GBT 17494-2023 馬傳染性貧血診斷技術(shù)

馬傳染性貧血診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforequineinfectiousanemia2023-09-07發(fā)布國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I前言 l2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15實(shí)驗(yàn)室生物安全措施 26臨床診斷 27樣品采集、保存與運(yùn)輸 38實(shí)時熒光PCR 49病毒分離與鑒定 510瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 6 8 13免疫印跡試驗(yàn) 14綜合判定 附錄A(規(guī)范性)試劑的配制 附錄B(資料性)實(shí)時熒光PCR引物和探針 附錄C(資料性)實(shí)時熒光PCR陽性對照質(zhì)粒的制備 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件代替GB/T17494—2009《馬傳染性貧血病間接ELISA診斷技術(shù)》,與GB/T17494—2009相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術(shù)變化如下：——增加了馬傳染性貧血臨床診斷(見第6章);——增加了馬傳染性貧血病毒實(shí)時熒光PCR檢測(見第8章);——增加了馬傳染性貧血病毒分離與鑒定(見第9章);——增加了馬傳染性貧血瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(見第10章);更改了馬傳染性貧血間接ELISA(見第11章，2009年版的第4章、第5章);——增加了馬傳染性貧血競爭ELISA(見第12章);——增加了馬傳染性貧血免疫印跡試驗(yàn)(見第13章);請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、新疆維吾爾自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心、中華人民共和國廣州海關(guān)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、中華人民共和國北京海關(guān)。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2009年首次發(fā)布為GB/T17494—2009;——本次為第一次修訂。馬傳染性貧血(EquineInfectiousAnaemia,EIA)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病毒屬成員馬傳染性貧血病毒(EquineInfectiousAnaemiaVirus,EIAV)引起的馬、驢、騾等馬屬動物傳染病。該病被世界動物衛(wèi)生組織(WorldOrganizationforAnimalHealth,疫病病種名錄》(2022)規(guī)定的二類動物疫病。EIAV只感染馬屬動物，其中馬最易感。感染動物是主要的傳染源。EIAV感染宿主后，病毒將自身基因組整合到宿主細(xì)胞基因組，造成宿主持續(xù)感染和終身帶毒。臨床上發(fā)病動物可表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)熱、為隱性病毒攜帶者。本病目前沒有適用的疫苗。本病的確診需要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。EIAV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，EIAV進(jìn)入宿主細(xì)胞后復(fù)制早期在病毒反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成雙鏈病毒DNA(通常稱為前病毒DNA),前病毒DNA在病毒編碼的整合酶的作用下進(jìn)一步整合到宿主染色體上。EIAV前病毒DNA在感染宿主體內(nèi)相對穩(wěn)定，常常作為病毒核酸檢測的靶標(biāo)。世界上不同地區(qū)EIAV基因組序列存在較大差異，本文件采用的核酸檢測方法為適用于目前不同毒株的通用型實(shí)時熒光PCR方法。IN1馬傳染性貧血診斷技術(shù)1范圍本文件描述了EIA的臨床診斷、實(shí)時熒光PCR、病毒分離與鑒定、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接ELISA、競爭ELISA、免疫印跡試驗(yàn)的方法。