生物工業(yè)分析課件

生物工業(yè)分析

比色分析和分光光度法第一節(jié)概述第二節(jié)比色分析與分光光度法第三節(jié)紫外分光光度法第四節(jié)其他分光光度法簡介

比色分析和分光光度法第一節(jié)概述比色分析和分光光度法具有以下優(yōu)點：①靈敏度高；②準(zhǔn)確度較高；③操作簡便、分析速度快；④應(yīng)用廣泛。比色分析和分光光度法第二節(jié)比色分析與分光光度法一、基本原理1．朗伯—比爾定律比色分析與分光光度分析定量物質(zhì)的基礎(chǔ)是朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）：當(dāng)一束平行單色光通過均勻、非散射的稀溶液時，溶液對光的吸收程度（即為吸光度A）與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比。

A=KCL式中：A——吸光度；K——吸光係數(shù)；L——液層厚度；C——被測物質(zhì)的濃度。氣相色譜分析通常用光吸收曲線來描述待測溶液對各種波長光的吸收情況，將光源中不同波長的光依次通過固定濃度的待測溶液，分別測出溶液在不同波長下的吸光度，以波長λ為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)繪製的曲線稱為光吸收曲線或吸收光譜曲線。在光吸收光譜曲線上，光吸收程度最大處對應(yīng)的波長為該物質(zhì)的最大吸收波長，用λmax表示，最大吸收波長對應(yīng)的顏色就是物質(zhì)吸收光的顏色。在一定條件下物質(zhì)的吸收強度與其濃度成正比關(guān)係，這是物質(zhì)進行定量分析的依據(jù)。在各種物質(zhì)的分子吸收光譜中吸收峰的波長位置、吸收峰的相對強度以及吸收峰的形狀（峰寬）是對物質(zhì)進行定性與結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)。

氣相色譜分析2．儀器及使用方法

（1）581-G型光電比色計581-G型光電比色計光學(xué)系統(tǒng)如圖5-1所示。

圖5-1581-G型光電比色計光學(xué)系統(tǒng)1—光源2—反射鏡3—吸熱玻璃4—聚光鏡5—濾光片6—比色皿7—硒光電池8—檢流計

氣相色譜分析其中光源燈泡是6.3V的鎢絲燈泡；濾光片的作用是從白光中把最能為被測溶液吸收的某波段的單色光分出來，除去不被溶液吸收且干擾測定的其他波段的光，比色分析選用的濾光片的顏色應(yīng)該是溶液的互補色，每塊濾光片上都標(biāo)有該濾光片允許通過的光波的波長數(shù)值，單位為nm。581-G型光電比色計配有3塊濾光片，即紅（650nm）、綠（530nm）、藍（420nm）色濾光片。括弧內(nèi)波長表示該濾光片最強透過光的波長。選擇濾光片的原則是，濾光片透過的光應(yīng)是溶液吸收最強的光，這可根據(jù)顏色的互補關(guān)係來選擇，見表5-1。

氣相色譜分析溶液顏色濾光片的顏色濾光片能通過的波長（nm）黃色青紫400～435黃藍435～480桔紅綠藍480～490紅藍綠490～500紫綠500～560青紫黃綠560～580藍黃580～595綠藍桔紅590～610藍綠紅610～750表5-1溶液顏色與濾光片互補關(guān)係

氣相色譜分析（2）721型分光光度計它的工作波長範(fàn)圍為420～720nm,主要是專供一般化驗室在可見光區(qū)作常規(guī)定量比色分析。721型分光光度計原理示意圖如圖5-2所示。

圖5-2721型分光光度計原理示意圖1—光源2—聚光透鏡3—反射鏡4—彎曲狹縫5—保護玻璃6—準(zhǔn)直鏡7—棱鏡8—光亮調(diào)節(jié)器9—聚光鏡10—吸收池11—光門12—保護玻璃13—光電管14—直流放大器15—微安表

氣相色譜分析721型分光光度計的使用方法如下:

①在儀器接通電源以前,先將各種控制旋鈕開關(guān)置於關(guān)的位置上,並打開比色皿盒上的翻蓋。②預(yù)熱20分鐘，同時啟動檢流計的電源開關(guān)，調(diào)節(jié)檢流計的零點粗、細調(diào)節(jié)器，使透光度為100。待儀器穩(wěn)定後再使用。③選擇測定波長。④將盛有溶液的比色皿放在比色皿架上，空白溶液放在第一格內(nèi)，顯色溶液放在其他格內(nèi)，把暗箱蓋好。氣相色譜分析⑤用空白溶液調(diào)透光度為100。然後將比色皿定位拉桿依次輕輕拉出，使待測溶液依次進入光路，讀出吸光度或透光度。必要時可將空白溶液推入光路核對吸光度零位，再讀數(shù)一次。⑥使用完畢，應(yīng)將比色皿盒上的翻蓋打開，切斷檢流器電源，最後切斷儀器電源，將儀器用蓋好。同時用蒸餾水將比色皿洗滌乾淨(jìng)，存放於比色皿專用盒內(nèi)。使用時應(yīng)注意以下事項:①儀器連續(xù)使用2小時後，最好休息半小時，再繼續(xù)使用；②操作時，應(yīng)儘量避免試液滴入比色皿暗盒內(nèi)或儀器的面板上，若有滴出應(yīng)及時揩幹，以免腐蝕儀器。氣相色譜分析二、定量分析方法（1）標(biāo)樣計算法此法使用於個別樣品的分析。首先測出標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為Cs是已知的）的吸光度As，然後在相同的條件下測出樣品溶液的吸光度Ax（由於實驗條件相同，故K、L為定值，符合比爾定律）。依公式CxAs=CsAx可計算出待測樣品的濃度。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法此法適合於成批試樣的分析。首先配製一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測定其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。樣品也經(jīng)過同樣的處理，在和標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的條件下測吸光度。根據(jù)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出相應(yīng)的濃度。

氣相色譜分析三、應(yīng)用實例1．啤酒色度的測定①基本原理啤酒（或麥汁）的色澤越深，則在一定波長下的吸光度越大，因此，可以直接用吸光度表示啤酒的色度。也可以採用EBC比色計來測定.測定的樣品必須是清亮透明的。本實驗採用GB4927－2001規(guī)定的方法，即使用EBC比色計，將除氣後的試樣注入EBC比色計中，與標(biāo)準(zhǔn)EBC色盤比較，目視讀數(shù)或自動數(shù)字顯示出試樣的色度，以EBC色度單位表示。②儀器EBC色度計（或使用同等分析效果的儀器）：具有2EBC～27EBC單位的目視色度盤或自動數(shù)據(jù)處理與顯示裝置。

氣相色譜分析③試劑和溶液哈同（Hartong）基準(zhǔn)溶液：稱取重鉻酸鉀（K2Cr2O7）0.100g和亞硝醯鐵氰化鈉（Na2[Fe（CN）3NO]·2H2O）3.500g，用水溶解並定容至1000mL，貯存於棕色瓶中，於暗處放置24h後使用。④操作（a）啤酒的除氣取啤酒一瓶，啟蓋後用手堵住瓶口搖動，並經(jīng)濾紙過濾，以充分除去酒中的二氧化碳，靜置至泡沫完全消失後即可待用。除氣後的酒樣，清亮透明。但啤酒樣品暴露在空氣和陽光中的時間應(yīng)盡可能的短，以減少測定誤差。氣相色譜分析（b）儀器的校正將哈同溶液注入40mm比色皿中，用比色計測定，其標(biāo)準(zhǔn)色度應(yīng)為15EBC單位；若使用25mm比色皿，其標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)為9.4EBC。儀器的校正應(yīng)每月一次。（c）色度測定將清亮試樣注入25mm比色皿中，然後放到比色盒中，與標(biāo)準(zhǔn)色盤進行比較，當(dāng)兩者色調(diào)一致時直接讀數(shù)?；蚴褂米詣訑?shù)字顯示色度計，自動顯示、列印其結(jié)果。

氣相色譜分析⑤計算（a）如使用其他規(guī)格的比色皿，則需要換算成25mm比色皿的數(shù)據(jù)，報告其結(jié)果。試樣的色度按下式進行計算：

試樣的色度（EBC單位）＝×25式中：S——實測色度（EBC）；H——使用比色皿的厚度（mm）；25——換算成標(biāo)準(zhǔn)比色皿的厚度。（b）測定濃色和黑色啤酒時，需要將酒樣稀釋至合適的倍數(shù)，然後將測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，所得結(jié)果表示至整數(shù)。

