樣品保存和相關設備

樣品存貯及相關設備實驗室基本儀器技術課程實驗室樣本保存的種類生物大分子（蛋白、核酸）細菌、酵母血液、組織其他（試劑、組織液等）細胞（貼壁、懸?。┥锎蠓肿颖４娴闹饕蛩販囟龋铀俜磻┧郑铀俜磻兔棺儯┕饩€（光化作用）空氣（水分、氧氣、微生物）PH值（穩(wěn)定范圍）時間（保存期限）⑴空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動氧化?？諝庵形⑸锏奈廴究墒箻悠犯瘮∽冑|，樣品吸濕后會引起潮解變性，同時也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會自發(fā)引起游離基鏈式反應，還原性強的樣品易氧化變質和失活，如維生素C、巰基酶等。⑵溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應約加快數(shù)倍，酶促反應增加1～3倍。因此通常絕大多數(shù)樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學反應和微生物的生成。⑶水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。⑷光線：某些生物大分子可以吸收一定波長的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對生物大分子制品影響最大，樣品受光催化的反應有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。⑸樣品的pH：保存液態(tài)樣品時注意其穩(wěn)定的pH范圍，通?？蓮奈墨I和手冊中查得或做實驗求得，因此正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。⑹時間：生化和分子生物學樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。DNA保存

短期保存，加無菌水或TE緩沖液，4°或－20°。長期保存，剛提取好的DNA直接保存到乙醇里，放－20°或者-70°。需要用的時候，再離心后，棄去乙醇，加水或TE溶解即可。

DNA本來就是酸性，所以需要弱堿性環(huán)境保存，如果用中性或者酸性環(huán)境保存時間長容易降解。保存時間長會降解。所以還是要盡快的利用了。有文獻報道高純DNA的最佳保存條件是4度，提純的DNA放在4°一段時間（數(shù)周-數(shù)月）都沒問題。但是長期保存建議-20°或-70°，并且濃度不能太低。

RNA保存

保存RNA應該盡量低溫。

若要長期保存,需沉淀下來后置于無水乙醇凍在-70度,用的時候再離心下來除去無水乙醇,用DEPC水溶解。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。RNA即使是放在-80度下也會降解，所以最好的保存方法是將RNA逆轉成cDNA后保存。

提取的RNA保存在DEPC處理的水中，加入RNAse抑止劑，在-80度保存2個月，應該是可以保證不降解的。最好是反轉錄后保存。

蛋白質保存

選擇什么樣的貯存方法取決于該蛋白的穩(wěn)定性和你打算保存多長時間以及下一步你打算如何利用。注意事項：蛋白溶液應避免極端的pH（強酸or強堿），同時也不能接近其等電點的pH。另外，還應該避免其他物質的摻入。

如果保存時間在24h以內，大多數(shù)蛋白可以放置到4℃。

如果保存時間在24h以上，應該考慮避免蛋白溶液長菌，可以事先過濾一下或者加入抑菌的物質（如疊氮化鈉）。

蛋白質有什么比較實用的保存方法?1.凍成干粉，低溫保存。

2.甘油+防腐劑，低溫保存，甘油濃度5%~50%，防腐劑一般選擇NaN3（疊氮化鈉），但對于氧化酶類的蛋白，不能使用NaN3，會影響蛋白活性，推薦不加防腐劑，或者改加PMSF（苯甲基磺酰氟）。

如果抗體用于染色或處理活細胞，用于體內研究：疊氮化鈉在抵抗微生物的同時，對其它大部分有機物也是有毒的，因為它阻斷了線粒體的細胞色素電子轉運。

大多數(shù)的蛋白、RNA酶抑制劑都是致癌或潛在致癌的，因為它有可能阻礙體內蛋白、RNA的正常更替。

PMSF通過與蛋白質的serine殘基結合而達到抑制serine蛋白酶的作用。

檢測用的粗蛋白，全蛋白當然可以分裝低溫保存，制備級最好是凍干，-80度存放，但經(jīng)常使用的（比如抗血清、純化的酶）最好采取公司商品化酶類的保存方法，就是50%甘油+低溫，即保證了低溫，甘油又保證了整個體系不會結晶，避免了反復凍融，而且甘油有穩(wěn)定蛋白活性的作用。關于疊氮化鈉的使用

為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中（終濃度0.02%(w/v)）。

在下述情況中不能使用疊氮化鈉：（1）如果抗體用于染色或處理活細胞，用于體內研究：疊氮化鈉在抵抗微生物的同時，對其它大部分有機物也是有毒的，因為它阻斷了線粒體的細胞色素電子轉運。（2）要偶聯(lián)帶有氨基基團的抗體：疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團的偶聯(lián)，因此在進行偶聯(lián)之前，應將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01%。