本文件適用于EIA的診斷、檢疫、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BCA:二辛可寧酸(BicinchoninicAcid)DAB:3,3-二氨基聯(lián)苯胺(3,3-N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride)DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)EIA:馬傳染性貧血(EquineInfectiousAnaemia)EIAV:馬傳染性貧血病毒(EquineInfectiousAnaemiaVirus)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)HRP:辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase)OD值：光密度值(OpticalDensity)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)PBMC:外周血單核細(xì)胞(PeripheralBloodMononuclearCell)SDS:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SodiumDodecylSulphate-PolyacrylamideGelElectrophoresis)25實(shí)驗(yàn)室生物安全措施進(jìn)行馬傳染性貧血實(shí)驗(yàn)室診斷時，按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。樣品采集、保存、運(yùn)輸執(zhí)行NY/T541的要求。本文件中各類試劑配制用水應(yīng)符合GB/T6682的要求。6臨床診斷6.1流行特點(diǎn)患病和帶毒動物是EIA主要傳染源，發(fā)熱期的患病動物排毒量最大，隱性動物攜帶病毒傳播具有隱秘性。自然條件下，EIAV主要由鹿虻、馬蠅、廄螯蠅和蚊子等吸血昆蟲叮咬和自然交配等方式經(jīng)血液和黏膜途徑傳播，也可由污染的手術(shù)器械和血液制品等經(jīng)人工操作傳播。EIA多流行于低洼地、潮濕地、沼澤地，吸血昆蟲活動活躍期高發(fā)，夏季高于其他季節(jié)，雨季高于旱季。性別的馬屬動物均可感染。6.2臨床癥狀自然感染潛伏期一般為20d～40d,人工感染潛伏期平均為10d～30d。狀?；捡R的臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜多樣，隨病程、環(huán)境改變和機(jī)體抵抗力的變化而轉(zhuǎn)化。根據(jù)臨床癥狀，通常將EIA患病動物分為急性、亞急性、慢性和隱性4個類型。急性型多見于新疫區(qū)或暴發(fā)初期，典型特征是高熱稽留或至死亡，臨床癥狀明顯；亞急性型多見于流行中期，病程比急性型長，典型特征表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的間歇熱，臨床癥狀規(guī)律性地隨體溫的升降而變化；慢性型是最多見的一種類型，病程可達(dá)數(shù)月或數(shù)年，其特點(diǎn)與亞急性相似，呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的間歇熱或不規(guī)則熱，但發(fā)熱期短，體溫上升不高，無熱期長，發(fā)熱期臨床癥狀較亞急性輕微；隱性型無臨床可見癥狀，通常難與健康動物區(qū)分，在應(yīng)激或過勞等某些不良因素下可能轉(zhuǎn)化為有臨床癥狀的類型。符合上述流行病學(xué)特征和臨床癥狀的病例，判為疑似EIAV感染。確診應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。37.1儀器設(shè)備7.1.1組織研磨儀。7.1.2混勻器。7.2試劑材料7.2.1一次性采血針。7.2.2一次性采血管(含有肝素抗凝劑)。7.2.3一次性使用塑料血袋(附帶針頭，含有肝素抗凝劑，容量250mL)。7.2.4一次性采血管(不含抗凝劑)。7.2.5淋巴細(xì)胞分離液。7.2.6雙抗溶液(青霉素G鈉鹽10kU/mL,硫酸鏈霉素10mg/mL)。7.2.7PBS,按照附錄A中A.1配制。7.2.81640培養(yǎng)液。7.3樣品采集核酸檢測用全血樣品：用一次性采血針于馬頸靜脈采集馬匹血液至5mL一次性采血管中，輕輕水平晃動采血管，使血液與抗凝劑充分混合。