SH氣相色譜分析2．啤酒中鐵的測定（比色法）①基本原理在微酸性條件下，鄰菲羅啉與Fe2+離子生成桔紅色配合物，用比色法測定啤酒中鐵含量。反應(yīng)如下：

鄰菲羅啉桔紅色

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）鄰菲羅啉溶液稱取0.30g鄰菲羅啉，加100mL水，加熱至70℃，使其溶解即可。（b）抗壞血酸溶液稱取2.5g抗壞血酸，用水溶解並稀釋至100mL，本試劑需當(dāng)日配製。（c）標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液準(zhǔn)確稱取1.755g硫酸亞鐵銨[Fe（NH4）2（SO4）2.6H2O]，用水溶解，加0.6mL濃鹽酸，用水定容至250mL。使用時吸取5mL該溶液，用水稀釋定容至1000mL，每毫升含鐵5μg。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計，比色管，1cm比色皿。

氣相色譜分析③測定步驟準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液（5μg/mL）0.0、1.5、2.5、3.5、5.0、10.0mL，分別放入6個50mL的容量瓶中，用水分別定容至刻度搖勻，其濃度分別為0.0、0.15、0.25、0.35、0.50、1.0μg/mL。於6只比色管中分別準(zhǔn)確吸入上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)鐵稀釋溶液25mL。準(zhǔn)確吸取25mL除氣啤酒放入另一只比色管中。向上述7只比色管中，分別加入抗壞血酸溶液1mL，搖勻，再加入鄰菲羅啉溶液2mL，搖勻，在60℃水浴中保持15min，冷卻。然後在505nm處，用1cm比色杯測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)鐵的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以試樣管的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上查出試樣管中鐵的含量。

氣相色譜分析④討論（a）配製試劑及測定中用的水均系以玻璃儀器重蒸的蒸餾水。（b）鄰菲羅啉比色法測定鐵，靈敏度較高，溶液中含鐵0.1mg/L時其顏色也很明顯，且色澤很穩(wěn)定，易於比色。（c）加抗壞血酸的作用是將三價的鐵離子還原為二價的鐵離子。（d）二價鐵離子與鄰菲羅啉在pH2～9的範(fàn)圍內(nèi)都能顯色，但為了減少其他離子對測定的影響，通常在pH5的微酸性溶液中顯色。由於啤酒的PH值與此接近，故不用加緩衝溶液。

氣相色譜分析3．白酒中雜醇油的測定（比色法）①基本原理雜醇油中的異丁醇、異戊醇在脫水劑濃硫酸的存在下，可與芳香醛縮合成有色物質(zhì)，因此，可以用比色法進行測定。顯色劑為對二甲氨基苯甲醛，標(biāo)準(zhǔn)雜醇油採用異丁醇和異戊醇（1:4）的混合液。②試劑與儀器試劑（a）0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液稱取0.5g對二甲氨基苯甲醛，溶於100mL濃硫酸中，此試劑應(yīng)新鮮配製。（b）標(biāo)準(zhǔn)雜醇油溶液準(zhǔn)確吸取0.26mL重蒸異丁醇和1.04mL重蒸異戊醇，置於100mL容量瓶中，加入50mL無雜醇油乙醇，用蒸餾水定容至刻度，此試劑每毫升含雜醇油10mg,使用時應(yīng)稀釋為0.1mg/mL。氣相色譜分析（c）無雜醇油乙醇取分析純無水乙醇200mL，加0.25g鹽酸間苯二胺，於沸水浴中回流2h，然後改用分餾柱於沸水浴中蒸餾，收集中間餾分約100mL，經(jīng)檢查不顯色為合格。（檢查方法：吸取0.1mL製備的無雜醇油乙醇置於10mL比色管中，加入0.9mL蒸餾水和2mL0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液，搖勻，於沸水浴中加熱20min，取出迅速冷卻，加2mL蒸餾水稀釋，與試劑空白比較不顯色即可）。（d）樣品的製備吸取1mL（V1）酒樣，加蒸餾水定容至10mL。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計，比色管，1cm比色皿。氣相色譜分析③測定步驟在10mL的比色管中按下表加入各溶液：以上各比色管搖勻放冰水浴中，沿稍傾斜的比色管壁緩慢加入0.5%對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液2mL，使硫酸溶液至管底，搖勻，放入沸水浴中加熱15min後取出迅速冷卻。然後各加入2mL蒸餾水（色深可加5mL），混勻。10min後，在波長520nm處，測吸光度，繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，依樣品管測得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酒樣稀釋液中雜醇油的含量。

編號標(biāo)準(zhǔn)管樣品管0123456標(biāo)準(zhǔn)雜醇油溶液（0.1mg/mL）mL00.10.20.30.40.5吸取酒樣稀釋液0.3mL（V2）mg0O.O10.020.030.040.05蒸餾水（mL）

10.90.80.70.60.50.7氣相色譜分析④計算樣品管中雜醇油的含量（mg）雜醇油（g/100mL）=×100

式中：V1——所取酒樣的體積（mL）；V2——酒樣稀釋液的體積（mL）。⑤說明對二甲氨基苯甲醛濃硫酸溶液與丙醇、異丙醇及正丁醇無顯色反應(yīng)。因此，用一種醇作為標(biāo)準(zhǔn)來計算白酒中雜醇油的含量是有誤差的。準(zhǔn)確定量白酒中雜醇油的含量應(yīng)用氣相色譜法。

樣品管中雜醇油的含量V2×V1/10×1000

氣相色譜分析4．味精中鋅的測定①基本原理在pH4.0～5.5的弱酸性介質(zhì)中，鋅與雙硫腙（又名打薩腙、二苯腙、二苯磺腙、二苯硫代偶氮碳醯肼、二苯硫卡巴腙、二苯基縮二氨基硫脲等）形成紅色配合物，然後用比色法在530nm處進行測定。反應(yīng)如下：

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液準(zhǔn)確稱取1g鋅粒，溶於8mL1﹕1鹽酸溶液中，轉(zhuǎn)入1000mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。（b）20%鹽酸羥胺溶液稱取20g鹽酸羥胺，溶於100mL蒸餾水中，置於分液漏斗中，用0.004%雙硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳層為綠色為止。（c）醋酸-醋酸鈉緩衝溶液取2mol/L醋酸溶液和2mol/L醋酸鈉溶液等體積混合，置於分液漏斗中，用0.004%雙硫腙四氯化碳溶液分次抽提，直至四氯化碳層為綠色為止。（d）1%硫化鈉溶液稱取1g硫化鈉，溶於100mL蒸餾水中即可。（e）0.004%雙硫腙四氯化碳溶液稱取0.04g雙硫腙，溶於1000mL四氯化碳中即可。（f）味精試樣溶液準(zhǔn)確稱取5g味精試樣，加蒸餾水20mL溶解後，轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中即可。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標(biāo)準(zhǔn)系列的製備準(zhǔn)確吸取0、2、4、6、8、10mL標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液（1μg/mL），分別置於250mL分液漏斗中，各加入10mL醋酸-醋酸鈉緩衝溶液，2mL20%鹽酸羥胺溶液，2mL1%硫化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至約150mL，混勻。加10mL0.004%雙硫腙四氯化碳溶液，劇烈搖振15min，靜止分層，取四氯化碳層比色。（b）味精液的處理同標(biāo)準(zhǔn)系列液的處理。（c）測定在530nm波長處測定標(biāo)準(zhǔn)系列及味精試樣的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)鋅溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得味精試樣吸光度對應(yīng)的鋅含量（微克數(shù)），然後計算處理。

氣相色譜分析④計算式中：W1——

標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的鋅的微克數(shù)；W2——

所取的味精重量。⑤討論（a）實驗證明，雙硫腙鋅配合物在pH4.7～5.2範(fàn)圍內(nèi)能定量地被四氯化碳萃取，而且色澤至少在2h內(nèi)穩(wěn)定。（b）測定過程中加入20%鹽酸羥胺溶液是為了防止雙硫腙的氧化。（c）測定過程中加入硫化鈉溶液是為了防止銅、汞、金、鉍、鉛、鎘、錳等金屬離子對測定的干擾。

