調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)

SummaryPost-translationalmodificationofthecellularprionprotein(PrPC)isintimatelyassociatedwiththepathogenesisofpriondisease,yetthenormalfunctionoftheproteinremainsunclear.PrPCisexpressedinlymphoidcellsandisknowntobeaT-cellactivationantigen.Further,transcriptionprofilingstudiesofregulatoryTcellshaveshownpreferentialoverexpressionofPrPC,suggestingapossibleroleinregulatoryfunction.WereportthatboththeexpressionofPrPmessageandcellsurfacePrPClevelsareincreasedinmurineCD4+CD25+regulatoryTcellscomparedwithCD4+CD25)cells.However,PrP0/0micedonotshowalteredregulatoryT-cellnumbersorforkheadboxP3(Foxp3)expressionlevels,orimpairedregulatoryT-cellfunctioninvitro.Nevertheless,thepreferentialexpressionofsurfacePrPCbyregulatoryTcellsraisesthepossibilitythattherapeuticligationofPrPCmightalterimmuneregulation.摘要細(xì)胞朊病毒蛋白的翻譯后修飾與朊病毒蛋白疾病發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，然而這種蛋白的正常功能還尚不明確。細(xì)胞朊病毒蛋白在淋巴細(xì)胞中表達(dá)并被認(rèn)為是T細(xì)胞活化抗原。此外，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程研究，已經(jīng)顯示細(xì)胞朊蛋白優(yōu)先超表達(dá)，意味著它可能在調(diào)節(jié)功能上有重要作用。在小鼠體內(nèi)，與CD4+CD25-細(xì)胞相比，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞無論是朊病毒蛋白信息表達(dá)還是細(xì)胞表面細(xì)胞朊病毒蛋白水平上都有所增加。然而，PrP0

/0小鼠沒有表現(xiàn)出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量或者Foxp3表達(dá)水平的變化，在體外也沒有發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能受損。然而，通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞引起的朊病毒蛋白質(zhì)優(yōu)先表達(dá)使朊病毒蛋白的連接治療導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)的可能性增加。介紹

細(xì)胞內(nèi)朊病毒蛋白質(zhì)。ThecellularisoformofprionproteinCD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞

CD4+CD25+Foxp3+regulatoryTcellsQRT-PCR(實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

)Quantitativereal-timepolymerasechainreaction流式細(xì)胞儀(flowcytometry)朊病毒蛋白質(zhì)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中功能最重要的一類。它是一類具有特殊免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群。它能夠抑制自身免疫病的發(fā)生，參與腫瘤免疫的調(diào)節(jié),在感染和移植免疫中也發(fā)揮著重要作用。QRT-PCR(實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))所謂的實(shí)時(shí)熒光定量PCR

就是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時(shí)檢測從而實(shí)現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。

qRT-PCR是由三個步驟組成:

1.反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;

2.擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;

3.檢測:實(shí)時(shí)檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.流式細(xì)胞計(jì)是對細(xì)胞進(jìn)行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來。近年來，已經(jīng)對關(guān)鍵分子特性和基于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的細(xì)胞相互作用產(chǎn)生興趣。基因表達(dá)微衛(wèi)星分析已經(jīng)某些方面研究發(fā)現(xiàn)朊病毒蛋白在自然出現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中被正調(diào)節(jié)。然而，朊病毒蛋白在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的表達(dá)還沒有被直接證實(shí)。因此，我們分析了阮病毒蛋白在含CD4+CD25+轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的表達(dá)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還檢測了朊病毒蛋白缺乏小鼠中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生、數(shù)量和功能。

InrecentyearstherehasbeenconsiderableinterestincharacterizingthekeymoleculesandcellularinteractionsunderlyingregulatoryT-cell(Treg)function.Geneexpressionmicroarrayanalysishasinsome,althoughnotall,studiessuggestedthatPrPmaybeup-regulatedinnaturallyoccurringTregs.However,PrPexpressioninTregshasnotbeendirectlycharacterized.WethereforeanalysedPrPexpressioninCD4+CD25+forkheadboxP3+(Foxp3+)Tregs.InparallelwealsoexaminedTregdevelopment,numbersandfunctioninPrP-deficientmice.材料和方法材料1、小鼠2、RNA和cDNA的制備3、QRT_PCR4、抗體和流式細(xì)胞儀方法淋巴細(xì)胞分成CD25+

