于標(biāo)準(zhǔn)后續(xù)的實(shí)施。六、參考資料1.中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院令第727號(hào)《化妝品監(jiān)督管理?xiàng)l例(2021)》2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局關(guān)于發(fā)布《化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)規(guī)范》的公告(2021年第50號(hào))附件：化妝品功效宣稱評(píng)價(jià)規(guī)范3.GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則》4.T/GDCA013—2022《化妝品抗氧化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲(chóng)法》5.T/GDCA033—2023《化妝品抗羰基化活性的評(píng)價(jià)秀麗線蟲(chóng)法》6.DB35/T2132-2023《實(shí)驗(yàn)用秀麗隱桿線蟲(chóng)飼育技術(shù)》7.《允許保健食品聲稱的保健功能目錄非營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑(2022年版)》七、驗(yàn)證數(shù)據(jù)1.測(cè)試樣品白蕓豆壓片、左旋肉堿茶多酚薄荷片、決明子膠囊購(gòu)自市售產(chǎn)品；奧利司他購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司；姜黃素和茶多酚。N2野生型秀麗線蟲(chóng)購(gòu)自秀麗線蟲(chóng)遺傳學(xué)中心，由福建上源生物科學(xué)技術(shù)有2.驗(yàn)證結(jié)果驗(yàn)證單位(福建上源生物科學(xué)技術(shù)有限公司、廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司)對(duì)常見(jiàn)脂質(zhì)調(diào)節(jié)樣品進(jìn)行脂質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試。以下是測(cè)試結(jié)果，詳細(xì)數(shù)據(jù)請(qǐng)見(jiàn)原測(cè)試報(bào)告。福建上源生物科學(xué)技術(shù)有限公司驗(yàn)證報(bào)告：左旋肉堿白蕓豆組別對(duì)照奧利司他左旋肉堿訣明子白蕓豆廣東丸美生物技術(shù)股份有限公司驗(yàn)證報(bào)告：組別對(duì)照奧利司他姜黃素茶多酚實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：經(jīng)驗(yàn)證，兩家實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性對(duì)照(奧利司他)測(cè)試數(shù)據(jù)一致，奧利司他均能顯著降低線蟲(chóng)油紅O染色的油紅強(qiáng)度值(p<0.05),即能減少線蟲(chóng)脂質(zhì)的積累，具有降低機(jī)體脂質(zhì)含量的作用。多種原料及產(chǎn)品配方驗(yàn)證結(jié)果表明：該方法適用于水溶性和非水溶性原料的紙質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)定；在姜黃素、茶多酚、白蕓豆壓片、左旋肉堿茶多酚薄荷片的作用下，能顯著降低線蟲(chóng)油紅O染色的油紅強(qiáng)度值(p<0.05),即能減少線蟲(chóng)脂質(zhì)的積累；在決明子膠囊的作用下