環(huán)狀RNA hsa-circ-0000400在原發(fā)性結(jié)腸癌中的表達水平及其臨床診斷意義

環(huán)狀RNAhsa_circ_0000400在原發(fā)性結(jié)腸癌中的表達水平及其臨床診斷意義摘要：目的：探討結(jié)腸癌患者血清中環(huán)狀RNAhsa_circ_0000400的表達水平及臨床診斷意義，以及hsa_circ_0000400作為結(jié)腸癌診斷生物標志物的可行性。方法：培養(yǎng)結(jié)腸癌標準細胞株SW480,LOVO與正常人結(jié)腸粘膜上皮細胞株HCoEpiC，對常熟市第二人民醫(yī)院收治的56份結(jié)腸癌患者腫瘤組織與相應癌旁組織，78份結(jié)腸癌患者血清與同期健康體檢者血清進行分析。采用實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術(shù)檢測結(jié)腸癌標準細胞株SW480,LOVO與正常人結(jié)腸粘膜上皮細胞株HCoEpiC，結(jié)腸癌腫瘤組織及相應癌旁組織，及結(jié)腸癌患者與健康人血清hsa_circ_0000400相對表達水平，結(jié)合患者相關(guān)臨床病理特征綜合分析，如患者年齡、性別、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象等。用受試者工作特征曲線（ROC）評價hsa_circ_0000400對于結(jié)腸癌的診斷效能。成果：結(jié)腸癌標準細胞株LOVO，SW480中的hsa_circ_0000400相對表達量明顯高于人正常結(jié)腸上皮細胞株HCoEpiC，P值<0.05即意味著差異具有統(tǒng)計層面的意義。結(jié)腸癌患者腫瘤組織中hsa_circ_0000400的相對表達量升高，明顯高于對應的癌旁組織（P值<0.05）。關(guān)于血清中hsa_circ_0000400的相對表達量，健康人分明要低于結(jié)腸癌患者（P<0.05）。hsa_circ_0000400表達與腫瘤TNM分期，分化程度及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移與否均有關(guān)（均P<0.05），均無關(guān)（均P>0.05）的是與患者的性別特征、年歲、腫瘤原發(fā)部位與大小等。單獨使用hsa_circ_0000400作為診斷標志物時，0.888為ROC曲線下面積，臨界值為4.185，敏感性與特異性分別為0.833、0.808。診斷標志物處于hsa_circ_0000400與CA19-9聯(lián)合狀態(tài)時，ROC曲線下面積由0.888擴大為0.945，敏感性與特異性分別為0.833、0.974。結(jié)論：hsa_circ_0000400可被作為一種新的結(jié)腸癌診斷生物學標志物，將其聯(lián)合CA19-9一起進行檢測，可進一步提升hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌診斷中的作用。結(jié)腸癌（colorectalcancer,CRC）相對比較常見，為消化道惡性腫瘤，多發(fā)在乙狀結(jié)腸與直腸交織位置，其發(fā)病率與死亡率仍處于逐年攀升狀態(tài)。盡管結(jié)腸癌的臨床診療技術(shù)取得了重大進展,但由于其早期癥狀不明顯，依靠臨床癥狀診斷并不能在第一時間發(fā)現(xiàn)腫瘤。而尋常的診斷方法如CT,MRI，X線，CEA,CA19-9等特異性較差，不能第一時間判斷結(jié)腸癌的相關(guān)情況，因此有必要尋找一種新的生物學標志物，探索影響結(jié)腸癌進展的機制。環(huán)狀RNA作為內(nèi)源性非編碼RNA，它具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，無5’端帽子和3’端poly(A)尾。circRNA極其穩(wěn)定，能夠經(jīng)受住RNA酶的降解，是因其通過共價鍵形成的閉合環(huán)狀構(gòu)造。另外，在各異的物種中，circRNA具有非常高的保守性，其大量存在細胞質(zhì)中，且在血液、唾液、外泌體中也能檢測到豐富的circRNA，近年來越來越多的研究證實,circRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),并發(fā)揮著重要作用。circRNA能夠作為相對理想地診斷疾病的生物標志物，主要是因為這種特性。本研究參考了目前已發(fā)表的circRNA，并結(jié)合circRNA數(shù)庫circBase，選定了與結(jié)直腸癌相關(guān)的一種circRNA分子，即hsa_circ_0000400。旨在研究結(jié)腸癌組織、標準結(jié)腸癌腫瘤細胞株以及結(jié)腸癌病人血清中的表達情況與其對照組的表達差異，并驗證其作用機制，探討其成為新的結(jié)腸癌診斷生物學標志物的可行性。1.材料與方法1.1臨床標本1.1.1組織標本：數(shù)據(jù)搜集時間為2016年1月至2019年12月；來源于常熟市第二人民醫(yī)院普外科；對象為該科收治的56例結(jié)腸癌患者，其中所有患者還具有沒有經(jīng)過化療、放療或靶向藥物治療的特征。對于標本采取的原則則是對每一例不僅取癌組織，還采取癌旁的正常組織（距離癌組織3厘米），組織標本取出后用TRIzol浸泡后立即放入-80℃冰箱保存?；颊卟±砬衅?jīng)常熟市第二人民醫(yī)院病理科專家診斷為結(jié)腸癌，有完整的臨床病理記錄。56例病例中，男31例，女25例；年齡小于60歲21例，大于等于60歲35例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期42例；高、中分化41例，低分化15例。在采取研究的所有患者標本前，均已簽署患者知情同意書。