0809膠體金快速免疫診斷技術

ColloidalGoldLateral-FlowDiagnosticTechnology

膠體金免疫層析快速診斷技術------閔微，研發(fā)部快速檢測快速檢測是一種廉價的、一次性的、基于膜的檢測方法，它能提供分析物存在于液體樣品的視覺證據(jù)。這種檢測可以以獨立的試紙條，也可以以裝在塑料盒中的方式進展?？偟膩碚f，做此項檢測至少需求200ul的液體標本，可在2至5分鐘內(nèi)完成。在臨床檢測中，樣品能夠有尿、血液、血清、唾液或其他體液。在非臨床檢測中，樣本能夠是由土壤、粉塵、植物或者食品制備的微量溶液，它們同樣可以直接運用膜試紙條檢測。這種檢測方法無需儀器操作，可運用于臨床、實驗室、室外或者家庭——通常為無操作閱歷人員運用。2快速膜檢測需求廣泛，可運用于諸多領域〔見下表〕。隨著靈敏度和特異性的提升，大量的潛在運用能夠是作為替代昂貴儀器檢測方法的低本錢選擇。34為何運用金標志早期的快速檢測運用有色膠乳構(gòu)成可視信號，目前的某些檢測仍運用此手段。過去和如今，乳膠法不斷是凝集反響主要的標志方法，這是由于它在結(jié)合成分的存在下易于凝集。對于快速檢測而言，交聯(lián)物的穩(wěn)定性是防止假陽性的關鍵，而易于凝集能夠就是其產(chǎn)生假陽性的主要問題。由于具有更好的潛在穩(wěn)定性，20世紀80年代末，金標志被引入膜快速檢測中。在適當?shù)南M條件下，任何被準確大小的金顆粒都可以被重現(xiàn)性制造出來。不同的大小可用于不同的用途。其優(yōu)良的穩(wěn)定性、敏感性、準確性及可反復消費性等特點使得金適宜于在快速檢測中的運用。金本性屬惰性元素，被適當加工可構(gòu)成完好的球形顆粒。當正確銜接時，蛋白質(zhì)能結(jié)實地結(jié)合在金顆粒外表，無論是液態(tài)或固態(tài)都能堅持長久的穩(wěn)定性。而且，假設是在制造過程中蛋白被準確固定，其與金交聯(lián)物的非特異性結(jié)合可被減至零。56膠體金技術來源及現(xiàn)狀來源1971年,Faulk和Taytor引入

7原理免疫膠體金技術是以膠體金作為示蹤標志物運用于抗原抗體的一種新型的免疫標志技術。膠體金是由氯金酸〔HAuCl4〕在復原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體形狀，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團構(gòu)成結(jié)實的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、外形及顏色反響，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因此使膠體金廣泛地運用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。8現(xiàn)狀層析法(Lateral-Flow)滲濾法(Through)免疫金銀染色法膠體金的作用:指示劑910與常規(guī)診斷方法相比優(yōu)點缺點快速：全部檢測過程僅需3-10分鐘。簡便：不需其它任何儀器設備，操作也極其簡單，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時隨地進行。廉價：單個測試條成本極低