和CD25-CD4+部分鼠類調(diào)節(jié)T細(xì)胞PrP+/+和PrP0/0FVB/N的功能研究統(tǒng)計(jì)分析

小鼠

成年野生型FVB/N和C57/BL6小鼠。Prnp0/0小鼠最初是由C57BL/6·Sv129雜交得到的。在這里所用的小鼠是由最初的ZurichI小鼠獲得，但中間有FVB/N背景的有10個后代。ThelineusedherewasderivedfromtheoriginalZurichImousebutcrossedontotheFVB/Nbackgroundfor10generations.RNA和cDNA的制備

RNA制備過程cDNA用SuperSciptIIIRNaseHRT(Invitrogen)根據(jù)生產(chǎn)商的說明制備的，并保存于-20度，待用。制作單細(xì)胞懸浮液取出脾臟胸腺和淋巴結(jié)通過酸酚染色法制作RNARNA稀釋到60–200ng/ml處死小鼠實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QRT_PCR）程序如下：50度2分鐘，95度10分鐘，然后是95度15秒和60度1分鐘循環(huán)50次。（Reactionswereperformedina20-llvolumeonaMx3000Preal-timePCRthermocycler(Stratagene,LaJolla,CA),programmedat50for2min,followedby10minat95andthen50cyclesof15secondsat95and1minat60.）對每個樣本的朊病毒蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄物首先使用方程式：DCTePrnpT=CT（PrnpT）--CT（18ST）進(jìn)行18S值標(biāo)準(zhǔn)化。然后一個樣本（S0）作為一個基本值。而在其它樣本（Sx）中朊病毒蛋白轉(zhuǎn)錄物用方程：Prnp（SX）=2-△CT(SX)-△CT(S0)

來計(jì)算相關(guān)值。（Foreachsample,Prnptranscriptionwasfirstnormalizedtoits18Svalueusingtheequation:DCTePrnpT=CT（PrnpT）--CT（18ST）。Onesample(S0)wasthenusedasa‘baseline’value.Prnptranscriptioninallotherexperimentalsamples(SX)wasthencalculatedrelativetothisvalueusingtheequation:Prnp（SX）=2-△CT(SX)-△CT(S0)

）抗體和流式細(xì)胞儀

抗體抗朊病毒蛋白小鼠免疫球蛋白G1（IgG1）單克隆抗體（mAb）ICSM18(D-GenLtd,London,UK)是用FluoroTag-FITC試劑盒標(biāo)記的共軛異硫氰酸熒光素(FITC)。共軛異硫氰酸熒光素小鼠免疫球蛋白G1(eBioscience,SanDiego,CA)用來作為ICSM18-FITC標(biāo)記的單克隆抗體的一個調(diào)控。其他的共軛熒光染料抗體（和同種型對照）是從eBioscience購買的，如下：共軛FITC：抗-小鼠CD4；共軛藻紅蛋白（PE）：抗-小鼠CD4,抗-小鼠CD25和抗-小鼠Foxp3;共軛藻紅蛋白Cy5：抗-小鼠CD4和抗-小鼠CD8；以及共軛異藻藍(lán)蛋白(APC)：抗-小鼠CD25和抗-小鼠Foxp3。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞表面抗原抗體被添加在飽和濃度細(xì)胞懸浮液中，在RPMI（1640）培養(yǎng)基中加入1%的胎牛血清。洗滌之后，抗-Foxp3單克隆抗體或同種型對照被添加到每個容器，繼續(xù)在4度條件下培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。細(xì)胞立即通過流式細(xì)胞儀用單或雙激光FacsCalibur儀器（BD,Oxford,UK)）進(jìn)行洗滌和分析，數(shù)據(jù)用CELLQUEST軟件進(jìn)行分析（BD）。通過朊病毒蛋白質(zhì)表達(dá)分析，可以獲得朊病毒蛋白質(zhì)幾何平均值和同種型對照（測量自身熒光和非專一性結(jié)合）。朊病毒蛋白表達(dá)定義為兩者的差值（D幾何平均值）。淋巴細(xì)胞分成CD25+