1.1.2血液標本：采取時間為2018年1月至2020年10月；來源單位是常熟市第二人民醫(yī)院普外科；標本對象為該科收治的結(jié)腸癌患者；一共78例，其中男女比例分別為42與36例，年齡上小于60歲的32例，大于等于60歲46例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期53例；高、中分化52例，低分化26例。操作標準是于手術(shù)前天早晨采血，容量為5ml，前提條件是采樣對象一律沒經(jīng)過任何治療。對照組標本隨機選取自2020年9月在常熟市古里中心衛(wèi)生院參加健康體檢的人群。血液樣本的儲存與提取方法則是在肝素抗凝管中采用TRIzol法提取血樣中總RNA。1.2細胞株及細胞培養(yǎng)胞株來源是于浙江如耀生物科技有限公司采購，包括人正常結(jié)腸上皮細胞株HCoEpiC、結(jié)腸癌SW480與LOVO標準細胞株。細胞的常規(guī)培養(yǎng)則是在RPMI1640（含10%胎牛血清）培養(yǎng)基中。1.3主要試劑儀器通過采購獲取主要試劑儀器，上海新貝生物科技有限公司：hsa_circ_0000400和Human/Mouse18S；南京諾唯贊生物科技股份有限公司：HiScriptIIReverseTranscriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenPCR試劑盒；美國Thermo公司：Trizol試劑、NanoDrop1000分光光度計；美國ABI公司：7500熒光定量PCR儀；CL-6000i全自動化學發(fā)光免疫分析儀購自深圳邁瑞公司。1.4RNA提取和QPCR對于樣本的總RNA，經(jīng)Trizol法提煉測定，其純度與濃度以NanoDrop1000分光光度計測定，RNA標本標準為260nm/280nm處吸光度值為1.8～2.0，用HiScriptIIReverseTranscriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應體系為20μL，反應條件：42℃3min，60℃15min，85℃5min。以cDNA為模板，SYBRGreenPCR試劑盒檢測表達水平。反應體系為10μL，反應條件：95℃預變性5min，95℃10S，60℃30S，共40個循環(huán)。以Human/Mouse18S為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示相對表達量。hsa_circ_0000400F：ACTTACCTCGACTCTTAGCTTGTCG，R：GGTCTTGTCACTTGGCATCTGG，Human/Mouse18SF：GAACGAGACTCTGGCATGCTA，R：CACGCTGAGCCAGTCAGTGTA1.6血清CA19-9檢測血清CA19-9的檢測需要采用邁瑞CL-6000i全自動化學發(fā)光免疫分析儀及配套試劑。1.7統(tǒng)計學分析利用統(tǒng)計軟件分析研究，此處選用SPSS23.0。對于全部采集數(shù)據(jù)都使用均數(shù)±標準差的標識，組與組之間的比較通過t檢驗實現(xiàn)。采用受試者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲線評價hsa_circ_0000400的診斷效能。P值＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌標準細胞株SW480,LOVO及人正常結(jié)腸上皮細胞株HCoEpiC中的表達比較經(jīng)過QPCR檢測，結(jié)果表明（圖1），在結(jié)腸癌標準細胞株SW480，LOVO，以及人正常結(jié)腸上皮細胞株HCoEpiC中，hsa_circ_0000400的相對表達量分別為315.52±23.53,95.04±12.06和0.81±0.25，在關(guān)于結(jié)腸癌標準細胞株中hsa_circ_0000400表達高于人正常結(jié)腸上皮細胞株（P＜0.05）。2.2hsa_circ_0000400于結(jié)腸癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達比較經(jīng)過QPCR檢測，結(jié)果表明（圖2），在56例結(jié)腸癌患者的腫瘤組織以及癌旁正常組織中的hsa_circ_0000400相對表達量分別為10.19±4.00和4.42±1.66，hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌腫瘤組織中的表達高于癌旁正常組織（P＜0.05）。2.3hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌患者血清及健康人血清中的表達比較QPCR檢測結(jié)果顯示（圖3），分別對比兩種血清中hsa_circ_0000400的相對表達水平，即結(jié)腸癌患者血清及健康人血清，分別為7.34±3.40和2.62±1.09。hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌患者血清中的表達高于健康人（P<0.05）。圖1hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌標準細胞株SW480,LOVO及人正常結(jié)腸上皮細胞株HCoEpiC中的表達情況圖2hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌患者腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達情況圖3hsa_circ_0000400在結(jié)腸癌患者血清及健康人血清中的表達情況2.4結(jié)腸癌患者腫瘤組織中hsa_circ_0000400水平與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)腸癌患者腫瘤組織中hsa_circ_0000400表達水平與TNM分期，分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P<0.05），而與患者性別特征、年歲、原發(fā)部位、腫瘤大小等均無關(guān)（均P>0.05），見表1。