食用菌制種工藝流程工藝

食用菌制種工藝流程尤昌建隨著食用菌產業(yè)的蓬勃開展，菌種需要量隨之增加，而現有菌種生產單位明顯偏少，許多菇農不得不向外引種。長途購運菌種不僅花費大，本錢高而且菌種因破瓶而易引起雜菌污染，從而嚴重影響栽培食用菌的經濟效益。菇農假設能掌握菌種生產程序和制種技術，自行制種，逐步開展成制種專業(yè)戶，也是一項很好的致富門路。菌種生產程序，通常分為母種、原種和栽培種，也就是通常所說的一級、二級、三級菌種。其中母種的別離選育技術性強，要求精化；而原種和栽培種的制作那么比較簡單。一、母種的別離選育母種主要采用人工選擇、誘變育種、雜交育種和原生質融合等手段獲得。作為一般制種專業(yè)戶，可以采用人工選擇方式別離培育母種。1、采集種源

從野生或人工栽培群體中，選擇有代表性的優(yōu)良菇體作為種源。種菇的標準是：八成熟，朵形圓正、肉質肥厚，無病蟲害。采集1--2朵符合上述標準的種菇編上號碼，作為別離母種的材料。從栽培室采集的應標有原菌株代號。2、培養(yǎng)基配制瓊脂培養(yǎng)基〔PDA培養(yǎng)基〕馬鈴薯200--250克，瓊脂15--20克，葡萄糖20--25克，清水1000毫升。也可以加硫酸鎂1--1．5克，維生素B1微量，磷酸二氫鉀2--3克。先將馬鈴薯洗凈去皮，挖去芽眼，切成薄片，置于鋁鍋內加水煮沸30分鐘，撈起后用4層紗布過濾，取汁。然后將瓊脂參加汁內，邊加熱邊攪拌，讓瓊脂充分溶化；再將葡萄糖等參加，稍煮幾分鐘后，同樣用4層紗布過濾，取其汁液。將汁液趁熱裝入玻璃試管內。裝至管長的1／5，管口用棉花塞緊，或將汁液裝入玻璃三角瓶內，裝量20毫升。然后置于高壓鍋內，在98--108千帕／厘米的壓力下滅菌30分鐘左右。滅菌后及時取出，趁熱將試管斜排于桌面上，冷卻后即成為固體斜面培養(yǎng)基。3、母種別離方法(1)孢子彈射法。將種菇外表消毒，吸干水分后，將菇體懸掛于裝有瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶內，讓菇體內的袍子自然散落在培養(yǎng)基上萌發(fā)菌絲。也可以剪取一小塊菇體，貼附在試管斜面培養(yǎng)基外表，讓孢子散落在培養(yǎng)基上萌發(fā)菌絲，即能獲得母種。(2)組織別離法。將消毒過的種菇，在接種箱內用手從菇柄處對半掰開，或用刀片切開，使菇體形成對開。在菌蓋和菌柄交界處或菌褶處，用接種刀切取一小塊菇體，然后縱切成5毫米x10毫米的小薄片，用接種針挑取一小塊，接入斜面培養(yǎng)基的中央，待其萌發(fā)菌絲，即可得到母種；(3)基內別離法。選擇已長菇的木段，削去樹皮及表層木質部，用75％的酒精消毒后，鋸成1厘米厚的薄片，放入0．1％的升汞水中消毒1--2分鐘，再用滅菌水洗去殘液。然后再將小薄片劈成0．5--1厘米寬的小條，接入斜面培養(yǎng)基中央，待長出菌絲后即得母種。也可以在已長菇的菌袋中，經消毒處理后，用接種針鉤取袋內色澤純、長勢旺的菌絲體，接種在試管斜面培養(yǎng)基中央，待萌發(fā)菌絲后，同樣獲得菌種。4、適溫培養(yǎng)通過上述不同方式將菌種別離接種于試管后，要及時將試管移入已消毒的培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室內培養(yǎng)，溫度控制在25℃左右，使別離獲得的孢子或菌絲在適溫下發(fā)育。一般孢子彈射3--4天后孢子萌發(fā)成菌落，10天后菌絲長滿管；組織別離接種后2--3天，菌絲即萌發(fā)，并在培養(yǎng)基上蔓延生長；菇木別離接種后，7天菌絲即恢復生長。5、選育提純

