谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響研究

福建農(nóng)林大學(xué)本科畢業(yè)論文論文題目：谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響研究學(xué)院：資源與環(huán)境學(xué)院專業(yè)年級：2010級環(huán)境工程學(xué)號：姓名：指導(dǎo)教師、職稱：2014年5月27日College：_________Collegeofresourcesandenvironment__SpecialtyandGrade：___Environmentalengineering___Number：__Name：________________Advisor：____ZhengYaotong(Professor)__Submittedtime:_____May27,2014___目錄TOC\o"1-3"\h\u6298摘要： 谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的研究摘要：為了了解谷氨酸對白腐菌合成錳過氧化物酶作用和谷氨酸對白腐菌生長的作用。以黃孢原毛平革菌pc530、pc5305及雜色云芝TvR4為研究對象，將三種微生物在含不同濃度谷氨酸的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)12天，每隔24小時(shí)的測定錳過氧化物酶酶活及白腐菌生物量變化。結(jié)果顯示，谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶有抑制作用；黃孢原毛平革菌突變菌株P(guān)cR530、TvR4比野生菌株P(guān)c530在產(chǎn)錳過氧化物酶方面有更優(yōu)良的性能；谷氨酸對白腐菌的生長具有促進(jìn)作用；錳過氧化物酶是白腐菌Pc530的次級代謝產(chǎn)物。關(guān)鍵詞：白腐菌、谷氨酸、錳過氧化物酶Abstract:InordertounderstandtheinfluenceofGlutamatetowhite-rotfungusproduceMnpandwhite-rotfungus’biomass.Thepc530、pcR5305andTvR4asthereasearchobject,Threekindsofmicrobeinmediumcontainingdifferentconcenttationsofglutamatecontinuorscultivationof12daysdifferentconcenttationscontinuous.Every24hoursofeterminationofmanganeseperoxidaseenzymeactivityandthechangeofwhite-rotfungusbiomass.Resultshowthat,Glutamateinhibitionofwhite-rotfungusproduceMnp;PcR530、TvR4arebetterthanPc530atwhite-rotfungusproduceMnp;Glutamatepromotewhite-rotfungusgrowing;MnpisthePc530’ssecondarymetabolites.Keywords:white-rot;glutamate;Mnp引言：木質(zhì)素是一種高度復(fù)雜的不定型的芳香族化合物，是僅次于纖維素的第二大再生有機(jī)資源。木質(zhì)素是一類由苯酚和非苯酚結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在組分種類和連接鍵類型方面的多樣性，意味了結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性與不規(guī)則性，也決定了對其進(jìn)行生物降解的復(fù)雜性和特殊性[1]。白腐菌是指一類具有相同功能即引起木質(zhì)白色腐爛的絲狀真菌的集合。憑其選擇性降解木質(zhì)素的能力，白腐菌的菌絲穿入木質(zhì)，侵入木質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，釋放酶，導(dǎo)致木質(zhì)腐爛成為淡色海綿狀團(tuán)塊--白腐[2]。白腐菌是自然界中最有效的木質(zhì)素降解物。錳過氧化酶（Mnp,EC3）即是白腐菌中最重要的一種酶之一，是幾乎所有的木生白腐菌和各種土壤中的枯葉分解真菌所產(chǎn)生的，是最為普遍的木質(zhì)素修飾過氧化物酶。由于MnP的底物專一性較弱，可氧化各類芳香族化合物及一些難被生物降解的物質(zhì)，因而具有極高的工業(yè)應(yīng)用潛力，可在生物制漿、紙漿的酶法漂白、有機(jī)污染物的降解和環(huán)境的生物修復(fù)等方面得到有效的應(yīng)用，另外在褐煤的生物轉(zhuǎn)化過程中起重要的作用，可減少能源浪費(fèi)和環(huán)境污染[2、3]。