氣相色譜分析5．檸檬酸中砷的測定（砷斑比色法，又稱Gutzeit比色法）①基本原理三氧化二砷和亞砷酸在酸性溶液中被氫迅速還原為砷化氫：反應(yīng)中生成的砷化氫，通過用醋酸鉛濕潤過的棉花以吸去可能夾雜的硫化氫，然後與浸過溴化汞（或二氯化汞）溶液的試紙發(fā)生反應(yīng)，使試紙呈現(xiàn)黃色：氣相色譜分析在測定過程中，為加速砷酸（H3AsO4）的還原,可加入碘化鉀將砷還原為亞砷酸，所生成的碘用酸性氯化亞錫還原，同時，氯化亞錫也可以使五價砷還原為三價砷化合物：溴化汞（或二氯化汞）試紙著色強度與樣品中砷的含量成正比。因此，用已知砷量的標(biāo)準(zhǔn)溶液處理得到的試紙進行比色，可以測定樣品中砷的含量。

氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）砷標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取0.1g三氧化二砷，加5mL20%氫氧化鈉，然後用1﹕4硫酸溶液中和，再過量10mL1﹕4硫酸溶液，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。使用時，吸取10mL1﹕4硫酸溶液，用蒸餾水稀釋定容至1000mL，稀釋後每毫升含三氧化二砷1μg。（b）20%碘化鉀溶液稱取20g碘化鉀，溶於100mL蒸餾水中即可。（c）溴化汞試紙稱取1g溴化汞，加20mL乙醇溫?zé)崛芙猓萌胱厣恐?，避光保存。將乾淨(jìng)、光潔的濾紙切成小塊，於溴化汞溶液中浸漬1h，取出風(fēng)乾，置入棕色瓶中避光保存。浸漬與風(fēng)乾過程最好避光操作。氣相色譜分析（d）酸性氯化亞錫溶液稱取20g錫，加60mL濃鹽酸和20mL蒸餾水，溫?zé)嶂翚馀菹?，加蒸餾水至100mL，多餘的錫仍留在溶液中。（e）乙酸鉛棉花取脫脂棉，用5%乙酸鉛溶液浸透後除去多餘的溶液，並使疏鬆，在100℃以下溫度乾燥，置於帶塞瓶中，乾燥處保存。（f）無砷鋅粒（g）濃鹽酸儀器

Gutzeit定砷器見圖5-3。

氣相色譜分析圖中，A為100mL三角瓶，B為橡皮塞，C為全長約18cm的上粗下細的玻璃管，粗管部分的內(nèi)徑約為6.5mm,長約14cm，細管部分的內(nèi)徑約為1～3mm粗管部分裝入長約5～6cm的乙酸鉛棉花，乙酸鉛棉花距離上端管口至少3cm。細管部分緊密插入橡皮塞B中，深入瓶中大約1cm。D、E均為有機玻璃平板，中間有一與C管較粗部分相匹配的小孔。D、E兩板的兩側(cè)均有對應(yīng)的突出部分用於固定。使用時，將E板蓋在D板上，使兩圓孔相吻合，中間夾一溴化汞試紙，用橡皮圈將兩板固定。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標(biāo)準(zhǔn)砷斑的製備吸取2mL標(biāo)準(zhǔn)砷溶液（1μgAs2O3/mL）置於A瓶中，加21mL蒸餾水，5mL濃鹽酸，5mL20%碘化鉀溶液和5滴酸性氯化亞錫溶液，於室溫下放置10min，加1.5g無砷鋅粒，迅速安裝好儀器（注意密封！），保持反應(yīng)溫度在25～40℃之間（視反應(yīng)快慢而定，但不應(yīng)超過40℃），1小時後取出溴化汞試紙，置於乾燥的玻璃管中，即可製成標(biāo)準(zhǔn)砷斑。（b）樣品的測定準(zhǔn)確稱取2g檸檬酸樣品，置於A瓶中，加23mL蒸餾水溶解，以下同標(biāo)準(zhǔn)砷斑的製備。如生成的砷斑色澤比淺，則此檸檬酸樣品砷含量合格。

氣相色譜分析④討論（a）Gutzeit定砷法靈敏度高，因此，實驗過程所用的試劑均不應(yīng)生成砷斑。（b）無砷鋅粒系指細的顆粒，如使用的鋅粒較大，則用量需酌量增加。（c）砷斑在空氣中易褪色，如需保存，可在含5%固體石蠟的石油醚中浸一下，待石油醚揮發(fā)後，避光保存於乾燥處。

氣相色譜分析6．白酒中鉛的測定（比色法）①基本原理鉛離子與雙硫腙在pH9.0左右的弱鹼性溶液中生成紅色配合物，該化合物溶於氯仿，其顏色深淺與鉛離子的濃度成正比，因此，可用比色法測定白酒中鉛的含量。反應(yīng)如下：氣相色譜分析②試劑與儀器試劑（a）標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液準(zhǔn)確稱取於105℃乾燥2h的分析純硝酸鉛0.1598g,加1%硝酸100mL溶解後,轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度.使用時,吸取10mL上述溶液,用蒸餾水稀釋定容至100mL,每毫升稀釋後溶液含鉛10μg。（b）雙硫腙氯仿溶液稱取精緻過的雙硫腙0.1g,加100mL氯仿溶解,作為貯備液.使用時,吸取1mL雙硫腙貯備液,加100mL氯仿稀釋,每毫升稀釋後溶液含雙硫腙10μg。（c）20%檸檬酸銨溶液稱取50g檸檬酸銨,溶於100mL蒸餾水中,加2滴酚紅指示劑,用氨水調(diào)成微紅色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用雙硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈綠色,棄去雙硫腙氯仿層,再用少量氯仿提取殘剩的雙硫腙,直至氯仿層為無色,將檸檬酸銨溶液加水至250mL。氣相色譜分析（d）20%鹽酸羥胺溶液稱取20g鹽酸羥胺,溶於60mL蒸餾水中,加2滴酚紅指示劑,用氨水調(diào)成微紅色（pH8.5～9.0）,置入分液漏斗中,用雙硫腙氯仿溶液分次抽提,直至抽提液呈綠色,棄去雙硫腙氯仿層,再用少量氯仿提取殘剩的雙硫腙,直至氯仿層為無色,將鹽酸羥胺溶液用6mol/L鹽酸酸化成酸性（成黃色）加蒸餾水至100mL。（e）酚紅指示劑稱取0.1g酚紅,溶於100mL95%乙醇中,過濾。（f）10%及1%氰化鉀溶液（除鉛的方法同試劑c和d）。（g）1﹕1氨水。（h）6mol/L鹽酸。（i）10%鹽酸。（j）10％的氰化鉀溶液。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟（a）標(biāo)準(zhǔn)系列管的製備在50mL比色管中,按下表加入各溶液：每只比色管中各加2滴酚紅指示劑,用濃氨水調(diào)成微紅色（pH8.0～9.5）,各加1mL10%氰化鉀溶液,10mL雙硫腙氯仿溶液,劇烈搖振1min,靜置分層。編號012345標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液（10μg/mL）毫升0.0O.20.40.60.810微克0.0O.0020.0040.0060.0080.010蒸餾水（毫升）10.09.89.69.49.29.020%檸檬酸銨溶液（mL）22222220%鹽酸羥胺溶液（mL）111111氣相色譜分析（b）試樣管的製備取適量酒樣（含鉛量約5μg左右），置於50mL燒杯中，於沸水浴中蒸幹。加10mL1﹕1鹽酸溶液，於沸水浴中再次蒸幹（若消化液呈黃色，則再用5mL1﹕1鹽酸溶液，於沸水浴中再次蒸幹）。加2mL10%鹽酸溶液溶解殘渣，轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用蒸餾水洗滌燒杯，並用蒸餾水稀釋至約10mL，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)系列管的製備。（c）測定目視比色法測定將試樣管氯仿層與標(biāo)準(zhǔn)系列管中氯仿層顏色比較，求得酒樣中鉛的含量：

鉛（mg/L）=×1000式中：V1——是試樣管與標(biāo)準(zhǔn)管色澤相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)管中鉛溶液體積（mL）；

V——所取酒樣的體積（mL）。

V1×0.01V氣相色譜分析分光光度法測定將標(biāo)準(zhǔn)系列管與試樣管中水層分棄，用氯仿層比色，在510nm波長下測吸光度，繪製標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得試樣管吸光度對應(yīng)的鉛的微克數(shù)（W），按下式計算：