通過上述方法得到的菌絲，不一定都是優(yōu)質的，還需要選育提純。因此，在菌絲萌發(fā)后，要認真觀察，挑選色澤純、健壯、長勢正常、無間斷的菌絲，在接種箱內連同培養(yǎng)基鉤取菌絲，接入另備的試管培養(yǎng)基上。在23--25℃的恒溫條件下，培養(yǎng)7--10天，待菌絲長滿管后，再進行觀察，從中擇優(yōu)取用，即為“母代〞母種。6、轉管擴接母代母種可以轉管擴接成“子代〞母種。采用同樣的斜面培養(yǎng)基，每支可擴接30--50支子代母種。生產上供給的多為子代母種。它可以再次轉管擴接。一般每支可擴接成20--25支子代母種，但轉管次數不得超過5次。7、出菇試驗別離選育的母種，還必須進行出菇試驗。方法是：把母種接種于瓶或袋裝的木屑培養(yǎng)基上，根據各種菇耳種性對溫度的要求，進行適溫培養(yǎng)，直至出菇才證實可用于生產。二、原種繁殖培養(yǎng)將母種接在瓶或袋的木屑培養(yǎng)基上，通過培養(yǎng)，即成原種。1、原種木屑培養(yǎng)基配方雜木屑77．5％，麥麩20％，蔗糖1％，石膏粉1．2％，硫酸鎂0．3％。pH值(滅菌前)6．5--7，含水量調至60％。將上述原、輔料混合拌勻，裝入750毫升的玻璃菌種瓶內，裝料要求下松上緊。瓶口塞緊棉花，再用牛皮紙包住瓶頸與棉塞。然后置于高壓滅菌鍋內，在147千帕／平方厘米壓力下滅菌2--2．5小時。也可進行常壓滅菌，在100℃下保持10--11小時，達標后趁熱取出，讓其冷卻。2、接入菌種待料溫降至25℃以下時，在無菌條件下，將試管種分割成假設干決，通過酒精燈火焰迅速接入原種培養(yǎng)基上，每支母種可按4--6瓶原種。3、發(fā)菌培養(yǎng)接種后及時將玻璃菌種瓶移入25℃菌種培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)?？臻g相對濕度控制在70℃以上，防止強光照射。原種培養(yǎng)時間一般菇類需要40--50天，草菇、銀耳只需15--20天即可。4、去雜選優(yōu)原種培育過程中，要每天進行觀察，如發(fā)現有雜菌污染的，應立即淘汰三、栽培種擴大培育將原種再次擴接在同樣的木屑培養(yǎng)基上，在適溫條件下培養(yǎng)30--35天即為栽培種(又叫生產種)，可用于生產栽培。栽培種可用750毫升菌種專用瓶，由于使用量大，所以通常多采用聚丙烯菌種袋。袋的規(guī)格有12厘米x24厘米、15厘米x28厘米、17厘米x33厘米等，可根據各種菇耳特性和當地習慣選擇使用。培養(yǎng)基滅菌采用常壓滅菌灶滅菌，要求滅菌溫度達100℃，保持8--10小時，達標后趁熱卸袋冷卻。待料溫降至25℃以下時，在無菌條件下接入選定品種的原種。每瓶原種可擴接成50--60瓶栽培種。菌種培育室要求潔凈，防強光，室溫掌握在23--25℃，并經常檢查，發(fā)現雜菌污染應及時淘汰，不斷選優(yōu)去劣。當菌絲長滿袋，尖端菌絲反轉上爬1--3厘米時，為適齡的栽培種