目前，錳過氧化物酶的主要生產(chǎn)菌株是白腐菌[4]，白腐菌產(chǎn)生的胞外木素降解酶通常為次級代謝酶，產(chǎn)酶周期長，且產(chǎn)酶量很低，直接影響到該酶的實(shí)際應(yīng)用，使錳過氧化物酶的工業(yè)化生產(chǎn)受到限制[5]。因此，能否使白腐菌的錳過氧化物酶在工業(yè)及環(huán)境治理領(lǐng)域得到應(yīng)用，研究白腐菌的培養(yǎng)條件對產(chǎn)錳過氧化物酶的影響具有關(guān)鍵作用。本文探討了白腐菌在相同的生長培養(yǎng)基中加入不同濃度谷氨酸的生長規(guī)律，研究谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響進(jìn)行了初步研究，從而進(jìn)一步探索在谷氨酸存在條件下如何提高白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的產(chǎn)酶效率。1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種本次實(shí)驗(yàn)用到了實(shí)驗(yàn)室保存的白腐真菌模式菌種黃孢原毛平革菌黃(Phanerochaetechrysosporium),編號為pc530，及其通過誘變產(chǎn)生的菌株，標(biāo)號為pcR5305；以及雜色云芝(Coriolusversicolor)，編號TvR4。1.1.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基、液體富氮基本培養(yǎng)基（1）PDA固體培養(yǎng)基（土豆蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）即土豆20%，蔗糖20%，瓊脂20%[6]。1210C滅菌15min；滅菌后將培養(yǎng)基涼至500C左右，終濃度為0.5mmol/L；pH自然。液體基本培養(yǎng)基：以Kirk液體限氮基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對其進(jìn)行了改良，其成分如下：①碳源-葡萄糖10g/L;②氮源-酒石酸胺0.77g/L；③基本鹽（g/L）：KH2PO47、MnSO4·7H2O1.75、CaCl20.35、VB10.001,微量元素溶液24.5ml；④緩沖液-0.2mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液50ml（pH4.5）；⑤微量元素溶液（g/L）：甘氨2.1,MgSO4·7H2O10.5,MnSO4·H2O0.035,NaCl3.5,FeSO4·7H2O0.35,CoSO4·7H2O0.35,CaCl2·2H2O0.35,ZnSO4·7H2O0.35,CuSO4·5H2O0.035，AlK(SO4)2·12H2O0.035,H3BO30.035,NaMoO4·2H2O0.035；⑥pH值：調(diào)節(jié)4.5[7]。1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器立式壓力蒸汽滅菌鍋、SE93—1自動雙重純水蒸餾器、SW—CJ—1F型單人雙面凈化工作臺、可見分光光度計(jì)、PHX型智能升華培養(yǎng)箱、電子天平、HH—4數(shù)顯恒溫水浴鍋、全溫?fù)u瓶柜、PHS—25數(shù)顯pH計(jì)、溫度數(shù)顯調(diào)節(jié)儀、電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式冰箱、干燥器。1.1.4藥品谷氨酸粉末、瓊脂、酒石酸銨、葡萄糖、磷酸二氫鉀、酒石酸鈉、MgSO4·7H2O、CaCl2、醋酸、醋酸鈉、甘氨酸、MnSO4、30%過氧化氫、NaCl、CuSO4·5H2O、ZnSO4、硫酸鈷、硫酸鋁鉀、硼酸、維生素B1、FeSO4、ABTS、無水乙酸鈉、冰醋酸.1.1.5酶活測定實(shí)驗(yàn)試劑50mmol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH4.5）：分別配置50mmol/L的乳酸鈉和乳酸溶液，然后用乳酸溶液調(diào)乳酸鈉溶液的pH為4.5。1.6mmol/L的MnSO4溶液：稱取MnSO40.0676g,用蒸餾水定容至250ml。1.60mmol/L的H2O2溶液：用微量進(jìn)樣器（100ul）移取45.6ul30%的溶液，然后用蒸餾水定容至250ml。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1培養(yǎng)基的配置及接種將白腐菌TvR4(雜色云芝)、pcR5305、pc530接種在固體PDA培養(yǎng)基上,置于300C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長滿固體培養(yǎng)基。在三缸液體配置好的培養(yǎng)基中加入0、2、10mg的谷氨酸粉末，搖勻后把三缸液體培養(yǎng)基分裝于108個(gè)250毫升三角燒瓶中，每瓶裝100毫升。