蛋白保存的注意事項

在4度下頂多保存一個禮拜。在-20度最長保存一個月。如果打算保存數(shù)月之久，要加入一定量甘油，避免“凍傷”。最好的保存辦法還是將蛋白樣品凍干成粉末，放置-80度冰箱。凍干在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對凍干重溶時必然產生的鹽離子濃度的急劇變化反應不佳，其活性會永久喪失。蛋白樣品最忌諱反復凍融。為避免多次凍溶致使蛋白活性降低或變性，應該將蛋白溶液分裝保存，一次用多少就取多少。除此之外，還可以加入一些甘油(5-50%(w/v))或者血清(10mg/ml)幫助目的蛋白保持穩(wěn)定。盡量將蛋白保存在冰箱里層，而不是門上。

抗體的保存

絕大多數(shù)已稀釋的抗體應存在4℃-8℃條件下，以免凍融對抗體蛋白產生有害效應?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存于-20℃條件下，并避免反復凍融。反復凍融會導致抗體變性，導致多聚體形成冷凍的抗體溶液應置于室溫中緩慢地解凍，應絕對避免用高溫快速解凍。

被細菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結果，應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。

除非特別要求-20℃凍存，一般4℃可穩(wěn)定一年（無菌，如加疊氮鈉），因為抗體是一種具有非常穩(wěn)定結構的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根據(jù)需要分裝保存4℃(一周）、-20℃(一個月)、-80℃(六個月)、液氮（基本無限期）特殊抗體的保存條件：1.酶聯(lián)抗體：永遠保存在4度，避免凍起來。否則會導致酶活性的下降或者喪失。2.偶聯(lián)抗體：所有偶聯(lián)抗體都是在棕色管中或使用錫箔紙避光保存。尤其是熒光抗體，對光極為敏感，因此在所有的實驗階段也是要避光操作的！3.IgG3的同型對照：永遠保存在4度，避免凍起來。因為如果出現(xiàn)凍融過程，該抗體非常容易形成多聚體。無論是保存還是運輸，絕對避免反復凍融！反復凍融會導致抗體變性，導致多聚體形成，從而降低抗體的結合能力！

菌種保藏的原理和方法一、菌種保藏的目的

保存、不退化二、菌種保藏的原理

DNA復制時自發(fā)突變是造成菌種退化的原因，因此要創(chuàng)造代謝不活潑的狀態(tài)。

休眠態(tài)（孢子、芽孢）代謝不活潑的狀態(tài)環(huán)境（干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)）真空冷凍干燥保藏法

目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低溫度下，（-18℃），快速地將細胞凍結，并且保持細胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。一般可保存5~10年左右。液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮，或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。是適用范圍最廣的微生物保藏法，其保存期最長。因為液氮的溫度可達-196℃，遠遠低于菌種新陳代謝作用停止的溫度（-130℃），故此時代謝活動已停止。保藏期一般為2~3年，長的可達9年之久。-80℃低溫冷凍保藏

將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。

在最適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進行純度檢查后，與保護劑混合均勻，分裝（分裝時應注意在無菌條件下操作)。將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。

復蘇方法

從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當快速搖動。直到內部結冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內容物移至適宜的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

細胞的凍存

按照冷凍保護液在凍結后是否形成冰晶來劃分為兩種。若降溫速率過快，則形成胞內冰，這些胞內冰在復溫過程中會發(fā)生再結晶使細胞受損;若降溫速率過慢，則細胞收縮過劇，并且細胞處在高濃度溶液中也會引起損傷。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70～-80度，然后直接投入液氮進行保存；或者是利用電子降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100度以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結的細胞懸液或多或少都有冰晶的形成。

細胞在液氮中可長期凍存，而不會影響細胞活力；在-70度可保存數(shù)月。在將細胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復蘇時，需要從-196度的液氮中取出凍存管，立即投入37～40度溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。冷存管置于4℃10～30分鐘--->-20℃1～2小時--->-80℃4～12小時(或隔夜)--->液氮罐長期儲存。

玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護液（丁二醇、丙二醇、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、甘油等CPA及適量聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇等高聚合物）保護懸浮細胞，直接投入液氮進行凍存的方法。以該中方法凍結的細胞懸液沒有冰晶的形成。