可單份檢測：對標本既能成批檢測，又可單份檢測，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。

穩(wěn)定性好：金標試劑穩(wěn)定，可長期保存。

檢測標本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題11技術運用類別應用領域檢測的物質(zhì)人類醫(yī)學各級醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染?。ㄒ腋挝屙?HIV,SARS等）標志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站,商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染?。ㄇ萘鞲?獸瘟疫等）病毒（煙草花葉病毒、犬細小病毒等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門,研究機構(gòu)有害物質(zhì)超標食品安全食品安全檢測中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素12膠體金層析法一個快速檢測的底層普通是硝酸纖維素膜，在它上面固定了檢測蛋白，通常是抗體或抗原。銜接著膜的是包含有枯燥金標的金標墊〔通常是玻璃纖維〕。對于目前大多數(shù)可做的檢測工程，這種結(jié)合墊含有吸附了針對待檢分析品的特異性抗體或抗原的金粒子。樣品墊通常為紙質(zhì)，附著著結(jié)合墊。當運用樣品墊時，液體樣品經(jīng)過毛細分散作用穿移過結(jié)合墊，再水化金交聯(lián)物，使待分析樣品與交聯(lián)物相互作用。然后金交聯(lián)物與待分析樣品復合物轉(zhuǎn)移至膜條帶上再移向蛋白結(jié)合物，復合物在此處被固定后以一條細細的紅線的方式產(chǎn)生明顯的信號。第二條線是控制線，由余下的金交聯(lián)物構(gòu)成于膜上，闡明測試完成。13試紙條組成構(gòu)造測試線〔T線〕控制線〔C線〕膠體金墊吸水濾紙樣品墊NC膜〔硝酸纖維素膜〕層析方向PVC底板14層析法技術優(yōu)勢:簡單\現(xiàn)場\快速1.翻開包裝取出試紙條2.直接插入待測樣品中3.目測讀出結(jié)果〔3-10分鐘內(nèi)〕15免疫層析法檢測原理分類引見

〔雙抗體夾心〕〔以HCG檢測為例〕16免疫層析法檢測原理分類引見

〔競爭反響〕〔以嗎啡檢測為例〕17免疫層析法檢測原理分類引見

〔運用proteinA金標〕〔以HIV檢測為例〕膠體金滲濾法將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾安裝。在加抗原〔抗體〕后，迅速加抗體〔抗原〕，再加金標志第二抗體，由于有滲濾安裝，反響很快，在數(shù)分鐘內(nèi)即可顯出顏色反響。此方法已勝利地運用于人的免疫缺陷病病毒〔HIV〕的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。18膠體金銀染色法膠體金銀染色法〔Dot－IGS／IGSS〕是將斑點ELISA與免疫膠體金結(jié)合起來的一種方法。將蛋白質(zhì)抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反響后，再滴加膠體金標志的第二抗體，結(jié)果在抗原抗體反響處發(fā)生金顆粒聚集，構(gòu)成肉眼可見的紅色斑點，此稱為斑點免疫金染色法〔Dot－IGS〕。此反響可經(jīng)過銀顯影液加強，即斑點金銀染色法〔Dot－IGS／IGSS〕。1920膠體金免疫層析系統(tǒng)

