環(huán)境樣品前處理第6章 衍生化課件

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化技術環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1衍生化目的與條件過程：化學反應→定量轉化→適于分析。定義：借助化學反應將待測組份接上某種特定基團，從而改善其檢測靈敏度和分離效果的方法。作用：把難于分析的物質轉化為易于分析的物質，通過對反應產物的檢測間接分析目標化合物。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1衍生化目的與條件柱前衍生化：衍生化反應→定量生成→色譜分析。柱后衍生化：色譜柱分離→衍生化反應→檢測。分類：柱前衍生化和柱后衍生化。流程：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化機理柱前衍生化柱后衍生化分離-衍生產物檢測-衍生產物檢測-衍生產物分離-待測物本體衍生化環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.1衍生化的目的提高目標物可檢測性：

LC:提高檢測靈敏度與選擇性

GC:改善色譜分離，通過增強目標物揮發(fā)性或者改善目標物極性

提高理化穩(wěn)定性為結構鑒定提供依據(jù)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.2衍生化的條件柱前衍生化反應需滿足的條件：①反應迅速、定量、重復、條件不苛刻、易操作；②選擇性高、具有專一性；③反應產物只有一種，無干擾；④衍生化試劑易得、通用性好。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.1.2衍生化的條件2.柱后衍生化反應需滿足的條件：①反應迅速、定量、重復；②反應條件與色譜條件適應；③反應產物可檢測；

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.1氣相色譜柱前衍生化（1）硅烷化衍生化方法（2）酯化衍生化方法（3）鹵化衍生化方法（4）?；苌椒ǚ椒?.2衍生化方法環(huán)境樣品前處理第6章衍生化1.硅烷化衍生化方法本節(jié)首頁退出本章質子性化合物如醇、酚、酸、胺等與硅烷化試劑反應，形成揮發(fā)性的硅烷衍生物R3Si—X+H—R`R3Si—R`+H—XP135表6-1環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.酯化衍生化方法大多數(shù)有機酸揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差。在GC分析之前衍生為相應的酯。①甲醇法②重氮甲烷法③三氟乙酸酐法酯化反應環(huán)境樣品前處理第6章衍生化①甲醇法本節(jié)首頁退出本章甲醇法：有機酸與甲醇在催化劑的存在下加熱，可以發(fā)生酯化反應，生成有機酸甲酯RCOOH+CH3OH催化劑RCOOCH3+H2O△

硫酸、鹽酸-加熱

三氟化硼B(yǎng)F3-室溫催化劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化②重氮甲烷法本節(jié)首頁退出本章非水介質中CH2N2與有機酸反應，生成有機酸甲酯RCOOH+CH2N2RCOOCH3+N2重氮甲烷不穩(wěn)定，有爆炸性，有毒！！環(huán)境樣品前處理第6章衍生化③三氟乙酸酐法本節(jié)首頁退出本章醇或酚與有機酸反應，生成酯：RCOOH+R'OHRCOOR'+H2O適合空間位阻較大的化合物。三氟乙酸酐環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.?；苌椒ū竟?jié)首頁退出本章

在-OH、-SH、-NH等含有活潑氫的化合物上引入酰基→轉化為弱極性的酯、硫酯或酰胺→改善揮發(fā)性和穩(wěn)定性，含有鹵離子的羰基基團可增強ECD響應。優(yōu)點：保護不穩(wěn)定基團；提高糖類，氨基酸等物質的揮發(fā)性和熱穩(wěn)性；有助于混合物分離；使用ECD檢測，分析物檢測下限可降低很多。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.酰化衍生化方法本節(jié)首頁退出本章（1）乙?；ǎ禾岣邠]發(fā)性試劑：乙酸酐（AA）樣品：糖類介質：多為非水催化劑：吡啶等堿性化合物環(huán)境樣品前處理第6章衍生化3.?；苌椒ū竟?jié)首頁退出本章（2）多氟酰化法：引入鹵素！試劑：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐（PFP）、七氟丁酸酐（HFB）、N-甲基雙（三氟乙酸酐）咪唑（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI）

樣品：藥物等大分子介質：非水環(huán)境樣品前處理第6章衍生化4.鹵化衍生化方法本節(jié)首頁退出本章引入鹵素→ECD檢測器→改善揮發(fā)性和穩(wěn)定性。（1）鹵素法：加成或取代

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化4.鹵化衍生化方法本節(jié)首頁退出本章（2）鹵化氫法：加成或置換

（3）NBS法：烯丙位取代

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環(huán)境樣品前處理第6章衍生化HPLC化學衍生化分類

在線化學衍生化

★是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機

離線化學衍生化

柱前衍生化

★發(fā)生衍生化發(fā)應的先后

柱后衍生化環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁退出本章6.2.2液相色譜柱前衍生化1.紫外衍生化反應2．熒光衍生化反應

3．電化學衍生化反應環(huán)境樣品前處理第6章衍生化優(yōu)點：（1）對用作流動相的溶劑體系沒有限制；（2）反應條件，反應速率不受限制；（3）通過選擇合適的試劑以及萃取方法，可以消除許多干擾；（4）過量溶劑、試劑容易除去；（5）轉變成合適的衍生物，可使分離度改進。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化缺點:（1）操作過程繁瑣，容易影響定量準確性。（2）當一個復雜組分樣品經過衍生化反應后，有可能產生多種衍生化產物給色譜分離帶來困難。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁退出本章（1）紫外衍生化反應液相色譜法中，紫外吸收檢測器是最常見的一種高靈敏度檢測器很多化合物在紫外可見光譜區(qū)無吸收與帶有紫外吸收基團的衍生試劑在一定條件下發(fā)生反應，反應產物帶有發(fā)色基團而能被紫外吸收檢測器檢測。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁退出本章（1）紫外衍生化反應苯甲酰氯