病毒培養(yǎng)用全血樣品：用一次性使用塑料血袋采集健康馬頸靜脈血液(全血)150mL～200mL,輕輕水平晃動采血袋，使血液與抗凝劑充分混合。無菌采集馬新鮮脾臟組織約5cm見方的小塊，置于無菌采集袋或其他滅菌容器中，密閉保存。用一次性采血針于馬頸靜脈采集血液至一次性采血管(不含抗凝劑)中，每管采集3mL～5mL。7.4樣品保存和運(yùn)輸樣品采集后，應(yīng)盡快置于保溫箱中，加入預(yù)冷的冰袋，密封，宜24h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室檢測。待檢樣品應(yīng)盡快處理，在4℃存放不超過24h,在一20℃冷凍保存時間稍長。若需長期保存，應(yīng)放置于一70℃以下條件。盡量避免反復(fù)凍融。7.5樣品處理7.5.1血漿樣品處理全血樣品以1000r/min離心5min,取上清液待檢。4將新鮮采集的或者保存于4℃~8℃條件下不超過12h的全血樣品進(jìn)行PBMC分離時，可采用兩種方法。一種方法是使用淋巴細(xì)胞分離液按照說明書進(jìn)行操作；另一種方法是置于室溫(20℃±5℃)垂直自然沉降30min,收集血漿和紅細(xì)胞之間的白色細(xì)胞薄層，立即進(jìn)行前病毒DNA的提取，或進(jìn)行PBMC的培養(yǎng)。7.5.3脾臟組織樣品處理取待檢脾臟組織樣品約2g,用組織研磨儀低溫破碎后，加入10mL含1%雙抗溶液的1640培養(yǎng)液制成組織懸液，充分振蕩混勻后，4℃以6000r/min離心5min,取上清液待檢。7.5.4血清樣品處理血清樣品以6000r/min離心5min,取上清液待檢。8.1儀器設(shè)備8.1.1實(shí)時熒光PCR儀。8.1.2分光光度計。8.1.3高速臺式冷凍離心機(jī)。8.1.4瞬時離心機(jī)。8.1.5混勻器。8.1.6分光光度計。8.2試劑材料8.2.1商品化細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒。8.2.2實(shí)時熒光PCR試劑盒(探針法)。8.2.3透明薄壁PCR管(0.2mL)或八聯(lián)管。8.2.4引物和熒光探針，制備過程見附錄B。8.3.1待檢樣品處理按照7.5進(jìn)行。8.3.2按商品化細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒的操作說明書，使用高速臺式冷凍離心機(jī)提取PBMC中的前病毒DNA,-20℃冰箱中備用。將實(shí)時熒光PCR試劑盒中的試劑置于冰上融化，取n+2個PCR反應(yīng)管(n為待檢樣品、陽性對照5和陰性對照數(shù)),按表1配制相應(yīng)反應(yīng)體系(不同公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒反應(yīng)成分不同，體系不同，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)的說明書進(jìn)行修改使用),振蕩混合均勻后瞬時離心。組分體積/μL2×實(shí)時熒光PCR緩沖液上游引物Fl(10μmol/L)0.75下游引物R1-3(10μmol/L)探針Pl_rc(10μmol/L)2無核酸酶水8.45總體積將加樣后的反應(yīng)管放入實(shí)時熒光PCR儀中，記錄樣本擺放順序。按下列程序進(jìn)行反應(yīng)：98℃預(yù)變性15min;95℃變性5s,60℃退火/延伸15s,進(jìn)行40個循環(huán)。8.5試驗(yàn)成立條件8.5.1陰性對照無Ct值，且無特異性擴(kuò)增曲線。8.5.2陽性對照的Ct值小于5,且有特異性擴(kuò)增曲線。8.6結(jié)果判定待檢樣品檢測Ct值小于6,且有特異性擴(kuò)增曲線，判定為EIAV核酸陽性。待檢樣品檢測Ct值大于或等于36、小于或等于40且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需重復(fù)檢測。如重復(fù)檢測結(jié)果Ct值小于36,且有特異性擴(kuò)增曲線，判定為EIAV核酸陽性。如仍為Ct值大于或等于36、小于或等于40,且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定為EIAV核酸陰性。待檢樣品檢測無Ct值，且無特異性擴(kuò)增曲線，判定為EIAV核酸陰性。9病毒分離與鑒定9.1儀器設(shè)備9.1.1CO,細(xì)胞培養(yǎng)箱。9.1.2倒置顯微鏡。9.1.3冷凍離心機(jī)。9.1.4Ⅱ級生物安全柜。69.2.1新生牛血清。9.2.3雙抗溶液(青霉素G鈉鹽10kU/mL,硫酸鏈霉素10mg/mL)。