鉛（mg/L）=

式中：V——所取酒樣的體積（mL）。WV氣相色譜分析④討論

（a）雙硫腙法測定鉛其靈敏度高，因此，對測定過程所用試劑及溶劑都需檢查是否含鉛，必要時需純化處理。

（b）雙硫腙能與許多金屬離子呈色，故雙硫腙並非鉛的專一試劑。但在一定的條件下能消除別的金屬離子的干擾。①pH控制在8.5～9.0；②加入氰化鉀配合劑，使許多金屬離子形成穩(wěn)定的配合物而被掩蔽；③加入檸檬酸銨，防止在鹼性條件下鹼土金屬的沉澱；④加入還原劑鹽酸羥胺，防止三價鐵離子對雙硫腙的氧化。（c）酚紅指示劑變色pH為6.8～8.0，顏色改變從黃色變?yōu)榧t色，在酸性條件下酚紅也呈紅色。因試樣管為酸性，加酚紅指示劑後呈紅色，需用氨水調(diào)製由紅變黃，再由黃變紅為止。

氣相色譜分析7．單核苷酸類的測定（定磷法）

①基本原理單核苷酸中的磷酸基為有機磷，經(jīng)硫酸消化後轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機磷，與鉬酸銨作用，在酸性條件下被還原劑如維生素C還原為鉬藍，用比色法測定。②試劑與儀器試劑（a）10mol/L硫酸溶液量取27.8mL濃硫酸，緩慢倒入適量水中，用水稀釋至100mL。（b）6mol/L硫酸溶液量取16.7mL濃硫酸，緩慢倒入適量水中，用水稀釋至100mL。（c）維生素C溶液稱取10g維生素C（抗壞血酸），用水溶解並稀釋至100mL。氣相色譜分析（d）2.5%鉬酸銨溶液稱取2.5g鉬酸銨，用水溶解並稀釋至100ml。（e）定磷試劑取6mol/L硫酸溶液、2.5%鉬酸銨溶液、水和維生素C溶液，依次按體積比1:1:2:1混合，本試劑應(yīng)新鮮配製。（f）標(biāo)準(zhǔn)磷溶液準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀0.4329g，用水溶解並定容至1000mL。使用時，吸取10mL上述溶液，用水稀釋定容至100mL，每毫升含磷10μg。（g）濃硫酸。（h）過氧化氫。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計。

氣相色譜分析③測定步驟

（a）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪製在6只試管中按下表要求加入各種試劑：以上6只試管於45℃水浴中顯色25min，在660nm波長下測吸光度，繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

編號012345標(biāo)準(zhǔn)磷溶液（10μg/mL）毫升（mL）0.00.20.40.60.81.0微克（μg）0.0246810水（毫升，mL）32.82.62.42.22.0定磷試劑（毫升，mL）333333氣相色譜分析（b）試樣液的製備準(zhǔn)確稱取0.1g試樣，溶於水中（難溶時可加1～2滴濃氨水），並用水稀釋定容至100mL。（c）總磷的測定吸取1mL試樣液，置於50mL凱氏瓶中，加2.5mL濃硫酸，加熱至冒白煙，冷卻。加2滴過氧化氫，繼續(xù)加熱至無色透明，冷卻，用水稀釋定容至50mL。吸取3mL稀釋消化液（含磷量10μg以下），以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪製，測其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得磷量（W1，μg）。（d）無機磷的測定吸取1mL試樣液，用水稀釋定容至50mL，吸取3mL稀釋液，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪製，測其吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得磷量（W2，μg）。

氣相色譜分析④計算按下式計算單核苷酸的含量式中：M1——單核苷酸相對分子品質(zhì)M2——磷的相對原子品質(zhì)W——稱取試樣重量（g）⑤討論本法中磷含量在0～10μg內(nèi)符合比爾定律。

氣相色譜分析8．液化型澱粉酶活力的測定①基本原理液化型澱粉酶能使?jié)辗鬯鉃榉肿恿看笮〔灰坏暮蜕倭康柠溠刻呛推咸烟?，使?jié)辗叟c碘呈藍紫色反應(yīng)逐漸消失，顏色的消失速度可以衡量酶活力的高低。

②試劑與儀器

（a）稀碘液稱取11g碘，22g碘化鉀，置於研缽中，加少量蒸餾水研磨至碘完全溶解，用蒸餾水稀釋至500mL，貯存於棕色瓶中。吸取上述碘溶液2mL，加碘化鉀20g，用蒸餾水稀釋至500mL，貯存於棕色瓶中。（b）標(biāo)準(zhǔn)比色液甲液：精確稱取40.2439g氯化鈷（CoCl2?6H2O）和0.4878g重鉻酸鉀（K2Cr2O7），用蒸餾水溶解並定容至500mL。乙液：精確稱取40mg鉻黑T，用蒸餾水溶解並定容至100mL。使用時，取41mL甲液和4.5mL乙液混合，於冰箱中保存，使用7天後需重新配製。氣相色譜分析（c）pH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液稱取45.23g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O），8.07g檸檬酸，用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL。（d）2%可溶性澱粉溶液準(zhǔn)確稱取可溶性澱粉2g（預(yù)先於100～105℃烘乾），加少量水調(diào)勻，傾入80mL沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻後用水定容至100mL。（e）酶液準(zhǔn)確稱取酶粉2g，用pH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液稀釋定容至一定體積（使其測定時酶解反應(yīng)控制在2～3min內(nèi)）,於40℃水浴浸取半小時，紗布過濾，濾液為實驗用酶液。

氣相色譜分析③測定步驟（a）取2mL標(biāo)準(zhǔn)比色液於白瓷板空穴內(nèi)，作為比較顏色的標(biāo)準(zhǔn)。（b）取20mL2%可溶性澱粉和5mLpH6.0磷酸氫二鈉—檸檬酸緩衝溶液，注入三角瓶中，在60℃恒溫水浴中預(yù)熱10min，然後加入預(yù)先稀釋好的酶液0.5mL，立即記錄時間，充分搖勻，定時用滴管取出反應(yīng)液約0.5mL。滴入預(yù)先充滿比色稀碘液（約1.5mL）的白瓷板空穴內(nèi)，當(dāng)穴內(nèi)顏色反應(yīng)由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色，與標(biāo)準(zhǔn)比色液相同時，即為反應(yīng)終點，並記錄時間T（分鐘,min.）。

氣相色譜分析④計算以1g酶粉或1mL酶液於60℃pH6.0的條件下，1小時液化可溶性澱粉的克數(shù)來表示。用下式計算：式中：n——酶液稀釋倍數(shù)；20——可溶性澱粉吸取體積（mL）；0.5——測定時用酶液體積（mL）；2%——澱粉液濃度；T——測定記錄時間（min.）；W——酶粉取樣量（g）。

氣相色譜分析⑤討論

（a）酶反應(yīng)全部時間應(yīng)控制在2～2.5min之內(nèi)，商品液化型澱粉酶粉劑活力為1500～2500單位，酶粉稀釋100～200倍為宜。（b）可溶性澱粉的品質(zhì)對液化型澱粉酶活力有一定的影響，為統(tǒng)一起見，可溶性澱粉使用浙江菱湖澱粉廠生產(chǎn)的化學(xué)純試劑配製。

氣相色譜分析9．蛋白酶活力的測定①基本原理蛋白酶水解酪蛋白，其產(chǎn)物酪氨酸能在鹼性條件下使福林—酚試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，以比色法測定。②試劑與儀器