+胺、醇、酚→苯甲酸酯類衍生物（２００～３６０ｎｍ）（1）苯甲酰化反應環(huán)境樣品前處理第6章衍生化本節(jié)首頁退出本章（1）紫外衍生化反應（2）苯甲磺?；磻?/p>

（3）DNFB與醇、胺、氨基酸反應（4）PITC與氨基酸反應（5）有機酸酯化反應

（6）羰基與DNPA或PNBA反應

P139-140:更多反應：P137-138表6-2環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（2）熒光衍生化反應定義：用含有芳香環(huán)或雜環(huán)的大基團取代被測化合物分子中的一個或幾個原子，以此將熒光物標記入分子，此時被測分子的結構基本不變特點：高選擇性、高靈敏度熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器的靈敏度高10到1000倍環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（2）熒光衍生化反應環(huán)境樣品前處理第6章衍生化例：福多司坦血藥濃度測定方法的建立

2、半胱氨酸結構式：1、福多司坦結構式:

結構特點

3、結構特點：為半胱氨酸衍生物；沒有強的紫外吸收，沒有熒光；分子量小，極性大。羧基伯氨基環(huán)境樣品前處理第6章衍生化衍生化產物的激發(fā)波長為338nm，發(fā)射波長為450nm反應過程：

參考氨基酸的測定方法，選擇合適的衍生化試劑衍生化后測定：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生試劑常用的熒光衍生化試劑（亦稱熒光探針）有：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生試劑的基本構成取代基熒光團（試劑分子母體）反應基團膽磺酰肼DNS-H環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生化試劑亦稱熒光探針P140表6-3常用的熒光衍生試劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化1.丹磺酰氯（1-二甲氨基萘-5-磺酰氯）

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.丹酰肼（1-二甲氨基萘-5-磺酰肼）

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化熒光衍生化試劑的分類：（一）胺的衍生試劑（二）醇、酚的衍生試劑（三）羰基化合物的衍生試劑（四）羧酸類化合物的衍生試劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化鄰苯二甲醛OPA4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑

NBD-Cl熒光素異硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯

6-氨喹啉基琥珀酰亞胺碳酸酯AQC（一）胺的衍生試劑：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（二）醇、酚的衍生試劑:羰基氯類：FMOC,CEOC磺酰氯類:DNs-Cl鹵代三嗪類:EDTN

1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

（三）羰基化合物的衍生試劑:肼類DNs-HCEOC-H

氨基類氨基甲基芘

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（四）羧酸類化合物的衍生試劑:

溴甲基類BrMMC

哌嗪基類DBD-Pz7-N-哌嗪-4-二甲氨基苯并呋喃(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)環(huán)境樣品前處理第6章衍生化（四）羧酸類化合物的衍生試劑:

重氮甲烷基類ADAM

其它類

9-(2-羥乙基)-吖啶酮HEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素(ADMC)9-蒽重氮甲烷環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

（3）電化學衍生化反應樣品與某些試劑反應，生成具有電化學活性的衍生物，以便在電化學檢測器上有較高的響應。環(huán)境介質對電化學反應有很大影響，如離子強度、pH值和溶劑組成等。

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常用的電化學衍生化試劑：（1）帶硝基的芳香化合物：P141表6-4

（2）芳氨基、酚羥基等

上述試劑與羥基、氨基、羧基、羰基化合物反應生成具有電化學活性的衍生物。環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.3柱后衍生過程將樣品先注入色譜柱，按選定的色譜條件使樣品組分得以分離；當各個組分從色譜柱流出后，分別與衍生化試劑相遇，在一定的反應條件下，生成具有某種檢測特性的衍生化產物進入檢測器測定。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化

要求：（1）對流動相的選擇更嚴格，必須考慮衍生化試劑、反應產物的溶解度，以及它們與流動相可能發(fā)生的副反應；（2）在高效液相色譜中采用高流速，因此

反應速率必須很快（小于30s）；（3）檢測器對衍生化試劑不能有響應。

環(huán)境樣品前處理第6章衍生化柱后衍生流程圖泵進樣閥色譜柱衍生化試劑泵衍生化反應器檢測器記錄儀環(huán)境樣品前處理第6章衍生化柱后反應器毛細管式空氣分割式填充柱式P143圖6-2環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.4固相化學衍生化法

（1）還原型固相反應劑

1.固相化學反應劑環(huán)境樣品前處理第6章衍生化6.2.4固相化學衍生化法

酶是一種具有特殊三度空間構象的蛋白質，能夠催化某一底物進行特異性化學反應，生成特定的反應產物。酶的催化反應具有高度的專一性酶試劑通常在反應中是不消失的，可重復使用酶的固定化可分為化學和物理兩種方法，化學法是指在酶和載體之間生成共價鍵，并保留其生物活性，而物理方法僅是吸附在固體表面。2.固定化酶環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.固定化酶對載體的要求：對酶應有較高的親和力和較大的容量、易再生。一般大孔徑、大表面積的載體容量大，而容量越大，固定化酶的活性越高，壽命越長。硅球、玻璃微球、氧化鋁、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和纖維素等都可以作為載體。如纖維素或葡聚糖凝膠與溴化氰反應，然后用酶處理：環(huán)境樣品前處理第6章衍生化2.固定化酶酶一旦被固