在自然界里，食用菌都不是單獨存在的，而是和許多細菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種別離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌別離出來，通過培養(yǎng)，獲得純的優(yōu)良菌種。(一〕母種的別離培養(yǎng)食用菌母種的別離，可分為孢子別離法、組織別離法以及基內菌絲別離等。1.孢子別離法孢子別離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發(fā)成菌絲，培養(yǎng)成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。

〔1〕單孢別離法是每次或每支試管只取一個擔孢子，讓它萌發(fā)成菌絲體來獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢別離得到的菌絲，有結實能力，可采用此法別離生產純菌種。單孢別離生產上較少采用，而且技術復雜，一般采用多孢別離法?！?〕多孢別離法就是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。①種菇孢子彈射法選擇個體健壯、朵形圓正，無病蟲害、出菇均勻、高產穩(wěn)產，適應性強的八九分成熟的種菇，切去大局部，菌柄用無菌水沖洗數遍后再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸干外表水分。在接種箱或無菌室內，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面；上端小孔用棉花塞住。培養(yǎng)皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養(yǎng)皿內。形成一層粉末狀孢子印〔平菇極淡紫色，蘑菇、草菇為褐色，香菇、金針菇孢子印白色〕。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種。待孢子萌發(fā)，生成菌落時，選孢子萌發(fā)早、長勢好的菌落進行試管培養(yǎng)。還可用孢子采集器收集孢子。方法是選好種菇后，按上述程序，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上，放在培養(yǎng)皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鐘掌周圍塞好。并在紗布上倒少許升汞或無菌水。移入20℃左右恒溫箱培養(yǎng)。②褶上涂抹法按無菌操作別離時；應選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片外表子實體尚未彈射的孢子，再在培養(yǎng)基上劃線接種。③鉤懸法取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片〔黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用無菌不銹鋼絲〔或鐵絲、棉線等其他懸掛材料〕懸掛于三角瓶內的培養(yǎng)基的上方，勿使接觸到培養(yǎng)基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養(yǎng)、轉接即可。④貼附法按無菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊，用溶化的瓊脂培養(yǎng)基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養(yǎng)基正上方的試管壁上。經6～12小時的培養(yǎng)，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同局部瓊脂培養(yǎng)基移植到新的試管中培養(yǎng)即可。孢子別離得到的母種、必須進一步提純復壯，當母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉管擴大，一般到栽培種，轉管不宜超過5次。

孢子別離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑒定為優(yōu)質菌種后，才可供生產使用。

一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢別離法獲得母種。例：銀耳孢子別離按無菌操作獲取種耳后，懸掛種耳的三角瓶經12小時培養(yǎng)后，瓶底培養(yǎng)基外表就有“孢子印〞。取出種耳，置20℃—25℃溫箱培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)基外表會出現乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時移接入試管斜面培養(yǎng)基上，待長滿斜面后，再移接入營養(yǎng)豐富，且外表比較枯燥的培養(yǎng)基上。經30天左右，菌落長出白色菌絲。

銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌〔香灰菌絲〕混合培養(yǎng)時，由后者幫助分解木材及其他一些纖維物質，提供營養(yǎng)，才能利于銀耳孢子萌發(fā)，菌絲的定植和子實體的形成。在兩種菌絲交會時，先選出兩種純菌絲。

羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長迅速，爬壁力強的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉管移接，置25℃—28℃上培養(yǎng)，重復轉管幾次即可得到優(yōu)良純種銀耳菌絲的特點，菌絲生長緩慢，擔孢子也不易萌發(fā)。在進行兩菌混合時，先取經8～IO天培養(yǎng)的銀耳菌絲斜面，按無菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養(yǎng)1周即得到混合好的銀耳母種。2．組織別離培養(yǎng)法利用子實體內部組織，進行無性繁殖而獲得母種的簡便方法，即組織別離。該法操作簡便，菌絲生長發(fā)育快，品種特性易保存下來，特別是雜交育種后，優(yōu)良菌株用組織別離法能使遺傳特性穩(wěn)定下來。〔1〕子實體別離種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優(yōu)良品種。切去菇兩基部，在無菌箱內以0.1％的升汞水浸幾分鐘，再用無菌水沖洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進行外表消毒。接種時，只要將種菇撕開，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接到PDA培養(yǎng)基上。置25℃左右溫度下培養(yǎng)3-5天，就可以看到組織上產生白色絨毛狀菌絲，轉管擴大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法?！?〕菌核別離茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實體不易采集。而常見的是它貯藏營養(yǎng)的菌核。用菌核別離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核外表洗凈，用酒精或升汞消毒后，切開菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA培養(yǎng)基斜面上，保溫培養(yǎng)。應注意的是，菌核是貯藏器官，大局部是多糖類物質，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過小，那么不易分出菌種?！?〕菌素別離有一局部子實體不易找到，也沒有菌核，可以用菌素進行別離。如蜜環(huán)菌、假蜜環(huán)菌。其操作方法是先用酒精或升汞將菌素外表黑色皮層輕輕擦拭2～3次，然后去掉黑色外皮層〔菌鞘〕，抽出白色菌髓局部；用無菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養(yǎng)基上，保溫培養(yǎng)，即得該菌菌種。菌素別離要注意：因菌素比較細小，別離素也比較細小，別離時極易污染雜菌，所以要嚴格操作。3．基內菌絲別離培養(yǎng)法利用食用菌生育的基質作為別離材料，來得到純菌種的一種方法，叫基內菌絲別離法。

此種別離方法是適宜只有在特定的季節(jié)才出現，而且是朝生暮死，不易采得的子實體?；鶅葎e離法與組織別離法不同之點是，枯燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態(tài)。接種后有時并不立刻恢復生長。因此，有必要保存較長的時間〔約1個月〕，以斷定菌絲是否能成活?；鶅染z別離法又可分為，材中菌絲別離〔即菇木或耳木別離法〕及土中菌絲別離法等?！?〕材中菌絲別離法就是菇木或耳木別離法，為了減少雜菌的感染，菇〔耳〕木在別離之前，必須進行無菌處理?？梢园压健捕乘獗碛镁凭珶艋鹧孑p輕燒過，以燒死霉菌的孢子，或再用0.1％的升汞水浸孢幾分鐘，然后用無菌水沖洗后用無菌濾紙吸干。接種塊切取時應注意。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內切取。所以，菌絲生長緩慢的種類應淺取；菌種生長快的種類可以深取。同時。還應根據菇菌的種類、木材質地、菇〔耳〕木粗細、發(fā)育時間的長短來確定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進行切取。接種塊應盡量小些，以減少雜菌感染時機，提離菌種的純度。接種塊移到培養(yǎng)基上，就應該放到適合菌絲生長的22℃～26℃的溫室或溫箱中培養(yǎng)，使菌絲恢復生長?！?〕土中菌絲別離食用菌種類很多，許多土生的食用菌；孢子不易萌發(fā)。組織別離也不易成功，用土中菌絲別離獲得純種的方法，叫土中菌絲別離。土中菌絲別離時要注意，由于土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此別離時必須盡可能避開這些微生物的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反復用無菌水沖洗，在培養(yǎng)基中參加一些抑制細菌生長的藥物，如40微克／升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現感染細菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來，接種到木屑培養(yǎng)基中。因細菌沒有分解木質素的能力，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴展；只局限于接種處。待菌絲長出感染區(qū)后，就可以再進行擴大提純了。

〔3〕子實體基局部離從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實體基局部離出新菌絲的方法，叫子實體基局部離，例：袋栽銀耳從出耳早、出耳率離、無病蟲害的栽培室中；選擇生活力最強的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場所進行后期培養(yǎng)，以增強菌絲體的生活力。經培養(yǎng)7～10天后，待子實體直徑達4～5厘米時便可取回，作為別離的母體。再從中篩選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實體，放置于0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過夜，以便殺死瓶中的害蟲。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進無菌室。經滅菌后，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，并進行培養(yǎng)。待袋口露出白色菌絲時，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結體，迅速移入母種試管培養(yǎng)基的中央，輕輕地脫去接種針，塞上棉塞。為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。別離后應及時移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內水分較多，菌絲恢復要比耳木別離得快。經2-3天后，別離物的邊緣就可看到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木別離法擔同。經適溫培養(yǎng)10-15天后，當接種塊扭結團出現紅、黃色水珠時，即可擴大原種。