技術道路21技術道路膠體金制備技術標志技術NC膜與溶液噴點膠體金墊與溶液噴點樣品墊吸水紙粘性底板枯燥方法溶液體系分析裝配\切條\包裝膠體金的制備22制備原理一切的消費方法都是運用復原劑提供電子給溶液中帶正電荷的金離子而產(chǎn)生金原子，如下所示：氯金酸＋復原劑＝膠體金HAuCl4+e–=Au0通常運用的復原劑包括檸檬酸鈉、黃磷、硼氫化鈉、硫氰酸鈉。2324根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標志探針，其直徑應在3-30nm范圍內(nèi)。在氯化金〔HAuCl4〕水溶液中參與復原劑使之復原并聚積構(gòu)成膠體金粒子。運用不同種類、不同劑量的復原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反響溶液中最初復原試劑和復原核的數(shù)量。復原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的復原也就從更多的復原中心開場，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每添加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。25以檸檬酸鈉和單寧酸做復原劑，可以制備大小相對一致、直徑3～16nm的膠體金。因此普通膠體金探針均運用該方法進展。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2可以去除這些殘基。雙標志或制備5-10nm的膠體金時建議運用該方法。利用檸檬酸為復原劑，可以制備12～150nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時添加。因此做單標志時，建議運用該方法制備12-16nm直徑的膠體金。除了上述方法外，也可以用磷作為復原劑來制備5nm的膠體金，它防止了單寧酸殘基的問題，但所構(gòu)成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進一步處置，故該方法曾經(jīng)很少運用。26白磷復原法制備5nm膠體金取250ml三角瓶一個，加79ml雙蒸水，1ml1%氯化金，并用0.25MK2CO3將溶液調(diào)至中性〔pH7.0〕。取0.2ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5ml試管中，再加0.8ml乙醚，混勻。取0.7ml參與溶液〔1〕中(磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進展中和)。室溫下悄然搖勻15min，然后加熱沸騰并堅持5min，自然冷卻。27單寧酸/檸檬酸鈉法制備3～16nm膠體金取一250ml三角瓶，參與79ml雙蒸水和1ml1％氯化金，預熱至60～70℃。取一50ml燒杯，參與4ml1％檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小參與不同用量的單寧酸及等量的25mMK2CO3。預熱至60～70℃。K2CO3的作用是堅持溶液的中性pH。因此假設單寧酸的量少于0.5ml時，對pH的影響不大，K2CO3可以省略。將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。28檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）45000342000445006412084701041016檸檬酸三鈉法制備12-30nm膠體金(Frens,1973)取250ml三角瓶一個，加100ml雙蒸水及1ml1%氯化金，加熱沸騰；取不同量的1%檸檬酸鈉參與上述溶液中?；靹?，再堅持沸騰30min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，那么顏色偏向紫色。29檸檬酸鈉(ml) 膠體金(nm) 5 12 4 16 3 24 2.8 30 制備高質(zhì)量膠體金的本卷須知〔1〕玻璃器皿必需徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處置〔1％雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時，烘干〕的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后運用。否那么影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預期大小的金顆粒。〔2〕試劑配制必需堅持嚴厲的純真，一切試劑都必需運用雙餾水或三餾水并去離子后配制，或者在臨用前將配好的試劑經(jīng)超濾或微孔濾膜〔0.45μm〕過濾，以除去其中的聚合物和其它能夠混入的雜質(zhì)?！?〕配制膠體金溶液的pH以中性〔pH7.2〕較好?！?〕氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最好是進口的?！?〕氯金酸配成1％水溶液在4℃可堅持數(shù)月穩(wěn)定，由于氯金酸易潮解，因此在配制時，最好將整個小包裝一次性溶解，暫時不用的可以用1.5ml試管分裝為1ml保管〔-20℃〕。30由于運用試劑質(zhì)量及其它方面能夠存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與實際值能夠有偏向，因此，在制備完成后必需進展鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏向太大，粒子凝聚，粒子邊緣不明晰等問題，須重新制備。膠體金溶液最好保管在4℃冰箱中；也可保管在室溫下，普通可保管1-2個月。但決不可保管在0℃以下，否那么金粒子發(fā)生凝聚。31蛋白-金復合體的制備32必需了解蛋白與膠體金耐久結(jié)合的物理及化學進程，僅僅把交聯(lián)物揉合到一同，雖然本錢低廉且簡易，卻通常會導致聚集體的構(gòu)成。一種好的交聯(lián)物表現(xiàn)為蛋白吸附于金的外表上，與膠乳不同的是，蛋白是被動地吸附于交聯(lián)物外表，因此不會出現(xiàn)共價結(jié)合。33普通以為膠體金粒子外表為一層AuCl2，因此，粒子外表帶有負電荷，這種負電荷粒子之間相互排斥，構(gòu)成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。金顆粒外表可以包被一層生物大分子〔如蛋白〕來穩(wěn)定和維護這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一同。膠體金粒子對蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時為中性。由于在pH=pI時蛋白溶解度最小，因此這時它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子外表。但在實踐的膠體金探針制備中，普通膠體金調(diào)整為pH=PI+0.5，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下，二者容易構(gòu)成結(jié)實的結(jié)合物。假設膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，那么會聚集而失去結(jié)合才干。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。34蛋白經(jīng)過以下機制于幾秒之內(nèi)吸附于金外表金粒子所帶負電荷與蛋白內(nèi)氨基酸〔如賴氨酸〕所帶陽性電荷的最初的相互吸引蛋白經(jīng)過某些氨基酸殘基包括色氨酸與金粒子外表之間的疏水吸附作用蛋白中的半胱氨酸的硫基與金粒子間的配價結(jié)合35金顆粒大小的選擇檢測信號是由金顆粒聚集于測試線或控制線而出現(xiàn)的信號。這些粒子必需足夠大到能被看見，粒子的尺寸越大，這些粒子聚集后就越容易被看見。隨著粒子尺寸的增大，位阻景象又成了一個問題。此外，這些粒子的尺寸越大，它們在既定體積溶液中存在的數(shù)量越小。這種可見度的需求與位阻景象之間的矛盾景象闡明，對于大多數(shù)的免疫檢測運用而言，最適的粒子大小是40nm。在某些情況下當位阻景象成為較大問題時〔如針對較小的抗原〕，20nm的粒子那么更為適宜；當希望出現(xiàn)更深顏色或當分子外表較低的曲率提高了抗原抗體分子間的交互作用，較大一點的粒子那么更為可取。應該由實驗決議確定多少顆粒大小能帶來高靈敏度、淺背風光和高穩(wěn)定性。3637蛋白必需求經(jīng)過前處置〔1〕去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進展?！?〕使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時與多個膠體金粒子結(jié)合，影響標志的靈敏度和定量分析?！?〕使蛋白具有適當?shù)姆肿恿俊５鞍追肿恿窟^小〔30kD〕，構(gòu)成的金-蛋白復合體往往是不穩(wěn)定，可短時間內(nèi)失活。而分子量過大時，被以為影響金-蛋白復合體的靈敏度，特別是知蛋白的構(gòu)造與活性中心的情況下，去除對活性武影響的構(gòu)造部分是提高標志靈敏度，延伸金-蛋白復合體壽命〔防止凝集〕的有效方法。把分子量過小的蛋白與其它蛋白〔如BSA，牛血清蛋白等〕結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的金-蛋白復合體。3839抗體Antibody來源差別:鼠抗,兔抗和羊抗種類差別:單抗,多抗腹水的處置:飽和硫酸銨沉淀法特異性:親和層析柱濃度:濃縮溶解液:不含鹽,例如PB抗原抗體生物原料抗原Antigen偶聯(lián)抗原物質(zhì):BSA,OVA等毒品檢測來源:合成抗原待標志蛋白溶液的制備