試劑（a）福林—酚試劑稱取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）和鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O），置於1000mL圓底燒瓶中，加350mL蒸餾水，25mL85%磷酸，50mL濃鹽酸，文火微沸10h，取下回流冷凝器，加50mL硫酸鋰（Li2SO4）和25mL蒸餾水，混勻後，加溴水脫色，直至溶液呈金黃色，再微沸15min，驅(qū)除殘餘的溴，冷卻，用4號耐酸玻璃篩檢程式抽濾，濾液用蒸餾水稀釋至500mL。氣相色譜分析（b）標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液準(zhǔn)確稱取DL—酪氨酸0.1g，加入少量0.2mol/L鹽酸溶液（取1.7mL濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至100mL），加熱溶解，用蒸餾水定容至1000mL，每毫升含酪氨酸100μg。（c）pH7.2磷酸緩衝溶液取28mL磷酸二氫鈉溶液[配製稱取31.2g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL]和72mL磷酸氫二鈉溶液[配製稱取71.6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）用蒸餾水溶解並稀釋至1000mL]，混合後用蒸餾水稀釋至1000mL。（d）2%酪蛋白溶液稱取2.00g酪蛋白（又名乾酪素），加約40mL蒸餾水和2～3滴濃氨水，於沸水浴中加熱溶解，冷卻後，用pH7.2磷酸緩衝溶液稀釋定容至100mL，貯存於冰箱中。氣相色譜分析（e）0.4mol/L三氯乙酸溶液稱取三氯乙酸65.5g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。（f）0.4mol/L碳酸鈉溶液稱取無水碳酸鈉42.4g，用蒸餾水溶解並定容至1000mL。（g）酶液準(zhǔn)確稱取酶粉2g，用pH7.2磷酸緩衝溶液定容至200mL，置於40℃水浴浸取半小時，用紗布過濾。根據(jù)酶活力的高低，再用pH7.2磷酸緩衝溶液稀釋一定倍數(shù)（使其測定吸光度在0.2～0.4範(fàn)圍內(nèi)為宜）。儀器可見光範(fàn)圍的分光光度計。氣相色譜分析③測定步驟

（a）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪製取九支試管按下表將標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液進行稀釋：從上述各試管中各取1mL，分別加入5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，1mL福林—酚試劑，於40℃水浴中顯色20min，在680nm波長下測定吸光度，繪製標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得吸光度為1時相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)（即為K值）。

編號012345678標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液（毫升,mL）012345678蒸餾水（毫升,mL）1098765432稀釋酪氨酸溶液濃度（微克/毫升）01020304050607080氣相色譜分析（b）蛋白酶活力測定取4支10mL離心管，分別加入1mL稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行試驗管。置於40℃水浴中預(yù)熱3～5min，在三支平行試驗管中分別加入1mL2%酪蛋白溶液，準(zhǔn)確計時保溫10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min後離心分離或用濾紙過濾。分別吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸鈉溶液，最後加入1mL福林—酚試劑，搖勻，置於40℃水浴中顯色20min?？瞻坠苤邢燃尤?mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加入1mL2%酪蛋白溶液，15min後離心分離或用濾紙過濾。以下操作與平行試驗管相同。以空白管為對照，在680nm波長下測定吸光度，取其平均值。

氣相色譜分析④計算蛋白酶活力單位定義：1克酶粉，在40℃，pH7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白為酪氨酸的微克數(shù)。用下式計算：

式中：A——平行試驗管的平均吸光度；4——離心管中反應(yīng)液的總體積（毫升,mL）；10——反應(yīng)10分鐘；N——稀釋倍數(shù)；W——酶粉稱取量（克,g）。

氣相色譜分析⑤討論（a）對於同一臺分光光度計與同一批福林－酚試劑，其工作曲線K值可以沿用，當(dāng)另配時，工作曲線應(yīng)重做。（b）當(dāng)用不同產(chǎn)品的酪蛋白對同一蛋白酶測定時，其結(jié)果會有差異，故蛋白酶活力表示時應(yīng)注名所用酪蛋白的生產(chǎn)廠。（c）本方法為中性蛋白酶活力的測定方法。酸性蛋白酶活力的測定可將緩衝溶液改為乳酸—乳酸鈉緩衝溶液（取35mL乳酸，2mL乳酸鈉，用蒸餾水稀釋定容至1000mL，pH為2.3），鹼性蛋白酶活力的測定可將緩衝溶液改為硼砂—氫氧化鈉緩衝溶液（稱取12.367g硼酸（H3BO3），加100mL1mol/L氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000mL,即為0.1mol/L硼砂溶液。取49.9mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液,用0.1mol/L硼砂溶液稀釋至100mL，pH為11，即為硼砂—氫氧化鈉緩衝溶液）。

氣相色譜分析第三節(jié)紫外分光光度法

一、紫外分光光度計

1．紫外分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)及工作原理751-G型紫外分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)採用自準(zhǔn)式光路，其示意圖如圖5-4所示。751-G型紫外分光光度計在測定波長為320～1000nm內(nèi)用鎢絲燈做光源，波長為200～320nm內(nèi)用氫燈做光源。以石英棱鏡為單色器,以真空光電管作為光電轉(zhuǎn)換元件。

氣相色譜分析圖5-4751-G型紫外分光光度計的光學(xué)系統(tǒng)示意圖1—氫弧燈2—凹面反射鏡3—鎢絲燈4—平面鏡5—入射狹縫及石英窗6—球面準(zhǔn)直鏡7—石英棱鏡8—出射狹縫9—石英透鏡10—濾光片拉桿11—比色皿12—比色皿架拉桿13—暗電流控制閘門拉桿14—紫敏光電管15—紅敏光電管16—光電管調(diào)動架拉桿

氣相色譜分析工作原理:由光源1或3發(fā)出的連續(xù)輻射光線，射到凹面反光鏡2上聚光，再被反射到平面鏡4上，然後反射至入射狹縫5上，由此入射到單色器內(nèi)。而狹縫5正好位於球面準(zhǔn)直鏡6的焦面上因此，入射光線到達準(zhǔn)直鏡上反射後，就以一束平行光射向棱鏡7（該棱鏡背面是鍍鋁的）。光線經(jīng)棱鏡後，在其中色散，光線入射角處在最小的偏向角，入射光在鋁面上反射後並不是依原路反射回來，而是從棱鏡色散出來的光線經(jīng)準(zhǔn)直鏡反射後，會聚在出射狹縫8射出。為了消除雜散光對於測量結(jié)果的影響，在出射狹縫後裝有濾光片，光線通過濾光片後進入樣品室，根據(jù)波段需要，可以選用玻璃或石英比色皿。為了減少光線的反射程度，使光線能儘量集中照射到光電管上，在出射狹縫後裝有石英透鏡9，光線經(jīng)透鏡聚光後，照射到試樣比色皿上，透過光到光電管的陰極上產(chǎn)生相應(yīng)的光電流，經(jīng)放大後，測得相應(yīng)的吸光度。

氣相色譜分析2．紫外分光光度計的構(gòu)造紫外分光光度計主要有光源、單色器和檢測器構(gòu)成。

3．紫外分光光度計的操作方法下麵以751-G型紫外分光光度計的操作方法為例加以介紹。（1）接通電源，預(yù)熱10分鐘。（2）工作前，先將暗電流控制閘門拉桿置於關(guān)閉位置，以進行儀器的校正和保護光電管。（3）將選擇開關(guān)旋至“校正”位置。（4）轉(zhuǎn)動波長旋鈕將波長刻度調(diào)至需波長的位置上。（5）選定所需波長的光電管。同時根據(jù)相應(yīng)的波長來選擇光源燈。

氣相色譜分析（6）根據(jù)波長選擇比色皿。350nm以上可選用玻璃比色皿，350nm以下一定要選用石英比色皿。將裝好溶液的比色皿放入比色皿架內(nèi)，然後將蓋板蓋好。（7）調(diào)節(jié)暗電流旋鈕，使電錶指針到零，為了得到較高的準(zhǔn)確度，每測量一次，暗電流應(yīng)隨時校正一次。（8）調(diào)節(jié)靈敏度旋鈕，一般從左面停止位置按順時針方向轉(zhuǎn)動約三圈，此時度數(shù)盤轉(zhuǎn)動1％透光率，電錶指針可偏轉(zhuǎn)3小格。（9）拉動比色皿架拉桿，將空白溶液移入光路。（10）調(diào)節(jié)讀數(shù)電位器旋鈕，使透光度讀數(shù)指示在透光度100％處。（11）將選擇開關(guān)撥至“×1”檔。（12）拉開暗電流閘門，使單色光射入光電管。氣相色譜分析（13）調(diào)節(jié)狹縫旋鈕，大致使電錶的指針指零，然後再用靈敏度旋鈕作精細調(diào)節(jié)，使電錶的指針準(zhǔn)確地指在零位。

（14）移動比色皿架拉桿，使待測溶液移入光路。這時電錶的指針偏離零位。（15）旋轉(zhuǎn)讀數(shù)電位器旋鈕，重新使電錶的指針指在零位，此時從吸光度讀數(shù)盤上即能讀取吸光度。依次拉出一格試樣，旋動讀數(shù)電位器旋鈕，使電錶重新指零，可從吸光度讀數(shù)盤上讀得相應(yīng)得吸光度。注意：從讀數(shù)窗讀取待測溶液得透光度或吸光度值，當(dāng)選擇開關(guān)置於“×1”檔時，透光度範(fàn)圍時0～100％，相應(yīng)得吸光度範(fàn)圍是∞～0。可以直接讀數(shù)，不需換算。當(dāng)試液濃度過大，其透光度小於10％，吸光度大於1時，可把選擇開關(guān)置於“×0.1”檔，以獲得較準(zhǔn)確得讀數(shù)，此時所讀出得透光度值應(yīng)以10除之，或把讀出得吸光度值加上1.0。