9.2.4細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25mL)。9.2.51640細(xì)胞培養(yǎng)液。9.3分離培養(yǎng)將分離獲得的病毒培養(yǎng)用PBMC進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用含30%新生牛血清、20%馬血清、1%雙抗溶液的1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按照2×10?/mL接種密度取8mL～10mL接入25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后單層細(xì)胞貼壁并生出突一般采用發(fā)病馬發(fā)熱期的血漿或病死馬的脾臟組織進(jìn)行分離，待檢樣品處理按照7.5進(jìn)行。對于血漿，取5mL直接接種于健康PBMC單層細(xì)胞。對于脾臟組織，取3mL組織懸液上清加入單層細(xì)胞中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱孵育吸附1h后，再加入含30%新生牛血清、20%馬血清、1%雙抗溶液的1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。同時設(shè)立健康細(xì)胞對照。9.3.3細(xì)胞病變觀察與鑒定接種后每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察5d～7d。初代分離培養(yǎng)通常難以出現(xiàn)細(xì)胞病變，一般需盲傳2代～3代，甚至更多的代次。如果樣品細(xì)胞培養(yǎng)物最終出現(xiàn)以細(xì)胞變圓、破碎、脫落為特征的細(xì)胞病變，提示可能有外源病毒生長。細(xì)胞培養(yǎng)物需通過實(shí)時熒光PCR進(jìn)行鑒定，實(shí)時熒光PCR陽性的判為EIAV分離陽性。10瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)10.1.2電磁爐及其配套平底鍋。10.1.3微波爐。10.2試劑材料10.2.1瓊脂(或瓊脂糖)。10.2.3EIAV瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗原(商品化試劑):系EIAVp26重組蛋白純化產(chǎn)物凍干粉，簡稱EIAV抗原。10.2.4陽性對照血清(商品化試劑)。10.2.5陰性對照血清(商品化試劑)。710.2.7玻璃錐形瓶。10.2.8平皿(直徑90mm)。10.2.9六角打孔器(孔徑4.5mm,孔間距4.5mm)。10.3平板的制備稱取瓊脂(糖)1g于玻璃錐形瓶中，加入100mL硼酸溶液，配制成1%瓊脂液。將瓊脂液(10.3.1)置于微波爐中加熱至剛剛沸騰，中間佩戴棉紗手套取出玻璃錐形瓶輕輕搖晃混勻數(shù)次，如此反復(fù)加熱至少3次，直至瓊脂完全融化，注意不要沸騰過度造成水分蒸發(fā)。取直徑90mm的平皿放在水平臺面上，每皿加入熱溶化瓊脂液25mL,加蓋室溫冷卻凝固至少3h,凝固后倒置平皿，防止水分蒸發(fā)。用六角打孔器直接在凝固的瓊脂上進(jìn)行打孔，現(xiàn)用現(xiàn)打，并用針頭小心挑出孔內(nèi)的瓊脂。挑出孔中瓊脂后，將一電磁爐專用平底鍋盛水后置于電磁爐上，加熱至沸騰后，立即關(guān)閉電源，將瓊脂平板置于水面上放置2min,取出后擦干平板外底部水分，即完成封底。將EIAV抗原(凍干粉)瓶中加入2mLPBS溶解后，取30μL加于中央孔；外周孔按順時針方向依次標(biāo)記為1～6,加樣時，取陽性對照血清30μL加于第1孔、第3孔、第5孔，第2孔、第4孔、第6孔加入待檢血清樣品或者陰性對照血清。將平板放于濕盒中，置于37℃避光恒溫箱內(nèi)，逐日觀察，連續(xù)觀察3d并記錄結(jié)果。10.5試驗(yàn)成立條件當(dāng)抗原孔與陽性對照血清孔之間出現(xiàn)1條清晰的沉淀線，與陰性對照血清孔之間無沉淀線出現(xiàn)抗原孔與待檢血清孔之間出現(xiàn)1條清晰的沉淀線，且與陽性對照的沉淀線相吻合者(見圖1的孔82、孔4),或抗原孔與待檢血清孔之間未出現(xiàn)沉淀線，但陽性對照孔的沉淀線末端彎向待檢血清孔內(nèi)側(cè)者，判為EIAV抗體陽性(見圖1的孔6)。22待檢血清3陽性血清抗原待檢血清6陽性血清5陽性血消待檢血清4圖1陽性結(jié)果圖抗原孔與待檢血清孔之間未出現(xiàn)沉淀線，且抗原孔與陽性對照孔之間的沉淀線末端直向待檢血清孔(見圖2的孔6)或彎向待檢血清孔外側(cè)者(見圖2的孔2),判為陰性?？