將324瓶三種不同濃度的培養(yǎng)基標(biāo)記好它的濃度和即將接種的菌種，并其置于高壓蒸氣鍋中滅菌1小時(shí)，待其冷卻后即可接種。在三種同濃度谷氨酸培養(yǎng)基中分別按標(biāo)簽對其進(jìn)行接種，培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，控制每瓶約為1.0xl07個(gè)孢子的相同接種量，即每瓶接1m2的兩個(gè)菌餅。還要有3個(gè)重復(fù)，接種時(shí)要避免細(xì)菌污染。還要保持菌種菌絲面朝上，保持其處于有氧狀態(tài)，尤其是pc530和pcR5305。37oC溫靜置培養(yǎng)，每隔24h取出1瓶發(fā)酵液測定其生物量及產(chǎn)酶活性。1.2.2粗酶液的制備及生物量的測定三角燒瓶中的三種菌種三種谷氨酸濃度的微生物各1瓶共9瓶分別置于九個(gè)漏斗上進(jìn)行過濾，濾液即是所需的粗酶液。過濾好粗酶液后，將殘留在濾紙上的微生物連同濾紙一起在800C的烘箱中烘干，烘干后的濾紙同微生物干重M2減去之前記錄好的干濾紙重M1，即為微生物的重量M[8]。做完后再做兩組平行試驗(yàn)。1.2.3錳過氧化物酶（MnP）酶活的測定取50mmol/L的乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH4.5）3.4ml,1.60mmol/L的MnSO4溶液0.1ml，0.4ml的粗酶液，放在7mlLEP管中，震蕩均勻，室溫下加入1.60mmol/L的H2O2溶液0.1ml啟動反應(yīng)，測反應(yīng)最初3min內(nèi)λ=240nm處吸光度變化，以0.1ml緩沖液代替MnSO4做空白對照，1個(gè)酶活力單位用每分鐘吸光值增加0.1的酶量來表示。MnSO4的ε240=8100mol-1·cm-1[9]。做完后再做兩組平行試驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。2結(jié)果和分析2.1相同微生物不同濃度谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶酶的影響上圖為野生菌株P(guān)c530隨谷氨酸濃度變化錳過氧化物酶酶活的變化圖。可以看出，3種濃度下該菌都在第5天左右開始產(chǎn)過氧化物酶，在5-7天內(nèi)上升速率比較快，隨之減緩，快到峰值時(shí)有所減慢。達(dá)到峰值后錳過氧化物酶的活性有所下降。在第9天達(dá)到最大值，含0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸培養(yǎng)液的酶活最大值分別為630U/L、600U/L、570U/L可以看出，隨著谷氨酸濃度的增加Pc530產(chǎn)錳過氧化物酶受到了抑制。上圖為突變菌株P(guān)cR5305隨谷氨酸濃度變化錳過氧化物酶酶活的變化圖。其在第1天就開始產(chǎn)錳過氧化物酶，酶活在第6天達(dá)到最大值。含0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸培養(yǎng)液的酶活最大值分別為1500U/L、1440U/L、1440U/L，隨著谷氨酸濃度的增加PcR5305產(chǎn)錳過氧化物酶受到了抑制。上圖為雜色云芝TvR4隨谷氨酸濃度變化錳過氧化物酶酶活的變化圖。該菌種在第1天開始產(chǎn)酶，酶活先較快上升，隨之減緩，快到峰值時(shí)有所減慢，第6-7天左右達(dá)到最大值。含0mg/L、2mg/L谷氨酸的培養(yǎng)液在酶活第7天達(dá)到最大值，酶活分別為1800U/L、1740U/L；含10mg/L谷氨酸的培養(yǎng)液的酶活第6天達(dá)到最大值，值為1710U/L。該菌種隨著谷氨酸濃度的增加，雜色云芝TvR4產(chǎn)錳過氧化物酶受到了抑制。2.2同種谷氨酸濃度下不同微生物對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的影響上圖為在0mg/L谷氨酸濃度下pc530、pcR5305、TvR4三種微生物產(chǎn)錳過氧化物酶的特性曲線。由圖可知pcR5305、TvR4都在第1天產(chǎn)酶，分別在第6天和第7天的酶的活性達(dá)到最大值，最大值分別為1500、1800。Pc530在第5天才開始產(chǎn)酶，在第9天達(dá)到最大值630?？梢园l(fā)現(xiàn)PcR5305、TvR4的開始產(chǎn)酶和酶活達(dá)到最大值的時(shí)間都比Pc530早，酶活的最大值也遠(yuǎn)高于Pc530。上圖為在2mg/L谷氨酸濃度下pc530、pcR5305、TvR4三種微生物產(chǎn)錳過氧化物酶的特性曲線。由圖可知pcR5305、TvR4都在第1天產(chǎn)酶，分別在第6天和第7天酶的活性達(dá)到最大值，最大值分別為1440、1740。Pc530在第5天才開始產(chǎn)酶，在第9天達(dá)到最大值600?？梢园l(fā)現(xiàn)PcR5305、TvR4的開始產(chǎn)酶和酶活達(dá)到最大值的時(shí)間都比Pc530早，酶活的最大值也遠(yuǎn)高于Pc530。