氣相色譜分析（16）更換試樣或暫停測試時，必須將暗電流控制閘門拉桿關(guān)閉，以保護光電管。（17）測試幾個試樣時，可重複上述操作。但需經(jīng)常用空白溶液校準(zhǔn)透光率100％。（18）使用完畢後，將儀器復(fù)原。對於儀器的維修，應(yīng)注意的是：①

經(jīng)常更換儀器中的乾燥劑，發(fā)現(xiàn)變色應(yīng)及時取出烘乾後再用；②

儀器停止工作時，必須切斷電源，將選擇開關(guān)放在“關(guān)”，狹縫轉(zhuǎn)到0.01刻度，波長旋在625nm，透光率旋鈕放在100％；③

使用半年以上或搬動後，要進行波長精確性的檢查。

氣相色譜分析二、應(yīng)用實例

1.啤酒中雙乙醯含量的測定（比色法）基本原理鄰苯二胺與雙乙醯反應(yīng)如下：

反應(yīng)中生成的產(chǎn)物2，3-二甲基喹喔啉的鹽酸鹽在335nm處有一最大吸收值，可對連二酮進行定量測定。結(jié)果以雙乙醯含量表示。

氣相色譜分析②試劑與儀器

試劑（a）4mol/L鹽酸溶液量取50mL濃鹽酸，用重蒸水稀釋至150mL。（b）1%鄰苯二胺溶液準(zhǔn)確稱取分析純鄰苯二胺0.2500g溶解於4mol/L鹽酸溶液，並用4mol/L鹽酸溶液定容至25mL，搖勻。貯存於棕色瓶中，本試劑應(yīng)當(dāng)日配製。若配製出來的溶液呈紅色，應(yīng)重新更換新試劑。（c）消泡劑有機矽消泡劑或甘油聚醚。

儀器（a）紫外分光光度計（b）雙乙醯蒸餾裝置如圖5－5所示。

氣相色譜分析1－夾套蒸餾氣2－2000mL水蒸汽發(fā)生器3－冷凝器4－25mL量筒或容量瓶5－進樣口6－電爐7－排氣夾子

圖5－5雙乙醯蒸餾裝置

氣相色譜分析③測定步驟

（a）蒸餾按圖5－5把雙乙醯蒸餾裝置安裝好，把排氣夾子7打開，冷凝器下端浸沒在盛有2.5mL蒸餾水的25mL量筒的水中，量筒同時用冰水冷卻。加熱蒸汽發(fā)生器至沸，通汽加熱夾套蒸餾器，備用。向另取的100mL量筒中加入2～4滴消泡劑，再注入5℃左右未除氣啤酒100mL。待夾套蒸餾器下端開始冒大汽時，打開進樣口瓶塞，將啤酒迅速注入到蒸餾器內(nèi)，再用10mL蒸餾水沖洗量筒，洗液同時倒入蒸餾器內(nèi)，迅速蓋好進樣口塞子，用水封口。待下端再次冒大汽時，將排氣夾子夾住，開始蒸餾，接餾出液，直到餾出液接近25mL時，取下接受量筒，用少量蒸餾水沖洗冷凝管的下端，併入接受量筒，然後用蒸餾水定容至25mL，搖勻。氣相色譜分析（b）顯色混勻餾出液，分別吸取10mL餾出液於兩支比色管中。一管作為樣品管加入0.5mL1%鄰苯二胺溶液，另一管不加1%鄰苯二胺溶液作空白，充分搖勻後，同時置於暗處放置20～30min，然後於樣品管中加2mL4mol/L鹽酸溶液，於空白管中加2.5mL4mol/L鹽酸溶液，混勻。（c）測定在335nm波長處，用2cm比色皿以空白做對照，測定樣品的吸光度。④計算啤酒中雙乙醯的含量按下式計算：雙乙醯（mg/L）=A335×1.2式中：A335——用2cm比色皿測得的樣品的吸光度。1.2——換算係數(shù)。多次用純雙乙醯測得的經(jīng)驗數(shù)值。如果實驗中使用的是1cm比色皿，則換算係數(shù)應(yīng)為2.4。

氣相色譜分析⑤討論

（a）蒸餾時，加入試樣要迅速，勿使測定成分損失，而且應(yīng)儘快蒸餾，最好在5min內(nèi)完成。（b）蒸餾時，應(yīng)嚴(yán)格控制蒸汽量，勿使泡沫過多而被蒸汽帶出而導(dǎo)致蒸餾失敗。如果蒸餾器過小或消泡劑效果較差時，可分兩次蒸餾，餾出液接受在同一量筒即可。（c）顯色反應(yīng)應(yīng)在暗處進行，否則結(jié)果將偏高。

氣相色譜分析2．單核苷酸的測定①基本原理由於單核苷酸分子中的堿基——嘌呤堿和嘧啶堿中都具有共軛雙鍵，因此核苷酸對紫外光有強烈的吸收性能，其最大吸收波長在260nm附近，在230nm處有一個低谷。而各種單核苷酸都有特定的紫外吸收的吸光度，因此，可用紫外分光光度分析法測定。測定時可採用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，也可採用摩爾吸光係數(shù)法直接推算。幾種但核苷酸的摩爾吸光係數(shù)列表如下。

以AMP粗製品中AMP的含量測定為例。此法也適用於其他單核苷酸含量的測定。

氣相色譜分析

單核苷酸摩爾吸光係數(shù)（ε260）式量pH=2.0pH=7.0氫型鈉型腺嘌呤核苷5’-單磷酸（AMP）14.2×10315.0×103374.22391.22鳥嘌呤核苷5’-單磷酸（GMP）11.8×10311.4×103363.24407.24胞嘧啶核苷5’-單磷酸（CMP）6.2×1037.4×103323.31367.31尿嘧啶核苷5’-單磷酸（UMP）10.0×10310.0×103324.18368.18幾種單核苷酸的摩爾吸光係數(shù)列表如下：

氣相色譜分析

②試劑與儀器

試劑0.01mol/L鹽酸溶液取0.84mL濃鹽酸，用蒸餾水稀釋至1000mL。儀器紫外分光光度計

③測定步驟準(zhǔn)確稱取AMP粗制樣品25mL，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解並定容至100mL，搖勻。吸取5mL，再用0.01mol/L鹽酸溶液稀釋並定容至100mL，以0.01mol/L鹽酸溶液為空白，在260nm波長下測定其吸光度。④計算核苷酸的含量用下式進行計算：核苷酸的含量（mg/100mg）=A260×（M/ε260）×稀釋倍數(shù)×100式中：M——單核苷酸的式量；ε260——260波長下單核苷酸的摩爾吸光係數(shù)；A260——測定時260波長下的吸光度。⑤討論本方法適宜於被測定液中單核苷酸含量在0.01～0.02mg/mL。氣相色譜分析第四節(jié)其他分光光度法簡介

一、紅外分光光度法的基本原理波長在0.75～1000μm間的電磁波稱為紅外線，這個光譜區(qū)間稱為紅外光區(qū)。用具有連續(xù)紅外線光譜的光源照射一物質(zhì)時，該物質(zhì)就要吸收一部分光能，使分子的振動能級和轉(zhuǎn)動能級發(fā)生變化。當(dāng)振動能級和轉(zhuǎn)動能級的躍遷使得分子的偶極距發(fā)生了變化而得到的分子的振動-轉(zhuǎn)動光譜就稱為紅外吸收光譜。通常將紅外光區(qū)按波長分為三個區(qū)域，即近紅外區(qū)、中紅外區(qū)和遠紅外區(qū)。它們的波長範(fàn)圍和使用的對象見下表：

氣相色譜分析紅外吸收光譜與紫外吸收光譜一樣，都是帶狀光譜，也稱吸收峰。理論依據(jù)是光吸收定律。紅外分光光度計自動記錄的紅外光譜圖是以波長（λ）或波數(shù)（υ）（波長和波數(shù)互為倒數(shù)關(guān)係）為橫坐標(biāo)，以樣品的吸光度A或透光度T為縱坐標(biāo)繪製而成的。圖5-6是2-甲基丁醛的紅外譜圖。