乖着c待檢血清孔間出現(xiàn)沉淀線，但與陽性對照孔的沉淀線呈現(xiàn)交叉現(xiàn)象時，為非特異性反應(yīng)，判為EIAV抗體陰性(見圖2的孔4)。22待檢血清3陽性血清抗原待檢血清血清5陽性血清待檢血清圖2陰性結(jié)果圖11.1儀器設(shè)備11.1.1酶標(biāo)儀。11.1.2恒溫箱。11.1.3微孔板快速振蕩器。11.2試劑材料11.2.1包被抗原：同10.2.3。11.2.2PBS,按照A.1配制。911.2.3洗滌緩沖液PBST,按照A.3配制。11.2.5血清稀釋液及酶標(biāo)抗體稀釋液，按照A.5配制。11.2.6陽性對照血清(商品化試劑)。11.2.7陰性對照血清(商品化試劑)。11.2.8兔抗馬IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物(簡稱酶標(biāo)抗體)。11.2.9TMB(3',3',5',5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液。11.2.1196孔ELISA板。11.3操作方法將EIAV抗原加入2mLPBS溶解后，再將其稀釋至抗原濃度為1μg/mL,取100μL加入96孔ELISA板中，4℃孵育12h～16h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌緩沖液PBST250μL,孵育3min,棄去PBST,重復(fù)洗滌4次，每次拍干。向各孔加入200μL封閉液，將96孔ELISA板于置37℃作用2h,也可置4℃封閉12h～16h。11.3.4加待檢血清及對照血清按11.3.2方法洗滌4次。將每份待檢血清用血清稀釋液進(jìn)行200倍稀釋后，混合均勻，分別取100μL依次加入96孔ELISA板，每份血清加2個孔。每塊ELISA板設(shè)陰性對照血清和陽性對照血清各兩孔，每孔100μL。蓋好ELISA板，置37℃恒溫箱內(nèi)作用1h,洗滌同11.3.2。用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋至工作濃度，每孔加100μL,置37℃作用1h,洗滌同11.3.2。每孔加新配制的TMB底物溶液100μL,在室溫(20℃±5℃)下避光反應(yīng)5min～10min。輕微震蕩混合均勻后，置酶標(biāo)儀中，在波長為450nm下讀取OD值(OD?sonm),應(yīng)在加入終止液后5min內(nèi)完成讀數(shù)。11.4試驗(yàn)成立條件陽性對照血清兩孔平均ODsom大于1.0,陰性對照血清2孔平均OD5om小于或等于0.2時，反應(yīng)成立。待檢血清的兩孔平均OD?5om大于0.2,判為EIAV抗體陽性。待檢血清的兩孔平均OD?5onm小于或等于0.2,判為EIAV抗體陰性。同11.1。12.2.1酶標(biāo)抗原：HRP標(biāo)記的EIAV抗原(商品化試劑)。12.2.2ELISA抗體預(yù)包被板(商品化試劑):包被有EIAVp26蛋白特異性單克隆抗體并經(jīng)過封閉處理的96孔ELISA板。12.2.3其他試劑材料與11.2相同。12.3操作方法12.3.1血清與酶標(biāo)抗原的混合取待檢血清、陰性對照血清和陽性對照血清各60μL,分別置于離心管或八聯(lián)管中，在各管中分別加入60μL酶標(biāo)抗原，制成1:1(體積比)混合液，充分混勻，置37℃作用30min。每塊ELISA抗體預(yù)包被板均需設(shè)定陰性對照血清與酶標(biāo)抗原混合物、陽性對照血清與酶標(biāo)抗原混合物各2孔，其余孔為待檢樣品孔。按預(yù)設(shè)位置向ELISA板中加入12.3.1中處理好的血清與酶標(biāo)抗原置37℃恒溫箱中孵育30min。同11.3.2。每孔加TMB底物溶液100μL,置室溫(20℃±5℃)避光孵育5min。每孔加終止液50μL。輕微振蕩混合均勻后，置酶標(biāo)儀中在波長為450nm下讀取OD值(OD?5omm),應(yīng)在加入終止液后5min內(nèi)完成讀數(shù)。樣品抑制率(inhibitionpercentage)按公式(1)計算： (1)IPs——待檢血清樣品抑制率；OD?sone—-陰性對照血清樣品在450nm波長處的OD值；OD?sos——待檢血清樣品在450nm波長處的OD值；OD?so-e—-陽性對照血清樣品在450nm波長處的OD值。陰性對照血清平均OD?om大于1.0,且陽性對照血清平均OD5om小于0.2,判為試驗(yàn)成立。待檢血清樣品抑制率大于或等于55%時，判為EIAV抗體陽性。待檢血清樣品抑制率小于55%時，判為EIAV抗體陰性。13免疫印跡試驗(yàn)13.1儀器設(shè)備13.1.3往復(fù)式搖床。