和CD25-CD4+部分分類是由醫(yī)學(xué)研究理事會（MRC）臨床科學(xué)中心的流式細(xì)胞儀完成的。簡單地說，在用抗-CD4藻紅蛋白Cy5和抗CD25-藻紅蛋白單克隆抗體復(fù)染后，細(xì)胞在熒光激活的細(xì)胞分選緩沖液（[Ca2+/Mg2+，磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），1mMEDTA，25MmHEPES和1%v/vFCS）中重新被懸浮起來，細(xì)胞濃度為每微升溶液1×107個細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀，淋巴細(xì)胞通過正向和側(cè)向特征被檢測到，同時(shí)通過FL3通道熒光鑒定CD4+細(xì)胞。在CD25+和CD25-部分得到門電路，在FL2通道分別用強(qiáng)或弱的熒光進(jìn)行區(qū)分。）同時(shí)將這些進(jìn)行收集到獨(dú)立管中，為以后的RNA抽提備用。

GatesweredrawnaroundCD25+andCD25-fractions,distinguishedbyhighorlowfluorescenceintheFL2channel,respectively.ThesewerethencollectedsimultaneouslyintoseparatetubesforsubsequentRNAextraction.鼠類調(diào)節(jié)T細(xì)胞PrP+/+和PrP0/0FVB/N的功能研究單細(xì)胞脾細(xì)胞懸濁液是由上述的培養(yǎng)了6-12周的PrP+/+和PrP0/0FVB/N小鼠中得獲得的。用Dynabeads方法對CD4+細(xì)胞進(jìn)行陰性分離。使用生物素酰化的抗-CD25培養(yǎng)繁殖，然后加入抗生蛋白鏈菌素微珠將它們進(jìn)一步分成CD25+和CD25-群體。CD4+CD25+T細(xì)胞再通過微型磁性分選儀從CD4+CD25-中進(jìn)行一次確認(rèn)篩選。由流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞純度，CD4+CD25-細(xì)胞大于84%和的CD4+CD25+細(xì)胞大于92%。PrP+/+細(xì)胞的純度與PrP0/0細(xì)胞的純度相比沒有明顯的差異。在96孔圓形平底培養(yǎng)皿上培養(yǎng)純化的CD4+CD25+T細(xì)胞（每試管1×105個細(xì)胞），無論是單獨(dú)的還是按CD25-T細(xì)胞一定比例（CD25+與CD25-之比在1：16到1：1之間）的T細(xì)胞都涂抹一層抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體。培養(yǎng)皿在37度、5%的CO2條件下培養(yǎng)。三天后，在培養(yǎng)的最后16小時(shí)通過氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶苷結(jié)合來測定增殖量。統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析是用GRAPHPADINSTAT軟件進(jìn)行分析的。數(shù)據(jù)集統(tǒng)計(jì)學(xué)有效度的分析是用t檢驗(yàn)方法。誤差點(diǎn)代表了標(biāo)準(zhǔn)離均差。StatisticalanalysiswasperformedusingGRAPHPADINSTAT(GraphPadSoftware,SanDiego,CA).Datasetswereanalysedforstatisticalsignificanceusingthet-test.Errorbarsrepresentstandarddeviationsfromthemean.結(jié)果CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面朊病毒蛋白要比傳統(tǒng)T細(xì)胞表達(dá)的水平高。CD4+CD25+Foxp3+TregsexpresshigherlevelsofsurfacePrPCthanconventionalTcells調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中朊病毒蛋白為轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)PrPistranscriptionallyup-regulatedinTregsPrP0/0小鼠具有正常數(shù)目的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3表達(dá)水平。PrP0/0micehavenormalnumbersofTregsandFoxp3expressionlevelsPrP0/0調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有完整的抑制