實驗室樣本保存相關的設備真空冷凍干燥機4.液氮罐3.超低溫冰箱、深冷冰箱2.普通冰箱、低溫冰箱1.生物樣本冷凍儲存溫度建議

各種生物樣品的建議保存溫度

冷凍技術?冷凍原理：冷凍過程對細胞和組織影響的主要來源于冰晶損傷和溶液滲透壓損傷。若降溫速率過快，則形成胞內冰，這些胞內冰在復溫過程中會發(fā)生再結晶使細胞受損;若降溫速率過慢，則細胞收縮過劇，并且細胞處在高濃度溶液中也會引起損傷。

內旋凍存管與外旋凍存管的使用區(qū)別?外旋凍存管是為超低溫冰箱設計，不適用于液氮儲存系統(tǒng)。液氮凍存容器推薦使用內旋凍存管。?內旋蓋污染問題，通過單手操作解決使用梯度降溫盒或程序降溫儀減少對細胞的傷害?蛋白凍存使用急凍。細胞凍存需要緩慢降溫，需要使用梯度降溫盒或者更嚴格的程序降溫儀。40C

-200C

-860C液氮會增加凍存過程中對細胞的傷害?微量離心管的管壁厚度和插拔式管蓋均不適用于液氮系統(tǒng)，會出現(xiàn)大量炸管現(xiàn)象，造成樣品的損失凍存操作的注意事項

?與液氮接觸的樣品需在操作時注意：?急凍或長期液氮儲存的樣品會接觸到液氮?不建議用微量離心管?對管口進行密封，避免液氮滲透?液氮滲入的風險：炸管、樣品間交叉污染?轉移過程中注意使用冰盒?生物安全柜中操作凍存管：?單手操作，避免污染，解決靜電、管子滑落等問題?用力適中，避免扭力過度造成脫絲，影響密封效果?注意做好標記：?管蓋和管壁均做標記?推薦使用冷凍標簽紙和低溫記號筆

??注意做好個人防護，避免炸傷?護目鏡、面罩、手套、防護服?盡量使用鑷子?水浴鍋/燒杯上覆蓋毛巾樣品復蘇時的注意事項

?樣品復蘇時：?對于未經(jīng)保護的凍存管，切忌快速扔進水浴中?凍存管從液氮液相取出后必須在液氮氣相中儲存24h，這樣可以使得液氮從凍存管中慢慢的蒸發(fā)和逃逸，從而降低凍存管中的壓力。?凍存管從液氮液相取出后快速放置于-20度冰箱30min，再進行水浴復蘇。?凍存管從液氮取出后，用手輕輕擰松管蓋，使液氮蒸發(fā)后再進行水浴復蘇。?對于不需水浴復蘇的樣品，建議取出后放置于0~-20度冰盒上，盡量避免發(fā)生擠壓、碰撞、跌落。?提高冰箱空間使用率：?在冰箱中制作必要的支架?使用凍存盒，替代各種手套、袋子、板架?采用節(jié)省空間的凍存管?對于長期儲存的重要樣品：?實驗室重要的菌種、組織、蛋白等樣品做好標記冰箱存放樣品的建議

超低溫冰箱的注意事項

必須靜置冷柜至少24小時以上才能通電?？障洳环湃胛锲?，通電開機，分階段使冷柜先降溫至﹣40度，正常開停后再降到﹣60度，正常開停8小時后再調到﹣80度，觀察冷柜有正常開停24小時以上。證明冷柜性能正常?？梢韵蚶涔駜却娣盼锲?。原則上應存放﹣60度的物品，不超過1/3箱體容量。如果存放的物品溫度高于﹣60度，應將冷柜溫度設置在高于存放物品的溫度3度左右(即，如果物品溫度為20度，則將低溫柜溫度設定在23度)，保證冷柜停機，并有正常開停8個小時以上。禁止：所有低溫保存箱均為保存設備，嚴禁一次性放入過多相對太熱的物品，會造成壓縮機長時間不停機，溫度不下降且很容易燒毀壓縮機。物品一定要分批放入，分階梯溫度降溫，直至所需要的低溫！存取樣品時門開得不要過大，存取時間盡量要短。

液氮罐的安全使用

液氮貯存：液氮貯存種類一般可分為貯存罐、運輸罐兩種。貯存罐主要用于室內液氮的靜置貯存，不宜在工作狀態(tài)下作遠距離運輸使用；為了滿足運輸條件，運輸罐主要有專項防震設計，除靜置貯存外，還可在充裝液氮狀態(tài)下，作運輸使用，但應避免劇烈的碰撞和震動；另外，在短時間、短距離內使用少量液氮時，也可以臨時使用保溫瓶（杯）等器具存放。