動(dòng)物甲型H1N1（2009）流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法

動(dòng)物甲型H1N1(2009)流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法本指導(dǎo)性技術(shù)文件規(guī)定了動(dòng)物甲型H1N1(20本指導(dǎo)性技術(shù)文件適用于快速檢測咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、組織樣品等臨床樣品中甲型GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB19442高致病性禽流感防治技術(shù)規(guī)范Ct值Cyclethreshold，反應(yīng)管的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所DEPCdiethylprocarbonate,二乙基焦FAM6-carboxy-flPBS磷酸鹽緩沖液pH1N1（2009）pandemicH1N1virusof2009，甲型H1N1(2009)流感病毒RT-PCRreversetranscriptionPolym4儀器與試劑4.1儀器與材料——實(shí)時(shí)熒光PCR儀；1——混勻器；）；）；——離心管；——PCR光學(xué)反應(yīng)管。除另有規(guī)定，本方法試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682上游引物pH1N1(2009)F序列為：5'列為：5'-GGAACCGATTCTTA(C/T)它熒光基團(tuán)及其相應(yīng)的淬滅基團(tuán)。采用無DNA酶、無RNA酶水將每條引物與探針配制成100μmol/L儲存液，置-20℃或更低溫度凍存。使用時(shí)取適量配制成10μmol/L工作液，避免多次凍融。4.2.3一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR——DEPC水(按照附錄A制備，推薦使用商品——三氯甲烷；——異丙醇；——無水乙醇；——70％乙醇（用新開啟的滅菌雙蒸水配制，-20℃預(yù)冷5生物安全要求2樣品的采集、保存及運(yùn)輸應(yīng)符合GB/T18088將滅菌的棉拭子插入豬鼻腔，輕輕擦拭3～5次并慢慢旋轉(zhuǎn)，然后取出拭子并放入盛有2mL滅菌的PBS(內(nèi)含青霉素2000IU/mL，采集被采樣人員的咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管抽取物、痰等物品。樣品不得混待檢樣品在2℃~8℃保存不應(yīng)超過24h；-20℃保存不超過三個(gè)月；-80℃以下可長期保存。樣品將采集的樣品于旋渦振蕩器上振蕩混勻約5s后，于離心機(jī)b)每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL，再加入200μL氯3c)取滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃d)于4℃12000g離心10min，棄上清，倒置于吸水e)10000g離心10s，用微量加樣器將8.1反應(yīng)體系配制配制的每個(gè)PCR反應(yīng)試劑充分混勻，瞬8.2.2.1反應(yīng)條件設(shè)定②熱啟動(dòng)95℃10min(不同的生產(chǎn)商家推薦的時(shí)間不同，應(yīng)根據(jù)8.2.2.2通道選擇報(bào)告熒光（ReportDye）設(shè)定為FAM（或按探針實(shí)際標(biāo)記的熒光基團(tuán)設(shè)定淬滅熒光（QuenchDye）設(shè)定為None，校準(zhǔn)熒光（Referencedye）設(shè)定為None。可根據(jù)不同品牌儀器說明等效設(shè)置參數(shù)。9分析條件設(shè)定和結(jié)果判定4設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，具體還需根有明顯的對數(shù)增長期（典型擴(kuò)增曲線的圖例見附錄C），才可判定試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無效。9.3熒光PCR結(jié)果分析及判定9.3.1陽性反應(yīng)結(jié)果判定在試驗(yàn)成立的條件下，檢測結(jié)果呈現(xiàn)Ct值≤35且呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為熒光PCR陽性反應(yīng)，9.3.3可疑反應(yīng)結(jié)果判定9.3.4可疑樣品處理檢測的Ct值<40，且呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為陽性反應(yīng)，表明pH1N15A.10.01mol/LPBS(pH7.2～7.4)加三蒸去離