區(qū)域名稱波長（μm）波數(shù)（cm-1）使用對象近紅外區(qū)0.75～2.513300～4000各種官能團如-OH、-NH2等的定量分析中紅外區(qū)2.5～15.44000～600物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成的定性分析遠紅外區(qū)15.4～830650～12金屬有機物的金屬有機鍵的分析氣相色譜分析圖5-62-甲基丁醛的紅外譜圖

氣相色譜分析二、紅外分光光度計1．基本結(jié)構(gòu)和工作原理

光柵紅外分光光度計光路圖如圖5-7所示。

圖5-7光柵型雙光束紅外分光光度計光路圖S—光源；M—反射鏡；C—切光器；G—光柵；F—濾光旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)器；A1—減光器；S1—入口狹縫；S2—出口狹縫；TC—檢測器

氣相色譜分析2．主要部件紅外分光光度計的主要部件有光源、吸收池、單色器和檢測器及記錄裝置五部分組成。三、紅外分光光度法的應(yīng)用

1.定性分析

利用紅外吸收光譜對化合物進行定性分析的過程，稱為圖譜解析。（1）幾個基本術(shù)語①伸縮振動和彎曲振動（又稱變形振動）

②基頻峰和泛頻峰

③特徵峰和相關(guān)峰

氣相色譜分析（2）制樣方法（常用的固體樣品的制樣方法）①壓片法一般將固體試樣1～3mg放在瑪瑙研缽中，加入乾燥的光譜純KBr100～300mg混合研磨均勻（在紅外燈下進行），使其粒度在2.5μm以下，裝入壓片模具內(nèi)，在壓片機上加壓，至壓力為100kg並維持10min左右，卸掉壓力則得一厚度約為1mm左右的透明的樣品片，進行測定即可。②糊劑法一般取5mg左右的試樣放在瑪瑙研缽中，滴上一滴石蠟油混合，充分研勻（其粒度在2.5μm以下）成糊膏狀。將此糊膏夾於可拆卸池的兩塊窗片之間（或夾於兩塊片中），放入光路即可測定。氣相色譜分析糊劑法常用的液體有液體石蠟、六氯丁二烯等，液體石蠟適用於1300～400cm-1（其他波段本身有吸收），六氯丁二烯適用於4000～1300cm-1，兩者配合才能完成全波段的測定，否則應(yīng)扣除它們的吸收。③薄膜法將試樣溶於低沸點溶劑中，然後取其溶液塗於透明窗片（或KBr片）上，待溶劑揮發(fā)後，樣品遺留在窗片上而成為薄膜。待溶劑揮發(fā)乾淨(jìng)後即可測定。

氣相色譜分析2．定量分析紅外定量分析是研究樣品的量與吸收入射光之間的關(guān)係。對於結(jié)構(gòu)一定的分子，在一定的濃度範(fàn)圍內(nèi)，該化合物的特徵吸收譜帶的強度是濃度的函數(shù)，也符合光吸收定律。紅外光譜圖中吸收帶很多，因此定量分析時特徵吸收譜帶的選擇尤為重要，除應(yīng)考慮摩爾吸光係數(shù)ε較大之外，還應(yīng)注意以下幾點：①譜帶的峰形應(yīng)具有較好的對稱性；②沒有其他組分在所選擇特徵譜帶區(qū)產(chǎn)生干擾；氣相色譜分析③溶劑或介質(zhì)在所選擇特徵譜帶區(qū)域應(yīng)無吸收或基本上無吸收；④所選溶劑不應(yīng)在濃度變化時對所選擇特徵譜帶的峰形產(chǎn)生影響；⑤特徵譜帶不應(yīng)在二氧化碳、水蒸汽有強吸收的區(qū)域。定量分析的方法很多，根據(jù)被測定物質(zhì)的情況和定量分析的要求可採用直接計算法、工作曲線法、內(nèi)標(biāo)法等。

生物工業(yè)分析

高效液相色譜分析

第一節(jié)基本原理

第二節(jié)液相色譜操作

第三節(jié)應(yīng)用實例

高效液相色譜分析第一節(jié)基本原理一、液相色譜過程

1．流程圖高效液相色譜的流程如圖8-1所示。高壓泵輸送流動相和試樣組分高速流過色譜分離柱時，具有不同分配係數(shù)的組分在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡時被分離，通過檢測器時被檢測並給出信號。高效液相色譜分析高壓輸液泵

高壓泵是高效液相色譜的動力源，用來使液體流動相高速通過色譜分離柱以達到快速分析的目的。在高效液相色譜中，通常使用往復(fù)式柱塞泵，結(jié)構(gòu)如圖8－2所示。高效液相色譜分析梯度淋洗裝置梯度淋洗就是流動相中含有兩種或多種不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程式連續(xù)改變流動相中溶劑的配比和極性，使被分離組分在兩相中的分配係數(shù)改變，達到提高分離效果，調(diào)節(jié)出峰時間的目的。兩種方式來實現(xiàn)：外梯度（也稱低壓梯度）和內(nèi)梯度（也稱高壓梯度），外梯度是在常壓下，按一定程式將溶劑混合後再通過高壓泵輸入色譜柱；內(nèi)梯度是利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合後進入色譜柱。

進樣裝置

高效液相色譜是在很高的壓力狀態(tài)下工作的，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖8－3所示。

高效液相色譜分析高效分離柱

高效液相色譜的分離柱具有很高的柱效，理論塔板數(shù)達每米3萬。柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑l～6nm，柱長5～40cm。液相色譜柱的發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效，因此柱較短。

高效液相色譜分析高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器最小檢測量可達10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用於梯度洗脫。其原理是基於試樣中各組分對特定波長的紫外光有選擇性吸收，組分濃度與吸光度之間服從朗伯-比耳定律，因此要求在測定波長處，流動相應(yīng)無明顯的吸收，而被測組分應(yīng)有較大的吸光係數(shù)。紫外光度檢測器有固定波長和可變波長兩種，前者的測定波長固定（254nm或280nm），適用於芳烴化合物的檢測。後者可根據(jù)試樣選擇測定波長，方便靈活適用面廣。紫外光度檢測器的光路圖如圖8-4所示。

高效液相色譜分析光電二極體陣列檢測器，由211個（或更多）二極體組成陣列，各檢測特定波長，將吸收後透過的紫外光束分光投射到二極體陣列上，用電腦快速處理，可獲更多資訊及顯示吸光度、波長、時間三維立體譜圖，如圖8-5所示。

高效液相色譜分析差示折光檢測器差示折光檢測器的最低檢測量達10-7g·mL-1，對溫度變化敏感，不能用於梯度洗脫。其原理是基於含有被測組分的流動相和純流動相的溶液折射率之差與被測組分在流動相中的濃度有關(guān)，可根據(jù)流動相折射率的變化，測定試樣組份含量。高效液相色譜法還可利用其高效分離的特點，將柱後流出組分分別收集，蒸去流動相，獲得難於通過一般方法製備的高純度樣品（色譜純）。

液相色譜製造技術(shù)要求高，儀器價格、操作、維護費用也相對較高，故遠沒有氣相色譜的普及程度高。

高效液相色譜分析2．高效液相色譜法的主要分離類型（1）吸附色譜（液--固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。分離原理是組分在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的吸附與解吸分配平衡。（2）分配色譜（液--液分配色譜）：早期通過在擔(dān)體上徐漬一薄層固定液製備固定相，與流動相一起構(gòu)成液液兩相，各組分在兩相間分配係數(shù)的不同，經(jīng)反復(fù)多次分配平衡而實現(xiàn)分離。現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。通常反應(yīng)發(fā)生在矽膠表面的≡Si－OH基團上，形成矽氧碳鍵型（≡Si-O-C），矽氧矽碳型（≡Si-OSi-C），矽碳型（≡Si-C）,矽氮型（≡Si-N）四種類型。高效液相色譜分析（3）離子交換色譜：固定相為離子交換樹脂（H+或OH-），流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子因它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。（4）凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為固定相。凝膠色譜法又稱凝膠滲透法、凝膠過濾法。當(dāng)試樣隨流動相進入分離柱時，試樣中的小分子擴散、滲透到孔穴內(nèi)部，而大分子則被排阻在孔穴之外，不同大小的分子，可通過的孔穴大小、數(shù)目不同，走過的路徑和需要的時間不同，被排阻的大分子首先被流動相帶出，其他不同大小的分子依次流出。高效液相色譜分析二、色譜流出曲線試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離後，隨流動相依次流出色譜拄，經(jīng)檢測器轉(zhuǎn)換為電訊號，然後用記錄儀將各組分的濃度變化記錄下來，即得色譜圖。色譜圖是以組分的濃度變化作為縱坐標(biāo)，流出時間作橫坐標(biāo)的，這種曲線稱為色譜流出曲線。三、色譜中有關(guān)術(shù)語