2.5結(jié)腸癌患者血清hsa_circ_0000400水平與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)腸癌患者血清hsa_circ_0000400表達水平與TNM分期，分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P<0.05），而與患者性別特征、年歲、原發(fā)部位、腫瘤大小等均無關(guān)（均P>0.05），見表2。表1：56例結(jié)腸癌患者組織hsa_circ_0000400水平與臨床病理特征的關(guān)系(x±S)表2：78例結(jié)腸癌患者血清hsa_circ_0000400水平與臨床病理特征的關(guān)系(x±S)2.5血清hsa_circ_0000400的相對表達量對結(jié)腸癌的診斷效能ROC曲線分析，單獨使用hsa_circ_0000400作為結(jié)腸癌患者和健康人的診斷指標時，4.185為臨界值，0.888的曲線下面積（areaundercurve,AUC），敏感性與特異性分別為0.833，0.808。若聯(lián)合CA19-9聯(lián)合診斷，ROC曲線下面積增加至0.945，敏感性0.833，特異性0.974。見圖4圖4hsa_circ_0000400的ROC曲線以及hsa_circ_0000400聯(lián)合CA19-9的ROC曲線3討論雖然近年來關(guān)于結(jié)腸癌的臨床治療有了長足進步，但是其發(fā)病率仍年復一年攀升。但由于其初期癥狀不明顯，且現(xiàn)有常規(guī)檢測方法敏感度較低，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已有轉(zhuǎn)移。于此，尋找一種新型生物學標志物，提高結(jié)腸癌的初期診斷率，是當前結(jié)腸癌研究中迫切需要解決的重大問題。circRNA是一種新型的RNA分子，表現(xiàn)為首尾相連的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其主要經(jīng)反式剪接使5’端帽子和3’端poly(A)尾通過共價鍵形成。circRNA構(gòu)成十分穩(wěn)定，并且大量存在于細胞質(zhì)中，且在血液、唾液、外泌體中也能被檢測到。目前認為circRNA主要作為“miRNA海綿”，其主要經(jīng)過競爭性結(jié)合miRNA，從而能夠參與到腫瘤出現(xiàn)演變進程。已有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA與癌癥的產(chǎn)生，發(fā)展、轉(zhuǎn)移等緊密相關(guān)，在癌癥中異常表達。LiBo等研究發(fā)現(xiàn)，circRNABCRC4通過調(diào)節(jié)microRNA-101從而抑制ECH2在RNA和蛋白水平上的表達，能夠啟發(fā)膀胱癌的鑒定與治療，為其提供一條新思維路徑。ChiHinWong等研究發(fā)現(xiàn)，circFOXK2在胰腺導管腺癌患者中明顯上調(diào)，通過與YBX1和hnRNPK復合可以促進胰腺導管腺癌的發(fā)展。Zheng等研究表明在三陰性乳腺癌組織中circSEPT9表達增高，且與臨床進展及不良預后呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，通過實時熒光定量PCR法檢測結(jié)腸癌組織、結(jié)腸癌標準細胞株以及結(jié)腸癌患者血液hsa_circ_0000400相對表達量均明顯高于其對照組，結(jié)果有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示hsa_circ_0000400可能作為促癌基因發(fā)揮作用，表現(xiàn)為對于結(jié)腸癌的產(chǎn)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移起到促進作用，且與患者TNM分期、腫瘤分化程度、以及淋巴是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者的性別特征、年歲與腫瘤部位等無關(guān)。所以，檢測患者血液hsa_circ_0000400表達量有望成為結(jié)腸癌診斷和預后評估的新型生物學標志物?，F(xiàn)如今，CA19-9已被用于臨床結(jié)腸癌的診斷，但是長鏈非編碼RNA與其相比更具優(yōu)勢，在以往的一系列研究中，LiNA研究發(fā)現(xiàn)，CircTNL1XR1調(diào)節(jié)控制結(jié)腸癌發(fā)展的路徑是靶向調(diào)控miR-424/Smad7通路。胡洪林等研究發(fā)現(xiàn)，LncRNARP5-1185K9.17高表達的患者的總生存時間及中位生存時間均較低表達者明顯縮短，影響結(jié)腸癌患者預后不佳的因素是LncRNARP5-1185K9.17。陳澄亮等研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌患者組織中緊密相關(guān)聯(lián)的是高表達量的circ_001947和ADAM19mRNA與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期。為了提高結(jié)腸癌在早