骨骼肌的原代培養(yǎng)法

骨骼肌的原代培養(yǎng)一.試劑1.包被用多聚賴(lài)氨酸poly-lysine的配制與包被1）準(zhǔn)備0.94%硼酸溶液稱(chēng)取0.94硼酸粉末溶于80ml水中，用NaOH將pH值調(diào)至8.4,再定容。2） 按每4.9mg多聚賴(lài)氨酸粉末溶解于98ml0.94%硼酸溶液配制100ml.3） 0.22卩M過(guò)濾分裝，-20°C儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。4） 包被：按10cm皿用4ml包被液進(jìn)行包被，4°C過(guò)夜或37°C2小時(shí)后，吸干，回收包被液，包被過(guò)的皿置4°C保存可達(dá)一個(gè)月，臨用前用PBS或滅菌的去離子水洗3遍再使用，整個(gè)包被過(guò)程均為無(wú)菌操作。多聚賴(lài)氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽(yáng)離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。多聚賴(lài)氨酸包被培養(yǎng)板使用前是用滅菌的去離子水稀釋?zhuān)詈貌灰秒p蒸水或別的，因?yàn)槎嗑圪?lài)氨酸包被的原理是通過(guò)改變器皿表面的電荷而促進(jìn)細(xì)胞的黏附。0.1%I型膠原酶（1mg/ml）100mgI型膠原酶溶于100mlD-hank's液中，過(guò)濾后4°C保存。D-hank's液 （可以直接購(gòu)買(mǎi)使用）KCl0.40g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g,NaHCO30.35g,NaH2PO4?7H2O0.09g，酚紅0.01g。以上均為分析純，加三蒸水定容至1L后高壓滅菌，4°C分裝備用；血清的滅活:常用的血清要先在56C水浴中滅活30min方可使用。滅活后-20C保存?zhèn)溆?；?xì)胞生長(zhǎng)液的配制（100mL）:即含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。取20ml滅活的血清,再加青、鏈霉素各100IU，然后用DMEM/F12培養(yǎng)基補(bǔ)充到100mL，4C保存?zhèn)溆谩?.1%膠原酶II（100mL）的制備:稱(chēng)取膠原酶II100mg用100mLDMEM/F12液充分溶解，0.22卩M過(guò)濾后分裝備用，-20C保存；75%乙醇Mini-Q（超純水）--滅菌無(wú)離子水實(shí)驗(yàn)器械3、直剪和眼科剪6、15ml3、直剪和眼科剪6、15ml離心管4、眼科鑷和止血鉗5、燒杯三、正常小鼠原代骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)流程取肌肉于平皿，Hank's洗3次剔除脂肪、結(jié)締組織肌肉標(biāo)本剪約0.1cm3小塊移至離心管，Hank's洗3次靜置lmin,棄去上層液及漂浮組織0.25%胰酶，37度水浴消化20min,每5min搖動(dòng)或吹打1次生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打，依次100，200,400目過(guò)篩亠J離心，1000rmp,10min,棄去上清重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞，接種密度以5x105個(gè)/ml懸液加入未經(jīng)PPL包被培養(yǎng)瓶中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，37度，1h轉(zhuǎn)移包被瓶中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)37°C,5%CO24d換液，以后每天換四、實(shí)驗(yàn)操作1、 新生小鼠拉頸椎處死，乙醇消毒腿部，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，取肌肉于平皿，Hank's洗3次，剔除脂肪、結(jié)締組織，將肌肉標(biāo)本剪約0.1cm3小塊；2、 將剪碎的肌肉移至離心管，Hank's洗3次，靜置1min,棄去上層液及漂浮組織；3、 向上述離心管中加入0.25%胰酶，37度水浴消化20min,每5min搖動(dòng)或吹打1次離心管，然后加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化；4、 反復(fù)吹打后，依次100,200,400目過(guò)篩，濾液收集后，1000r/min離心10min；5、 棄去清夜，用生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，懸液加入未經(jīng)PPL包被的培養(yǎng)瓶中，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，37度培養(yǎng)1h后，轉(zhuǎn)移包被瓶中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，4d換液，以后每天換液1次。五、細(xì)胞鑒定1、顯微鑒定：剛分離出的原代細(xì)胞比較小，呈球形，折光性強(qiáng)。12h后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，72h后貼壁完全，細(xì)胞逐漸延展成梭形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個(gè)方向排列。當(dāng)細(xì)胞融合80%以上后，開(kāi)始形成肌管。2、 免疫細(xì)胞化學(xué)染色1：肌衛(wèi)星細(xì)胞胞漿中含有結(jié)蛋白（desmin），可采用鼠抗人及小鼠desmin一抗對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行免疫染色鑒定。3、 免疫細(xì)胞化學(xué)染色2：采用骨骼肌特異性的肌球蛋白（myosin）單克隆抗體檢測(cè)。取含骨骼肌細(xì)胞蓋玻片常規(guī)處理后進(jìn)行myosin的細(xì)胞免疫化學(xué)染色，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判定：以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。六、注意事項(xiàng)1、 胰酶消化過(guò)程中，也可采用15min兩步消化的方法進(jìn)行。根據(jù)所取組織個(gè)體年齡決定，一般成年大小鼠采用兩步消化效果好，幼鼠一步消化和兩步消化差別不大。2、 傳代培養(yǎng)代數(shù)不要太多，骨骼肌細(xì)胞傳代能力有限，容易死亡。3、 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，形態(tài)會(huì)發(fā)生較大變化。4、 肌肉組織要盡可能剔除表面的膜和脂肪組織。四．豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離細(xì)胞培養(yǎng)瓶的包被吸取2.5ml的0.001%的L-多聚賴(lài)氨酸溶液加入25cm無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，使液體覆蓋培養(yǎng)瓶的生長(zhǎng)面，然后室溫靜置3h以上,使用時(shí)將培養(yǎng)瓶取出，傾去其中液體，并用滅菌三蒸水沖洗2次,整個(gè)包被過(guò)程均為無(wú)菌操作。豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離1） 先將仔豬洗凈后頸動(dòng)脈放血致死，用75%酒精浸泡消毒，在無(wú)菌條件下分離背最長(zhǎng)肌。2） 分離的肌組織塊經(jīng)D-Hanks液漂洗3次后，將其剪成lmm3左右大小的碎塊.3） 再用D-Hanks液沖洗3次，靜置5分鐘后，棄去上層液體及漂浮組織，加入適量含0.1%膠原酶II的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打混勻后置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱（美國(guó)SHELLAB沖進(jìn)行消化20-24小時(shí)。約20-24小時(shí)后用吸管強(qiáng)力吹打使組織分散，再用100目、200目細(xì)胞篩依次過(guò)濾懸液，將濾液移入離心管中，1000RPM離心5-10分鐘，去上清，細(xì)胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)后，以不低于2x105/ml的密度接種在25cm2經(jīng)L-多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)瓶（比利時(shí)Orange）中，然后置于37C、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，隔天換液，并觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞貼壁且培養(yǎng)數(shù)天后，用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37°C消化10分鐘，加入適量含血清的培養(yǎng)基終止消化，柔和吹打細(xì)胞，使其脫離細(xì)胞瓶壁，將細(xì)胞重懸后采用差速貼壁法（3min左右）去除非成肌細(xì)胞，待成纖維細(xì)胞大多已貼壁，而骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞仍處于懸浮狀態(tài)時(shí)，將細(xì)胞懸液移出并重新接種在25cm平的培養(yǎng)瓶中，即為純化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。培養(yǎng)1-2天后換液，在倒置顯微鏡下觀察衛(wèi)星細(xì)胞的增值、分化情況（參考王繼新等（2002）方法）。豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的原代培養(yǎng)1） 將分離純化的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞按lxlO5cell/mL的密度分別接種于10%和20%的胎牛血清培養(yǎng)基中。然后里于溫度微37°C，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察衛(wèi)星細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)和分化情況。2） 待衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。即用0.25%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37°C消化衛(wèi)星細(xì)胞5~10分鐘，然后加入適盆含血清的培養(yǎng)基終止消化，柔和吹打細(xì)胞，使其脫離細(xì)胞瓶壁，將重懸后的細(xì)胞按適當(dāng)比例接種新細(xì)胞瓶，最后加入一定量的生長(zhǎng)液，置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)一天后換液，并觀察衛(wèi)星細(xì)胞傳代培養(yǎng)的貼壁、增殖能力。五討論：5.1骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種位于肌纖維肌膜與基底膜之間的肌源性細(xì)胞。根據(jù)其特性己發(fā)展了很多分離方法，如機(jī)械分離、酶消化分離等，一般兩者并用。胰酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織（如胚胎、肝、腎等），對(duì)纖維性組織及較硬的癌組織效果差，且較高濃度的胰酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有一定的影響;而膠原酶則對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用，它適合消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，且膠原酶作用緩和，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有大的影響。故本試驗(yàn)采用膠原酶消化法，37C消化20-24h后，鏡下即可見(jiàn)大量的衛(wèi)星細(xì)胞被釋放出來(lái)，獲得了比較滿(mǎn)意的分離效果。5.2骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的純化骨骼肌組織中含有大量的雜質(zhì)細(xì)胞，因而分離的衛(wèi)星細(xì)胞里?；祀s有許多非肌源性細(xì)胞，其中絕大多數(shù)為紅細(xì)胞和成纖維細(xì)胞（圖4-1）。紅細(xì)胞不貼壁，可隨換液而去除。但成纖維細(xì)胞與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在形態(tài)上相似，不易區(qū)分。最早Yablonka-Reuveni（1987年）采用Percon進(jìn)行不連續(xù)等密度梯度離心來(lái)分離非肌源性細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞，這種方法所收集的衛(wèi)星細(xì)胞純度高，但細(xì)胞得率低，若需衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量大時(shí)，則需花費(fèi)大量的人力和物力。Webster等使用流式細(xì)胞儀篩選人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，所得衛(wèi)星細(xì)胞的純度能達(dá)到99%以上，但需要針對(duì)某種類(lèi)動(dòng)物衛(wèi)星細(xì)胞的單克隆抗體。本試驗(yàn)采用差速貼壁法，在接種30min-lh后，待成纖維細(xì)胞大多已貼壁，此時(shí)將細(xì)胞懸浮移出進(jìn)行第2次接種，即可獲得大量均一的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。4.3骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的原代培養(yǎng)經(jīng)差速貼壁法（30min）純化后的衛(wèi)星細(xì)胞呈01球形，折光性強(qiáng).經(jīng)臺(tái)盼蘭染色顯示其成活率在90%以上口培養(yǎng)12h后有部分衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)始貼壁（圖4-2）t2天后絕大多數(shù)衛(wèi)星細(xì)胞就已貼壁并生長(zhǎng)成梭形或紡錘形的單如細(xì)胞.隨著培