上圖為在10mg/L谷氨酸濃度下pc530、pcR5305、TvR4三種微生物產(chǎn)錳過氧化物酶的特性曲線。由圖可知pcR5305、TvR4都在第1天產(chǎn)酶，在第6天酶的活性達(dá)到最大值，最大值分別為1410、1710。Pc530在第5天才開始產(chǎn)酶，在第9天達(dá)到最大值570。可以發(fā)現(xiàn)PcR5305、TvR4的開始產(chǎn)酶和酶活達(dá)到最大值的時(shí)間都比Pc530早，酶活的最大值也遠(yuǎn)高于Pc530。2.3谷氨酸對生物量的影響上圖是pc530在不同谷氨酸濃度培養(yǎng)條件下的生物量曲線圖，生物量出現(xiàn)最大值是在第7天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分別是0.6044g、0.6729g、0.6996g?？梢钥闯鲭S著谷氨酸濃度的增加生物量增大。上圖是pcR5305在不同谷氨酸濃度培養(yǎng)條件下的生物量曲線圖，生物量出現(xiàn)最大值是在第4天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分別是0.1726g、0.2499g、0.2933g?？梢钥闯鲭S著谷氨酸濃度的增加生物量增大。上圖是TvR4在不同谷氨酸濃度培養(yǎng)條件下的生物量曲線圖，生物量出現(xiàn)最大值是在第4天左右，0mg/L、2mg/L、10mg/L谷氨酸的生物量分別是0.2008g、0.2615g、0.2933g?？梢钥闯鲭S著谷氨酸濃度的增加生物量增大。2.4生物量與錳過氧化物酶生成量的關(guān)系同時(shí)通過Pc530的生物量及產(chǎn)酶的曲線圖對比分析，Pc530生物量最大值出現(xiàn)在第7天左右，酶活最大值出現(xiàn)在第9天左右。生物量達(dá)到最大值，即開始處于穩(wěn)定期后酶的活性才快速增長。3.結(jié)果與討論3.1谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶有完全抑制作用谷氨酸濃度越高三種白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶的酶活越低，說明谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶具有抑制作用。已有的研究結(jié)果表明，錳過氧化物酶的合成受碳源和氮源的限制。高碳低氮培養(yǎng)基有利于錳過氧化酶的合成，高濃度氮對酶的合成有抑制作用，這種現(xiàn)象叫“氨代謝物抑制”[3]。白腐菌代謝谷氨酸，NH4+是其中的產(chǎn)物[10]。谷氨酸濃度增加，白腐菌代謝產(chǎn)生的NH4+濃度增加，由于氨代謝抑制，錳過氧化物酶的活性就越受到抑制。國外一學(xué)者已證明了此結(jié)論[11].具體機(jī)制李慧蓉研究在黃孢原毛平革菌產(chǎn)錳過氧化物酶的篇中提到，氨基酸對Mnp的合成具有抑制作用，谷氨酸屬于一種氨基酸。其抑制機(jī)理與漆酶對苯丙氨酸的抑制機(jī)理類似，黎蘆醇VA是黃孢原毛平革菌次生代謝物，其生物合成受到含氮化合物的抑制。而谷氨酸是VA生物的合成的前體物；谷氨酸解氨酶通過對谷氨酸的解氨作用，在為VA的合成提供原料而參與VA合成的起始步驟的同時(shí)，將谷氨酸中的NH4+釋放到原來的木質(zhì)素降解體系中，提高了體系中氨的濃度，致使Mnp合成受到抑制[2]。3.2PcR5305、TvR4比Pc530在產(chǎn)錳過氧化物酶方面有更優(yōu)良的性能在同一種谷氨酸濃度下，總體而言，雜色云芝TvR4比突變菌株P(guān)cR5305的酶活要高一些，兩者又遠(yuǎn)高于野生菌株pc530。這表明，黃孢原毛平革菌突變菌株P(guān)cR5305、TvR4比野生菌株P(guān)c530在產(chǎn)錳過氧化物酶方面有更優(yōu)良的性能。有學(xué)者已經(jīng)論證突變菌株P(guān)cR530無論在富氮（NS）還是限氮(LN)條件下，均比黃孢原毛平革菌pc530產(chǎn)生更多的NO且不受髙氮抑制，PcR530可能通過某種機(jī)制形成更高濃度的NO并因此啟動富營養(yǎng)條件下WRF合成酶[12]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也一定程度上論證了其觀點(diǎn)，在富氮培養(yǎng)條件下，無論哪種谷氨酸濃度，突變菌PcR530、TvR4的過氧化物酶（Mnp）酶活的最大值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生菌株的酶活。在開始產(chǎn)酶的時(shí)間上，突變菌株P(guān)cR5305、TvR4也比pc530的時(shí)間早，再第1天就有產(chǎn)酶，出現(xiàn)峰值的時(shí)間也比pc530的時(shí)間提前。在本實(shí)驗(yàn)中突變菌株豐富的氮源不僅使菌體快速生長，也使酶合成快速增加，這是菌株突變基因改變，使酶的合成已完全打破了營養(yǎng)特別是氮阻遏的現(xiàn)象，其具備了在初生代謝階段合成錳過氧化酶的能力[13]。