〔二〕原種和栽培種的接種培養(yǎng)母種獲得以后，為了滿足菌種生產的需要。應選出優(yōu)良、純度高的母種進一步擴大為原種。原種培養(yǎng)基一般采用棉籽殼、木屑、草類等培養(yǎng)基。瓶裝或袋裝的原種培養(yǎng)基滅菌后，可送入滅過菌的接種箱內，待瓶中的培養(yǎng)基冷至30℃以下，可按照無菌操作程序進行接種。菌種瓶〔袋〕放入培養(yǎng)室時，要經常進行檢查，一經發(fā)現雜菌污染，立即取出。培養(yǎng)成的原種，菌絲體必須健壯有力，緊貼瓶壁而不干縮，顏色純粹，具有一定清香味，生活力強，擴制成栽培種時吃料快。栽培種就是將原種進一步擴大培養(yǎng)成三級種，它和原種的接種及培養(yǎng)相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴頭、木耳、銀耳的栽培種多用鋸木、棉皮作培養(yǎng)基。蘑菇多用糞草做培養(yǎng)料。栽培種要求料塊不脫水干縮。菌絲體健壯有力、顏色純粹，有清香味，無老化現象，無雜菌污染，有的種許可有少量原基，接入栽培料后，發(fā)菌快，長勢好，生活力強。原種在接栽培種時，原種瓶口的一層菌絲體應挖去不用?！踩骋后w種的簡單培養(yǎng)目前，用液體深層發(fā)酵法生產菌種，具有生產量大、周期短、菌齡整齊、本錢低廉、接種方便等特點，是實現食用菌工廠化生產的目標?，F將液體種培育過程簡述于后，供參考。

簡言之就是將純粹優(yōu)良的菌種，接入液體培養(yǎng)基〔固體培養(yǎng)基不加凝固劑〕，使菌絲繁殖形成大量小菌球，然后將這種培養(yǎng)基拌入木屑或棉籽皮料內，制成菌塊、培養(yǎng)其形成子實體。還可用于制原種、栽培種。

培養(yǎng)液體菌種，可將培養(yǎng)液裝入三角瓶中，約占空瓶的五分之一重量。用搖瓶機〔也稱搖床〕來培養(yǎng)。搖瓶機有旋轉式和往復式兩種，一般多用往復式。液體培養(yǎng)基可用馬鈴薯汁〔加糖〕，麥芽汁配制，也可用玉米粉、豆餅粉、糖、無機鹽等配制。可以混合培養(yǎng)基，因適用于多種食用菌和藥用菌的培養(yǎng)，均有好效果。組分：豆餅粉2％，玉米粉1％，葡萄糖3％，酵母粉0.5％，磷酸二氫鉀0.1％，碳酸鈣0.2％，pH自然，12℃滅菌半小時。然后接種培養(yǎng)。

如果生產量較大，在三角瓶的根底上，再逐級擴大種子缸，發(fā)酵罐中進行液體深層通氣發(fā)酵，產生大量菌種。但由于生產中要求設備繁多，技術性強，我們還應創(chuàng)造條件；實現食用菌栽培的現代化。

〔四〕菌種質量的鑒定菌種質量鑒定最好的方法是，做出菇試驗。但是時間比較長。在購置菌種時，或在菌種生產中，如何能知菌絲生長情況，快速判斷菌種質量？我們介紹幾種方法1.肉眼觀察優(yōu)良菌種菌絲濃白，絨狀，粗壯密集，生長整齊，速度快，香味濃厚。2.優(yōu)良菌種標準可歸納為："純、香、正、壯、潤"五個字。檢查時，翻開瓶塞，從菌種瓶中部取出小塊菌絲體，觀察色澤，聞其氣味，手捏料塊檢