13.2試劑材料13.2.2EIAV抗原(分子質(zhì)量為34ku):同10.2.3。13.2.3兔抗馬IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物(簡稱酶標(biāo)抗體)。13.2.13硝酸纖維素膜。將EIAV抗原加入2mLPBS溶解后，采用商品化BCA法蛋白定量試劑盒對EIAV抗原進(jìn)行濃度測定。加熱器上95℃加熱5min,冷卻到室溫(20℃±5℃),樣品制備的總體積根據(jù)所需檢測的總體積進(jìn)行調(diào)整。在12%SDS膠加樣孔內(nèi)，在第一泳道加入蛋白分子量標(biāo)志5μL～10μL(根據(jù)說明書決定使用量)。在其余泳道每個孔重復(fù)加入13.3.2制備的蛋白樣品20μL(加樣泳道數(shù)量根據(jù)待檢血清的數(shù)量確定，每一個泳道對應(yīng)一個待檢血清)。置電泳儀中進(jìn)行垂直電泳，電泳電壓為100V,時間為90min～120min。將海綿墊、硝酸纖維素膜和電泳膠均放入在TBS緩沖液中浸泡1min,在半干轉(zhuǎn)膜儀上從下到上按照海綿墊/硝酸纖維素膜/電泳膠/海綿墊的順序依次疊放各層，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電壓設(shè)置為15V,時間為電轉(zhuǎn)印完畢后，將硝酸纖維素膜按泳道進(jìn)行標(biāo)記，并分別剪裁成單獨(dú)小條，用TBS緩沖液沖洗后，放入封閉液中進(jìn)行封閉，室溫(20℃±5℃)作用2h或4℃12h～16h。將陽性血清和待檢血清分別用封閉液按照1:200倍進(jìn)行稀釋，作為一抗，分別作用于對應(yīng)的硝酸纖維素膜小條，室溫(20℃±5℃)作用1h;以TBST洗膜3次(置往復(fù)式搖床上作用，10min/次)后，以兔抗馬IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物作為二抗，用封閉液按照1:5000倍稀釋后分別與膜進(jìn)行孵育，室溫(20℃±5℃)作用1h。再用TBST洗膜3次(置往復(fù)式搖床上作用，10min/次),采用DAB濃縮型試劑盒進(jìn)行顯色，室溫(20℃±5℃)避光孵育3min～10min或者更長時間，觀察直至陽性對照分子質(zhì)量為34ku處明顯顯色不再加深時，用雙蒸水洗滌2次～3次，去除DAB顯色液，即可終止顯色反應(yīng)。13.4試驗(yàn)成立條件13.4.1陽性對照血清孵育的轉(zhuǎn)印膜上在34ku處出現(xiàn)特異性的識別條帶。13.4.2陰性對照血清孵育的轉(zhuǎn)印膜上無特異性條帶，反應(yīng)成立。待檢血清孵育的轉(zhuǎn)印膜上，在34ku處出現(xiàn)特異性的識別條帶，判為EIAV抗體陽性。如果34ku處沒有出現(xiàn)特異性的識別條帶，判為EIAV抗體陰性。14綜合判定14.1符合第6章描述的流行病學(xué)特征和臨床癥狀，可初步判為疑似EIAV感染。14.2經(jīng)第8章、第9章、第10章、第12章、第13章任何一章所列方法檢測為陽性，判定為EIAV感染。14.3經(jīng)第11章檢測為陽性，需經(jīng)第10章、第12章、第13章所列方法進(jìn)行確認(rèn)，任何一項方法再次檢測為陽性，判定為EIAV感染；三項方法全部檢測為陰性，判為EIAV感染陰性。(規(guī)范性)試劑的配制A.1PBS(0.01mol/L,pH7.4)稱取8g氯化鈉、3.6g十二水磷酸氫二鈉、0.27g磷酸二氫鉀和0.2g氯化鉀，溶于900mL雙蒸水中，攪拌至完全溶解后，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,用雙蒸水定容至1L,經(jīng)0.22μm濾器過濾除在800mL水中加入9g硼酸，充分溶解后，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.6,加雙蒸水定容到1L,室溫(20℃±5℃)保存。在1L的PBS中加入1mL吐溫-20,充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配(配好后使用不超過7d),置室溫(20℃士A.4封閉液稱取脫脂奶粉5g,溶解于100mLPBS緩沖液中，獲得5%脫脂乳溶液作為封閉液。A.5血清稀釋液、酶標(biāo)抗原稀釋液及酶標(biāo)抗體稀釋液在90mLPBS中加入健康牛血清10mL混勻，用于血清、酶標(biāo)抗原和酶標(biāo)抗體的稀釋。將109mL硫酸(18.4mol/L)緩慢滴入800mL雙蒸水中，待冷卻后加雙蒸水定容至1L,置室溫量取下列試劑置于10mL塑料離心管中：1mol/LTris-HC