3.3谷氨酸對白腐菌的生長具有促進(jìn)作用由上面分析可知谷氨酸對白腐菌生長具有促進(jìn)作用，即谷氨酸濃度越高白腐菌生物量越大。微生物生長都要將糖類轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，糖類轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)都需要經(jīng)過中心氨代謝，而谷氨酸是中心氨代謝的必要物質(zhì)[14]。谷氨酸濃度的增加可以加快糖類轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的速率，微生物長得就快?？梢钥闯錾锪壳€呈先上升后緩慢下降的趨勢，應(yīng)該與其生長曲線有關(guān)，典型的微生物生長曲線包括四個(gè)時(shí)期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。開始剛接種，微生物對培養(yǎng)基不適應(yīng)，其數(shù)量幾乎不增長。剛開始白腐菌數(shù)量較少營養(yǎng)較為充沛，其數(shù)目增加很快。當(dāng)營養(yǎng)開始緊缺時(shí)，白腐菌數(shù)又趨穩(wěn)定，最后由于營養(yǎng)條件、微生物老化、代謝產(chǎn)物的抑制作用等白腐菌數(shù)逐漸下降。3.4錳過氧化物酶是白腐菌Pc530的次生代謝產(chǎn)物對于野生菌株P(guān)c530來說，生物量達(dá)到最大值，即開始處于穩(wěn)定期后酶的活性才快速增長，這種現(xiàn)象有學(xué)者證明了MnP屬于次級代榭產(chǎn)物[15]，次級代謝產(chǎn)物是指生物生長到一定階段才產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長和繁殖所必需的物質(zhì)。它通常在微生物營養(yǎng)缺乏時(shí)才會產(chǎn)生，當(dāng)營養(yǎng)缺乏時(shí)一般微生物達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)生物量會達(dá)到最大值。而其次生代謝產(chǎn)物錳過氧化物酶就較快的代謝，錳過氧化物酶的酶活增大可以降解木質(zhì)素等難降解的物質(zhì)為微生物提供能量。故與菌體生長不同步MnP的合成與菌體生長是非偶聯(lián)[8]。4.小結(jié)通過實(shí)驗(yàn)可以得出，谷氨酸對白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶有完全抑制作用；黃孢原毛平革菌突變菌株P(guān)cR5305、TvR4比野生菌株P(guān)c530在產(chǎn)錳過氧化物酶方面有更優(yōu)良的性能；谷氨酸對白腐菌pc530的生長具有促進(jìn)作用。而生物量與白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶沒有直接必然的聯(lián)系?？刂坪霉劝彼嵩诎赘L環(huán)境中的含量，可以提高白腐菌的產(chǎn)錳過氧化物酶的能力，對其在實(shí)際應(yīng)用中，如生物制漿、紙漿的酶法漂白、有機(jī)污染物的降解和環(huán)境的生物修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。參考文獻(xiàn)：[1]江凌、吳海珍，白腐菌降解木質(zhì)素酶系的特征及其應(yīng)用[J],化工進(jìn)展，2007,26（2）:198-203.[2]李慧蓉,白腐真菌生物學(xué)和生物技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.[3]浦躍武、甄浩銘、馮書庭、梁世中，白腐菌產(chǎn)錳過氧化物酶條件的研究[J]菌物系統(tǒng)17(3):251-255.1998.[4]劉夢茹、付時(shí)雨，錳過氧化物酶應(yīng)用的研究進(jìn)展[J],林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2006,26(2):112-116.[5]吳香波、謝益民，白腐菌Coriolusversicolor的培養(yǎng)及產(chǎn)漆酶條件的研究[J],纖維素科學(xué)與技術(shù),2009,17(2):12-19.[6]任大軍、顏克亮，白腐菌在固體培養(yǎng)基下對吲哚和吡啶的降解[J]，環(huán)境污染與防治，2006,28（9）:658-661.[7]李華鐘、章燕芳，黃袍原毛平革菌選擇性合成木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶[J],過程工程學(xué)報(bào),2002，2（2）:137-141.[8]楊曉寬，路福平，杜連祥,黃袍原毛平革菌產(chǎn)錳過氧化物酶培養(yǎng)基優(yōu)化[J],生物計(jì)術(shù),1004-311X（2004）03-0049-02.[9]StewartP,WhitwamRE,KerstenPJetal.Efficien