高效液相色譜法的基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配係數(shù)、分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的，但有其不同之處。液相色譜法的流動相為液體，氣相色譜法的流動相為氣體。液體的擴散係數(shù)只有氣體的萬分之一至十萬分之一、液體的粘度比氣體大一百倍，而密度為氣體的一千倍左右（見表8-1）。高效液相色譜分析參數(shù)氣體液體擴散係數(shù)Dm/cm2·s-110-110-5密度ρ/g·cm-110-31粘度η/g·（cm·s）-110-410-2表8-1影響峰擴散的主要物理性質(zhì)

高效液相色譜分析第二節(jié)液相色譜操作一、操作條件的選擇

在高效液相色譜中，液體流動相的分子量要比氣相色譜中的氣體流動相的分子量大得多，由於被測組分在流動相中的擴散係數(shù)Dm與流動相的分子量成反比，因此速率方程中的分子擴散項B／u較小，可以忽略不計，故只有兩項，即

H＝A＋C·u液相色譜與氣相色譜兩者的H-u曲線的形狀不同，如圖8-6所示。

高效液相色譜分析（1）流速：在液相色譜中，被測組分分子在流動相中的擴散係數(shù)比氣相中小4～5個數(shù)量級，當(dāng)流速大於0.5cm·s－l時，H-u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流速仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要的可選擇參數(shù)。（2）固定相及分離柱：氣相色譜中的固定液原則上都可以用於液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。高效液相色譜分析（3）流動相及流動相的極性：液相色譜流動相的作用除與氣相色譜中載氣的作用相同之外，還具有調(diào)節(jié)組分與固定相之間作用力大小的能力，也即溶劑效應(yīng)。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。在液液色譜中，為了避免固定液的流失，一般來說，對於親水性固定液常採用疏水性流動相，即流動相的極性小於固定相的極性，這種情況稱為正相液液色譜法，極性柱也稱為正相柱。反之，若流動相的極性大於固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱，這是由於後者的出峰順序與前者相反。對於目前常用的化學(xué)鍵合固定相來說，固定液的流失大大減小，流動相的選擇範(fàn)圍則要大得多。流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式分，有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑的極性（由小到大）順序如下：庚烷、己烷、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丁酮、四氫呋喃、二氧六環(huán)、丙酮、丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、甲酸胺、水。高效液相色譜分析採用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。選擇流動相時應(yīng)注意下列幾個問題：（1）儘量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器雜訊增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁吸附劑固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉澱並在柱中沉積。

（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。

高效液相色譜分析二、操作步驟與色譜的定性、定量分析操作步驟首先是進行分析中所用各種標(biāo)準(zhǔn)液、試樣液、混合液等的配製及流動相的配製；二進行色譜系統(tǒng)的選擇及有關(guān)參數(shù)的確定；三進行進樣分析測定；最後是計算並出具報告。色譜的定性、定量分析高效液相色譜法的基本概念及理論基礎(chǔ)，如保留值、分配係數(shù)、分配比、分離度、塔板理論、速率理論等與氣相色譜法是一致的，雖有其不同之處即液相色譜法與氣相色譜法的主要區(qū)別可歸結(jié)於流動相的不同，但其常用的定性、定量分析方法與氣相色譜法相同。

高效液相色譜分析第三節(jié)應(yīng)用實例一、青黴素含量測定（l）0.05mol/L磷酸鹽緩衝液（pH6）的配製在水900ml中溶解磷酸二氫鉀6.8g，用lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值為6.00，用水稀釋至1000ml，混勻。（2）流動相的配製將認0.05mol/L磷酸鹽緩衝液（pH6）和乙腈按4:1混合，濾過。（3）標(biāo)準(zhǔn)液的配製精密稱取青黴素鉀標(biāo)準(zhǔn)品（USPPenicillinGpotassiumRS）約80mg，置100ml量瓶中，用流動相溶解並稀釋至刻度。高效液相色譜分析（4）供試液的配製按標(biāo)準(zhǔn)液同法配製（如果供試品的溶液配製欄目中沒有另加說明）。（5）混合液的配製用流動相配制濃度約為lmg／ml的青黴素V鉀溶液，與標(biāo)準(zhǔn)液等體積混合。

（6）色譜系統(tǒng)配有225nm波長紫外檢測器的液相色譜儀；色譜柱為4mm×30cm；填料為PackingL1（C18矽烷鍵合矽膠10μm）；流速為2ml/min。分別進樣混合液和標(biāo)準(zhǔn)液約10μl，適當(dāng)調(diào)節(jié)實驗參數(shù)，使得青黴素和青黴素V鉀色譜峰的柱效均不小於600理論塔板數(shù)，兩峰間的解析度不低幹2.0，標(biāo)準(zhǔn)液重複進樣的相對標(biāo)準(zhǔn)差不大於1.0％。

高效液相色譜分析（7）測定分別進樣等體積（約10μl）的標(biāo)準(zhǔn)液、供試液和混合液，記錄相應(yīng)的色譜圖，測量主要峰的回應(yīng)。青黴素和青黴素V鉀的相對保留時間分別是0.7和1.0。按下式計算供試品中青黴素（C16H18N2O4S）的百分含量Pu：

式中：Gs

標(biāo)準(zhǔn)品中青黴素的百分含量；

Ws

為配製標(biāo)準(zhǔn)液所用標(biāo)準(zhǔn)品的重量（mg）；Wu

為配製供試液所用供試品的重量（mg）；rs為標(biāo)準(zhǔn)液的色譜回應(yīng)；

ru為供試液的色譜回應(yīng)。

高效液相色譜分析抗生素名稱色譜柱和填料流動相流速（ml/min檢測器標(biāo)準(zhǔn)品及其濃度供試品濃度進樣量（μl）備注Amdinocillin4.6mm×25cm,PackingL1·（5μm）pH5.0緩衝液（a）-乙腈（85:15）1UV220nmAmdinocillin0.1mg/ml（溶劑:水）0.1mg/ml（溶劑:水）20USP（XXⅡ）外標(biāo)校正法氨芐青黴素Ampicillin4m×30cm,PackingL1（5-10μm）水-乙腈-lmol/L磷酸二氫鉀-lmol/L醋酸（909:80:10:1）2UV254nm氨芐青黴素1mg/ml（溶液:（b））1mg/ml（溶劑:水（b））20USP（XXⅡ）外標(biāo)校正法氨芐青黴素鈉AmpicillinSodium4mm×30cmPackingL1（5-10μm）

2UV254nm氨芐青黴素1mg/ml（溶液:（b））1mg/ml（溶劑:水（b））20USP（XXⅡ）外標(biāo)校正法鄰氯青黴素鈉CloxacillinSodium4.6mm×25cm,PackingL1（5-10μm）PH5緩衝液（c）-乙腈（75:25）1UV2250nm鄰氯青黴素鈉1.1mg/ml（溶液:（c））1.1mg/ml（溶劑:水（c））10USP（XXⅡ）外標(biāo)校正法表8-2β-內(nèi)醯胺類抗生素的高效液相色譜法測定

高效液相色譜分析抗生素名稱色譜柱和填料流動相流速（ml/min檢測器標(biāo)準(zhǔn)品及其濃度供試品濃度進樣量（μl）備注普魯卡因青黴素PenicillinGProcaine4mm×30cm,PackingL1（10μm）PH7緩衝液（d）-乙腈-水（500:250:2501）,用lmol/L氫氧化鉀或10%磷酸調(diào)節(jié)PH值為7.5±0.051UV235nm青黴素鉀0.8mg/ml鹽酸普魯卡因0.54mg/ml（溶劑:流動相）1.4mg/ml（溶劑:流動相）10USP（XXⅡ）外標(biāo)校正法青黴素VPenicillinV4mm×3cm,PackingL1（5-10μm）水-乙腈-冰醋酸（650:350:5.75）1