大白菜霜霉病診斷及檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)

1由卵菌門霜霉屬寄生霜霉菌（Peronosporaparasitica(Pers.)Fr.）引起的一種氣傳病害，屬專性寄生性卵菌病害，該病害是我省大白菜最重要的葉部病害之一，不同生育期均嚴(yán)重發(fā)生，流行重病大白菜病部出現(xiàn)的異常特性，如葉片呈現(xiàn)淡黃色或黃綠色病斑，后呈黃褐色，多角形或不規(guī)則形大白菜病部出現(xiàn)病原菌子實(shí)體，如葉背病部產(chǎn)生白色至灰白色霜狀霉層等。2病情指數(shù)(縮寫為Dl)又叫發(fā)病指數(shù)、感染指數(shù)，與發(fā)病率一樣是表示發(fā)病程度的一種方法。發(fā)病率是指一個(gè)群體中發(fā)病的多少，用百分率表示，病情指數(shù)(DI)是根據(jù)一定數(shù)目的植株或植株器官各病級(把植株或植株某一器官感染病害輕重程度劃分為等級稱為病級)核計(jì)其發(fā)病株(器官)數(shù)所得帶光源的擴(kuò)大鏡、雙目解剖鏡(l0x～50x)、顯微鏡(100x～1000x)、離心機(jī)(1000r/min~成、10%氫氧化鉀溶液配制：取氫氧化鉀1用解剖針挑取病斑上霉?fàn)钗镏破R檢，用顯微鏡觀察有無病原菌的孢囊梗和孢子囊，記錄其形態(tài)將未發(fā)現(xiàn)霜霉層的可疑大白菜病斑及碎片，置250ml三角瓶內(nèi)，加適量蒸餾水浸軟，振蕩器激烈沉淀液置載玻片上，蓋上蓋玻片，用顯微鏡檢查有無大白菜霜霉病菌的孢囊梗和孢子囊，每批樣品至3選取病葉上霉?fàn)钗锵∩俚睦喜“咧糜谛?，加適量10%的氫氧化鉀溶液，煮沸5濕條件誘導(dǎo)發(fā)病，2～3周產(chǎn)生明顯病斑及大量病菌后，制片制片、鏡檢和顯微照相描述孢囊梗、孢子采集典型大白菜霜霉病葉，毛筆沾取葉面病菌于盛有無菌水的燒杯中，再滴加1000μg/mL十二烷基硫酸鈉（SDS)，高速攪拌（1200r/min)3min～5min后獲得孢子囊懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子囊并稀釋至接種濃度，調(diào)至孢子囊濃度為5×105個(gè)/ml。為了不影響接種效果，孢子囊懸浮液放出為止。接種后白菜植株置于適宜環(huán)境條件下，黑暗保濕（RH為70%～80%)12濕條件下光照14h每天。接種期間白天溫度控制在25℃~28℃范圍內(nèi)，夜晚溫度控制在20℃~22℃織上收集大量病菌繁殖體，制備玻片進(jìn)行顯微觀察描述，并制備孢子囊懸浮液；將收集或制備的孢子囊懸浮液接種于健康大白菜葉片，經(jīng)適宜條件誘發(fā)出產(chǎn)生典型大白菜霜霉病癥狀；從接種發(fā)病的大白4為掌握大白菜霜霉病發(fā)生動(dòng)態(tài)，5點(diǎn)取樣、間隔7天調(diào)查一8.4病株率(percentageofdiseasedp根據(jù)病害癥狀描述，逐份材料進(jìn)行調(diào)查，用分級法表示大白菜病葉的發(fā)病程度,記載病情級別，s——各病情級別代表數(shù)值；S——最高病情級別代表值。6大白菜霜霉病病原菌（Peronosporaparasitica(Pers.)Fr.）屬管毛生物界(Stramenopila)卵菌門(Oomycota)卵菌綱（Oomycetes）霜霉目(Peronosporales)，霜霉科（Peronosporaceae），霜霉菌絲體無色，無隔，在細(xì)胞間生長，靠吸器伸入細(xì)胞內(nèi)吸收水分和營養(yǎng)，吸器為囊狀、球狀或分主枝基部稍膨大，重復(fù)二叉狀分枝，頂端2～5次分枝，主軸和分枝呈銳角，頂端小梗尖銳，彎曲，每管，不形成游動(dòng)孢子。卵孢子單胞，球形，黃褐色，直徑30～40μm表面光滑，胞壁厚，表面皺縮或A.3.1子葉期發(fā)病，葉背出現(xiàn)白色霉層，高溫條件下，病部常出現(xiàn)近圓形枯斑，嚴(yán)重時(shí)莖及葉A.3.2成株期，葉正面出現(xiàn)淡綠至淡黃色小斑點(diǎn)，擴(kuò)大后呈黃褐色，病斑受葉脈限制，呈多角種株受害，葉、花梗、花器、種莢均可長出白霉，花梗、花器肥大畸形，花瓣綠色，種莢淡黃色，瘦大白菜霜霉病菌卵袍子產(chǎn)生于病葉組織內(nèi)，病葉經(jīng)冰凍勻漿使大多數(shù)葉肉組織、氣孔細(xì)胞及維管取直徑為1cm大白菜霜霉病病斑或可疑葉片，稱量0.1g葉片(約含葉片15～20個(gè))，加磷酸緩沖液(pH:7.O)2ml，用玻棒攪拌，在室溫下靜置15min，放入-18℃冷凍室內(nèi)漿器內(nèi)，加(1～2)mL磷酸緩沖液沖洗，勻漿4～6min,用孔徑為60μm篩網(wǎng)，收集濾液后，1000r/min離心3min，去上清液，加乳酚油定容至1mL,每批樣品至少檢查10個(gè)74℃離心5min），取上清菌液5mL；病組織或菌液分別加液氮冷凍研磨，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中待用。塑料杵碾碎待用。盛有不用病菌來源的DNA離心管分別加入300～500uLCTAB提取液（其中含0.1g蛋5min；上清用體積的氯仿：異戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃離心5min）；取上清，加），）；淀