將待標志蛋白預先對0.005Mol/LpH7.0NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100000g4℃離心1h，去除聚合物。40確定膠體金與蛋白結(jié)合的最正確pH值

對于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只需某一特定pH值可以構(gòu)成結(jié)合最穩(wěn)定的金-蛋白復合體。在高濃度電解質(zhì)〔如NaCl〕作用下不會凝聚。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不一樣。普通選擇最小適宜pH值為最正確pH值。但有些金-蛋白復合體的實踐情況并不完全如此，最穩(wěn)定金-蛋白復合體并不完全代表活性最好。這要靠實驗驗證。這里需求特別指出的是，運用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時，除了蛋白量完全不同外，往往最正確pH也有一定變化。41由于膠體金溶液能夠損壞pH計的電板，因此，在調(diào)理pH時，采用精細pH試紙測定為宜。由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質(zhì)的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必需留意，蛋白質(zhì)溶液應絕對廓清無細小微粒，否那么應先用微孔濾膜或超速離心除去。普通情況下應防止磷酸根離子和硼酸根離子的存在，由于它們都可吸附于顆粒外表而減弱膠體金對蛋白質(zhì)的吸附。42蛋白質(zhì)最適用量的選擇參與蛋白質(zhì)的量缺乏以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉景象；而參與蛋白量到達或超越最低穩(wěn)定量的各管仍堅持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標志蛋白質(zhì)的最低用量，在實踐任務中，可適當添加10％～20％?？梢詷?gòu)成穩(wěn)定金-蛋白復合體的蛋白的最小量。假設在制備金-蛋白復合體時參與太多的蛋白，不僅呵斥浪費，而且更為嚴重的是容易呵斥金-蛋白復合體凝聚，并嚴重影響標志活性。由于金-蛋白復合體溶液中的游離蛋白容易搶先與標志位點結(jié)合，起到“封鎖〞〔Blocking〕作用，而標志蛋白標志不上。在標志位點希少、被標志物含量較少的情況下要特別留意。43膠體金標志蛋白的純化超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標志蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/5